鲤鱼生长激素基因在鲫鱼中的基因转移及PCR检测

鲫鱼群体内,个体之间的生长速度差别不大,遗传保守性较强,用常规育种方法很难获得生长速度快、个体差异较大的后代。通过基因转移技术,将外源基因如鱼的生长激素基因导入鱼的受精卵中,而获得转基因鱼是鱼类定向育种的一条有效途径。已有报道,在虹蹲鱼生长激素ｃＤＮＡ上游连结一个病毒启动子构建成表达质粒,由此获得的转基因鲤鱼比对照生长速度快２０％。但是未见有将鲤鱼生长激素基因导入鲫鱼受精卵的报导。我们克隆了鲤鱼生长激素基因,并用它构建了含有病毒启动子（Ｆｉｇ．１,插入片段为０．８Ｋｂ,位于ＸｂａＩ和ＰｓｔＩ之间）的表达质粒（Ｆｉｇ．２,命名为ｐＣＭＶ－ＴＫ－ＣＧＨ）。用该质粒对鲫鱼受精卵进行注射,共注射了１０００粒卵,获得了转基因实验鲫鱼４８０尾,孵化率为４８％。将其中１００尾幼鱼于水簇箱中进行放养。选择其中个体较大的５０尾进行ＰＣＲ（检测。其中８条鱼的基因组ＤＮＡ有０．６Ｋｂ的ＰＣＲ扩增产物（Ｆｉｇ．３）,表明其上整合有外源的鲤鱼生长激素基因,其整合率为１６％。其中最大的一条体重４．２ｇ,体长６ｃｍ,比对照（０．７ｇ,４ｃｍ）体重增加５倍,体长增加２ｃｍ（Ｆｉｇ．４）。我们构建的是高效表达质粒,其上含有巨细胞病毒增强子和     

全鱼基因的构建及其在鲫鱼体内的整合与转录

利用PCR技术删除大麻哈鱼生长激素基因的启动序列,通过基因重组构建出全鱼基因（鲤鱼MT启动子－大麻哈鱼生长激素基因）;以融合全鱼基因为外源基因,通过显微注射方法将其线性片段导入鲫鱼受精卵内,研究其整合与转录效率。结果表明,全鱼基因在鲫鱼基因组中的整合率为36．4％（16／44）,对转基因阳性鱼的RNA样本进行Northern印迹杂交检测,转录率为25％（1／4）。因此,该全鱼基因可以作为转基因鱼研究和应用的外源基因。     

人生长激素和转移的人生长激素基因对去垂体鱼的生长代偿效应

通过显微注射技术,将小鼠重金属螯合蛋白(MT-1)基因启动顺序与人生长激素基因顺序的重组体pMThGH注入鲤鱼(Cyprinus carpio)的受精卵内,由此发育的转基因鱼及其后代F1和F2均显示出快速生长效应。去垂体后,转基因鲤鱼F2持续生长,而非转基因鲤鱼和鲫鱼(Carassius auratus)的生长停止。给去垂体的鲫鱼腹腔注射生物合成的人生长激素(hGH),可恢复其生长。实验结果表明,转基因鱼体内表达和体外生物合成的hGH均能代偿鲤鱼和鲫鱼的内源生长激素并刺激去垂体鱼的生长。     

转基因鱼构建模式的研究 I．cMT—sGH全鱼基因鱼的构建与检测

转基因鱼工作的开展被用于水产科学基础与应用研究的各个领域。应用方面的一顶重要研究利用转生长激素基因来提高鱼的增长速度。需要解决两个问题：一是转基因鱼所使用的基因元件;二是外源基因的高整和率与高表达,已有许多报道认为：不同种动物的生长激素不一定相互促进生长。我们通过显微注射,将鲤鱼金属硫蛋白启动子（cMT）与大巴哈鱼生长激素基因（sGH）的融合基因（cMT-sGH)导入鲤鱼半日细胞后期的早期胚胎,构建了全鱼基因鲤鱼。通过斑点杂交、Southern blot结合PCR－Southern blot,对外源sGH的整和进行了精确的检测和分析。实验选取性成熟鲤鱼,收集卵子和精子,湿法受精获得受精卵。经过转基因注射,孵化后的鱼苗放入水族。待鱼平游,提取总DNA进行检测。以PstI酶切质粒pcMTsGH(Fig.4)分离3．4KbsGH片段,用随机引物标记,作为杂交探针。同时,设计并合成sGH基因的PCR特异引物。Fig.1的斑点杂交结果与Fig.2的PCR－Southern结果相比较（Table1),说明斑眯杂交存在着高的假阳性。而PCR－Southen将PCR的快速、方便与Southern的准确性相结合,排除了PCR本身可能的非特异,大大提高了检测效率,同时也检验了引物的设计是否成功。Table1的结果表明：我们所构建的基因鱼达到了37．7％的高整和率,且稳定性好。高整和率的原因与所使用的基因元件有很大关系。Fig.3基因组的Southern行为－PstI和BglII酶切的杂交信号条带多、共迁移,说明基因的整和方式为多拷贝,可能伴有碱基修饰。这可能是表达率降低的重要原因。     

鲤鱼和草鱼基因文库的构建及其生长激素基因和肌动蛋白基因的筛选

用显微注射方法,把由小鼠重金属鳌合蛋白(MT)基因启动子驱动的人生长激素(hGH)基因导人鲤鱼等的受精卵内,由此发育而成的一部分鱼的基因组内携带有MThGH基因,这些鱼称之为"转基因鱼"1.       

转大麻哈鱼生长激素基因鲫鱼研究

通过显微注射方法得到了一批转大麻哈鱼生长激素基因的实验鲫鱼。斑点杂交和ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ杂交证实部分实验鱼的基因组中已整合了外源生长激素基因,并有一尾鱼有比较明显的生长速度快的特征。     

转青鱼生长激素基因异源四倍体鲫鲤

生态安全性是转基因鱼走向市场的瓶颈,通过转基因四倍体鱼同转基因二倍体鱼杂交获得不育的转基因三倍体鱼是解决该问题的有效途径之一.本研究构建了青鱼β-actin基因启动子和青鱼生长激素（GH）基因精确连接的＂全鱼＂基因pbcAbcGHc;并采用显微注射法将pbcAbcGHc导入异源四倍体鲫鲤受精卵.对照养殖结果表明,150日龄的转基因异源四倍体鲫鲤原代（P0）的体重及体长明显大于对照组.选择60尾P0代转基因异源四倍体鲫鲤,采用PCR方法检测出外源青鱼GH基因在P0代转基因四倍体尾鳍基因组DNA中的整合率为90%;对20尾雄性P0代转基因四倍体精液样本的PCR检测发现,13个样本具有外源青鱼GH基因的整合.在一尾生长速度显著的P0代转基因四倍体鲫鲤的肌肉、肝脏、肾脏和卵巢组织中可检测到外源青鱼GH基因的转录.本研究成功获得了具有明显生长优势的P0代转青鱼GH基因异源四倍体鲫鲤,为建立转青鱼GH基因异源四倍体鲫鲤纯系和研制不育的转基因三倍体鱼奠定了基础.     

人生长激素基因导入金鱼受精卵内的整合,表达和促生长效应研究

通过显微注射法把小鼠ＭＴ启动子与人生长激素的融合基因（ＭＴ－ｈＧＨ）导入红友睛金鱼受精卵内,共注射１５０６个卵子,获得８００尾成鱼,经斑点和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分子杂交表明,导入的ＭＴ－ｈＧＨ基因与部分受体鱼的染色体ＤＮＡ发生了整合,整合率为２２％,转基因鱼血清中的生长激素含量平均高于对照组,平均生长速度高于对照组,导入的ＭＴ－ｈＧＨ基因可以遗传给后代。     

人生长激素基因导入金鱼受精卵内的整合、表达和促生长效应研究

通过显微注射法把小鼠ＭＴ启动子与人生长激素的融合基因（ＭＴ－ｈＧＨ）导入红龙睛金鱼受精卵内,共注射１５０６个卵子,获得８００多尾成鱼。经斑点和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分子杂交表明,导入的ＭＴ－ｈＧＨ基因与部分受体鱼的染色体ＤＮＡ发生了整合,整合率为２２％,转基因鱼血清中的生长激素含量平均高于对照组,平均生长速度高于对照组。导入的ＭＴ－ｈＧＨ基因可以遗传给后代。     

荧光异彩观赏鱼

历史回眸1985年,我国科学家朱作言先生通过显微注射方法,将人的生长激素基因和小鼠重金属螯合蛋白启动子相结合,注入鲫鱼受精卵,成功构建了世界上首例转基因鱼,掀起了世界各国对转基因鱼的研究热潮。此后,转基因鱼研究有了长足     

用直接注射法生产转基因鱼

本文报道了对鲤鱼、鲫鱼受精卵不加任何去膜处理,用显微操作器把外源基因直接注射到卵核附近,构建转基因鱼的方法。本法操作方便,孵化条件简单,成活率高。斑点杂交和Southern Blot杂交结果表明,外源基因的整合率与其它方法构建的转基因鱼的外源基因的整合率相近。从1988年至今,本组运用这个方法生产转基因鲤鱼、鲫鱼一万余尾。     

外源生长激素基因在蓝太阳鱼中的整合、表达和遗传

通过基因重组, 将石斑鱼生长激素基因编码序列克隆到鲤鱼βactin基因启动子下游, 构建了“全鱼”生长激素基因表达载体pCAecGHc。采用显微注射法, 研制出转“全鱼”生长激素基因蓝太阳鱼。经过PCR、PCR Southern杂交、RT PCR等技术对转植基因在转基因蓝太阳鱼中的整合和表达情况进行了检测。结果表明:转植基因在两批次P0 转基因蓝太阳鱼中的整合率为5 .60%和12. 26%, 并在转基因鱼中得到了正确表达, 表现为嵌合性表达。对转基因蓝太阳实验鱼进行了对照养殖实验, 初步显示转基因蓝太阳鱼具有较快的生长表型效应, 比对照组生长速度快20%-40%左右。应用近交策略培育出了两个转基因蓝太阳鱼F1 品系, 检测表明, 转植基因在两个品系的整合率分别为22 .03%和40 .8%。结果表明: 转植基因通过性腺传递给了子代, 同时也证实转基因P0 代的生殖腺为转植基因的嵌合体。     

外源基因在鲤鱼受精卵细胞不同发育时期整合效率的研究

显微注射技术是构建转基因鱼的基本基因导入技术,在受精卵的不同发育时期注射外源基因,外源基因在受体鱼基因组的整合率是不同的,受精卵的成活率也不一致。本文报道了鲤鱼受精卵在其不同的发育时期,注射外源基因与其成活率,整合率的关系。     

Studies on Pattern of Producing Transgenic Fish I.Production and Detection of All fish TRansgenic Common Carp With cMT sGH Gene

转基因鱼工作的开展被用于水产科学基础与应用研究的各个领域。应用方面的一项重要研究就是利用转生长激素基因来提高鱼的增长速度。需要解决两个问题：一是转基因鱼所使用的基因元件;二是外源基因的高整和率与高表达。已有许多报道认为：不同种动物的生长激素不一定相互促进生长。我们通过显微注射,将鲤鱼金属硫蛋白启动子（ｃＭＴ）与大马哈鱼生长激素基因（ｓＧＨ）的融合基因（ｃＭＴｓＧＨ）导入鲤鱼单细胞后期的早期胚胎,构建了全鱼转基因鲤鱼。通过斑点杂交、Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ结合ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ,对外源ｓＧＨ的整和进行了精确的检测和分析。实验选取性成熟鲤鱼,收集卵子和精子,湿法受精获得受精卵。经过基因注射,孵化后的鱼苗放入水族箱。待鱼苗平游,提取总ＤＮＡ进行检测。以ＰｓｔＩ酶切质粒ｐｃＭＴｃＧＨ（Ｆｉｇ．４）分离３．４ＫｂｓＧＨ片段,用随机引物标记,作为杂交探针。同时,设计并合成ｓＧＨ基因的ＰＣＲ特异引物。Ｆｉｇ．１的斑点杂交结果与Ｆｉｇ．２的ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎ结果相比较（Ｔａｂｌｅ１）,说明斑点杂交存在着高的假阳性。而ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎ将ＰＣＲ的快速、方便与Ｓｏｕｔｈｅｒｎ的准确性相结合,排除了Ｐ     

猪生长激素基因在金鱼中的整合、表达与生物活性(英文)

自Ｐａｌｍｉｔｅｒ于１９８２年首次将大鼠生长激素基因导入小鼠受精卵,培育出“超级鼠”以来,转基因动物技术获得迅速发展。本文以低等脊锥动物为实验动物,探讨猪生长激素基因导入金鱼受精卵后的整合与表达、生物学效应及后代遗传等问题,为进一步研究外源基因在高等脊椎动物（包括猪）内整合与表达的调控机理提供方法上的参考。实验结果表明：采用显微注射方法,将羊金属硫蛋白基因启动子与猪生长激素基因重组的线型ＤＮＡ（Ｆｉｇ．１）片段导入金鱼受精卵中,获得成活实验鱼,经斑点（Ｆｉｇ．２）,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交（Ｆｉｇ．３）,筛选ＰＧＨ阳性的转基因鱼作为亲本交配,分别得到Ｆ１代和Ｆ２代。经斑点、ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析（Ｆｉｇｓ．４,５＆６）及放射免疫检测（Ｔａｂ．１）,表明外源基因在部分受体鱼中得到整合和表达,并能通过有性繁殖传递给后代,且仍具生长效应（Ｆｉｇ．７;Ｔａｂ．２）。本实验获得的转基因阳性金鱼数量有限,且只传了两代,似乎不足以说明转基因金鱼后代表观特征的遗传稳定,但转基因金鱼Ｆ１代中存在外源基因整合位点纯合的个体是可能的。这为建立转基因动物纯系奠定了基础。     

家兔个体表达系统的建立

将乙肝表面抗原基因及人生长激素基因用微注射法转入家兔受精卵发育成为有整合,有表达的当代兔,并繁殖出了有外源基因存在,有表达的子代兔,转基因所用的质粒是含（1）乙肝病毒表面抗S基因与小鼠MT启动子的pMTSA.(2)乙肝病毒核心抗原基因和乙肝病毒S基因启动子的pHBV3.0,和（3）含有人生长激素基因SV40启动子和小鼠MT启动子的pSMGH,质粒均切成线性人子后再注射,从757个微注射并移植的受精卵经发良娩出得101仔兔。其中有57％具有整合的微注射基因,用ELISA法测出28只转基因兔内有8只的血清中有表达的乙肝病毒表面抗原,占总数约30％,转基因兔与转基因兔和其与正常兔交配获得的子代中有83％含有转基因,有15％在血清中可测出乙型肝炎表面抗原,对转入人生长激素基因的兔也作了整合和表达的检测。     

鱼类精子携带源基因导入

将鲤鱼（或泥鳅）精子在保存液内与人生长激素（ｈＧＨ）重组质粒ＤＮＡ保温,再与鲤（或泥鳅）卵受精。由此发育的鱼苗经ＤＮＡ分子杂交和ＰＣＲ检测证明,３３．３％（或３７．０％）的个体带ｈＧＨ基因,其拷贝数在４－１５０／细胞之间。在一定条件下,精子可作为携带外源基因的载体,通过受精作用产生转基因鱼。     

两种不同终止子在转基因鲤鱼中的促生长效应

转基因构建体中启动子的选择会直接影响转植基因的活性, 近年来有研究表明转基因构建体中终止子的选择会一定程度地影响转植基因的活性。为了更好地筛选转基因构建体和培育快速生长的转“全鱼”生长激素(Growth hormone, GH)基因鱼, 文章用鲤鱼β-actin基因终止子和生长激素基因终止子分别构建了转基因构建体, 显微注射得到转“全鱼”GH基因鱼P0代养殖群体, 比较两种不同终止子构建体的活性。统计分析发现, 生长激素基因终止子构建体的养殖群体的体重频率呈正态分布且平均体重显著高于β-actin基因终止子构建体的养殖群体, β-actin基因终止子构建体的养殖群体的体重频率呈右倾趋势的非正态分布。值得一提的是在混合养殖组中得到一条生长最为快速的鲤鱼证实为转基因阳性且为生长激素基因终止子构建体的转基因鲤鱼。该结果表明转“全鱼”生长激素基因鲤鱼可快速生长, 并能将转植基因向下代遗传。实验结果提示生长激素基因终止子构建体比β-actin基因终止子构建体表现的促生长活性要强。     

电脉冲法生产转基因鱼

本文以鲤鱼受精卵为实验材料,通过电脉冲方法将全鱼基因（pcMTsGH)导入鱼胚。在处理的1873粒受精卵中（650V/cm,50μs,4次）,孵出鱼苗540尾,孵化率为28．8％;经斑点杂交和Southern印迹杂交,外源基因的整合率为9．1％。因此该方法可以作为转基因鱼研究和生产的方法。     

人生长激素基因在转基因鲤鱼体内的遗传

通过有性繁殖转移入生长激素基因鲤鱼(P₁),获得了转基因鲤鱼的子一代(F₁)和子二代(F₂);外源基因在转基因P1与普通鲤鱼杂交产生的F₁代和转基因F1代自交产生的F₂代鱼中的存在率分别为45．4％和66．7％,外源基因拷贝数在子代个体之间存在很大差异,从每细胞2拷贝到每细胞200拷贝不等;外源基因在转基因鱼子代中仍可表达具有生物功能的产物．人生长激素(h1GH),并能促进鱼的生长。