淡水瓦氏雅罗鱼基因文库的构建和抗冻蛋白基因同源序列的筛选

极地海域中的鱼类非常耐寒。它们的血液里常含有两种能降低其体内冰点的蛋白质：抗冻糖蛋白（ＡＦＧＰ）和不含糖的抗冻蛋白或抗冻多肽（ＡＦＰ）。这些蛋白的编码基因已经被克隆,并将黄盖鲽ＡＦＰ导入虹鳟鱼和大西洋鲑鱼,而改变了它们的抗冻性能。为开展中国的抗冻转基因鱼研究,本项目对中国北方的耐寒淡水鱼的抗冻基因进行了分离研究。所用实验材料鱼为中国内蒙古北部生活的瓦氏雅罗鱼（Ｌｅｕｃｉｓｃｕｓｗａｌｅｃｋｉｉ）,属鲤形目（Ｌｙｐｃｉｎｉｆｏｒｍｅｓ）,鲤科（Ｌｙｐｒｉｎｉｄａｅ）,雅罗鱼亚科（Ｌｅｕｃｉｓｉｎａｅ）。基本按标准方法构建瓦氏雅罗鱼的基因文库,只在包装反应至３０分钟时,再加一份ＢＨＢ２６９０制备物,并延长３０分钟反应时间。所得文库的成斑率大于１×１０５ｐｆｕ。已知ＡＦＰ基因常常多至４０个拷贝,故已够用。采用通用的原位分子杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析进行瓦氏雅罗鱼ＡＦＰ基因同源序列的分离及其亚克隆分析。以北美黄盖鲽ＡＦＰ基因片段为探针,从瓦氏雅罗鱼ＤＮＡ文库中筛选了三个阳性克隆。图一所示为其中一个的双份膜及其复筛结果。图二为这个阳性克隆ＤＮＡ经过三种限制酶切后,同时与北美黄盖鲽ＡＦＰ基因片段和该基因０．４ＫｂｃＤＮ     

鱼类抗冻蛋白的研究——Ⅱ.黄盖鲽抗冻蛋白基因cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达

产于我国黄海的黄盖鲽(Pseudopleuronectes yokohamae)体内含有能阻止血液冰冻的抗冻肽(Antifreeze peptide AFP)。在对该蛋白进行纯化及对其特性的一系列研究的基础上,我们合成了一段抗冻肽基因的寡核苷酸片段。以此为引物,与黄盖鲽的mRNA进行杂交,从而特异性地反转录出抗冻肽基因cDNA片段。该片段经EcoRI Linker连接法克隆至大肠杆菌(E.coli)质粒载体pUC19上。抗冻肽cDNA插入片段经杂交证实后,对其进行了酶谱分析,核酸序列测定。重组克隆还在大肠杆菌JM83中得到了表达。     

瓦氏雅罗鱼染色体组型研究

瓦氏雅罗鱼(Leuciscus waleckii)是一种适应高寒盐碱化水体生活的主要经济鱼类。用瓦氏雅罗鱼精液和鲮鱼精液混精授精所得的鲮鱼耐寒力有所提高。而对于这类喜冷鱼类细胞培养和染色体核型,迄今国内尚未见报道。为了进一步探讨和利用瓦氏雅罗鱼的耐寒性能,作者先就该鱼的染色体核型进行了分析研究。       

应用DNA分子标记鉴定黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种的研究

为区分黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco Richardson）、瓦氏黄颡鱼（Pelteobagrus vachelli Richardson）及其杂交种,前期研究构建了一个YY超雄黄颡鱼的BAC文库并筛选到了一个包含性别连锁标记Pf62-Y的BAC克隆。研究对该BAC克隆进行测序并鉴定到了一个新基因Inad-like,而且Inad-like的外显子序列在X和Y染色体上基本一致。通过黄颡鱼Inad-like的外显子序列及序列的保守性我们设计引物在瓦氏黄颡鱼中扩增获得了其部分内含子序列。通过内含子序列比对,发现瓦氏黄颡鱼比黄颡鱼少了一个DNA片段。基于黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼的显著遗传差异,设计了一对引物,该引物在黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼基因组中分别扩增出1908和1178 bp DNA片段,而且在杂交黄颡鱼中同时扩增出这两个DNA片段。总之,这个新的遗传标记提供了一种稳定、高效识别黄颡鱼及其与瓦氏黄颡鱼杂交种的方法。     

鱼类抗冻蛋白的研究 Ⅰ.黄盖鲽血清抗冻蛋白的特性及分离

本文首次报道了中国沿海鱼类中有含抗冻蛋白的鱼种存在。从产于中国黄海的黄盖鲽血清中分离提纯了抗冻蛋白,并对其进行了研究分析。黄盖鲽抗冻蛋白具有十分明显的降低血液冰点的作用,存在特征性的热滞现象。该蛋白的分子量为4500道尔顿左右,经Sephsdex G-25柱层析及高效液相色谱逆向层析法二步提纯。氨基酸组成分析结果表明它含有60％左右的丙氨酸。抗冻蛋白产生于黄盖鲽的冬季血清中,而不存在于夏季血清中。从肝脏中提取mRNA。Northern杂交证实,黄盖鲽抗冻蛋白是一类在转录水平上受到调控的蛋白。该蛋白的提纯及对其特性的研究,对研究抗冻基因的克隆及表达都具有重要的意义。     

水稻腊质基因的分子克隆

利用λEMBI3为载体构建了水稻寒丰6366的基因文库,重组噬菌体数日达4×lo。,超过了要求的理论值。用缺口平移法标记玉米Wx基因DNA片段作探针,从基因文库中筛选出阳性杂交克隆。对其中一个阳性克隆,λWx2的southern分析表明,它和玉米Wx基因编码区杂交。根据绘出的物理图,将杂交区内一个0．4kb的BS片段克隆到M13上,测定了DNA顺序。结果表明,该区域内水稻和玉米Wx基因外显子DNA同源性在80％以上。这说明我们确实得到了水稻Wx基因克隆,而且水稻和玉米的Wx基因是高度同源的。     

结球甘蓝抗TuMV相关基因的克隆

以结球甘蓝高抗TuMV自交不亲和系84075为材料,构建了cDNA文库。根据抗病基因保守序列（NBS－LRR）设计一对简并引物,以84075的基因组DNA和cDNA为模板,进行PCR扩增,分别扩增出一条513bp片段,扩增片段进行克隆测序。选取两个与抗病基因同源性较高的克隆片段作探针（命名Borl,Bor2）,对构建的cDNA文库进行筛选,得到一个阳性克隆（命名TuR2）,测序及序列分析表明,该基因总长为762bp,编码226个氨基酸、包含681bp的开放阅读框。与已克隆的抗病基因有不同程度的同源性。利用TuR2作探针,进行了Southern杂交、Northern杂交以及抗病性的共分离检测分析。结果表明,TuR2可能吧单拷贝形式存在,其表达是组成成型的,且无组织特异性;初步确定是一个与结球甘蓝抗TuMV相关的基因。     

Milbemycin C5-O-甲基转移酶基因的克隆

目的是克隆milbemycin C5-O-甲基转移酶基因。以阿维菌素（avermectin)产生菌S.avermitilis中C5－O－甲基转移酶基因aveD为探针,利用核酸杂交分析法将aveD的主要同源区定位在（22）g-8-E-10阳性克隆所整合的.3kb SatⅠ-BgⅢ片段上。最后对aveD同源区及附近的核苷酸序列进行了测序分析和相应区域的基因缺失分析。结果表明,该区域存在一个月与aveD同源性较强的基因milD。与aveD功能相似,milD参与milbemycin的生物合成,在milbemycin生物合成中可能催化C5位OH的甲基化反应。     

簇毛麦端体6VS的显微切割及其专化DNA序列的克隆和分析

从簇毛麦（Haynaldia villosa (L.)Schur.)组合CA9211／RW15（6D／6V异代换系）幼胚培养SC2后代中,用原位杂交方法鉴定出T240－6为6VS端体异代换系。以此为材料,采用微细玻璃针切割法及“单管反应”技术体系,对6VS进行切割分离及LA（Linker adaptor)-PCR扩增。扩增带在100－3000bp之间,大部分集中在600－1500bp。利用^32P标记的簇毛麦基因组为探针进行Southern杂交,证实扩增产物来源于簇毛麦。扩增产物纯化后,连续到pGEM-T载体上,构建了6VS DNA质粒库。对库的分析表明,库大约有17000个白色克隆;插入片段分布在100－1500bp,平均600bp。点杂交结果表明,37％克隆有中度到强烈的杂交信号,证明含有中度或高度重复序列;63％克隆有较弱的信号或没有信号,证明为单／低拷贝序列克隆。从库中获得8个簇毛麦特异克隆,对其中两个克隆pHVMK22和pHVMK134进行了RFLP分析和序列分析,并利用该探针对小麦抗白粉病基因Pm21进行了检测。RFLP结果表明,两个克隆一个为低拷贝序列克隆（pHVMK22),另一个为高度重复序列克隆,均为簇毛麦专化DNA序列。以pHVMK22为探针对抗、感病小麦（Triticum aestivum L.)品系的Southern杂交发现抗病品系有一条2kb的特征带,该探针可能作为检测抗病基因Pm21的探针。     

用同源序列的染色体定位寻找水稻抗病基因DNA片段

根据已知植物抗病基因的序列以及蛋白激酶序列中的高保守区域设计合成了特异性和简并引物,用聚合酶链反应从水稻（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．）ＤＮＡ中扩增同源片段,获约１００个大小不同的克隆。以这些克隆作探针进行限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）分析,已将２６个克隆定位在两个水稻分子标记连锁图１２条染色体的３４个位点上。其中１０个克隆与８个已定位的水稻抗病基因在分子标记连锁图上的位置对应或毗邻。用其中部分与抗稻瘟病基因在染色体位置相对应的克隆作探针,分析抗稻瘟病近等基因系,ＲＦＬＰ带型在抗性基因系和感病亲本间表现出多态性,表明这些克隆与抗病基因在染色体位置上有较好的对应关系。     

稻瘟菌侵染诱导水稻凝集素基因的表达

利用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR),从非亲和性稻瘟菌生理小种131侵染的水稻品种爱知旭(Oryza sati-va L. cv.Aichi-asahi)叶片中分离了8个诱导差异表达的cDNA片段.对这8个差示片段进行了回收、重扩增和克隆,以其中一个长度为321碱基并与甘露糖结合水稻凝集素和水稻盐诱导蛋白基因高度同源的差示片段为探针,筛选水稻非亲和性cDNA文库,获得12个阳性克隆.序列测定和数据库查询表明该基因的cDNA与水稻凝集素基因的cDNA及盐诱导蛋白基因的cDNA核苷酸同源性高达96%,推定的氨基酸序列与甘露糖结合水稻凝集素的氨基酸序列一致,与水稻盐诱导蛋白仅相差2个氨基酸.Southern杂交显示该基因在水稻基因组中有两个同源拷贝数,Northern杂交表明非亲和性稻瘟菌侵染可强烈诱导该基因表达.因此推测该基因参与了水稻对稻瘟菌侵染的防御反应.     

利用抑制性差减杂交技术鉴定谢瓦氏曲霉间型变种产孢相关的基因

谢瓦氏曲霉间型变种Aspergillus chevalieri var.intermedius俗称"金花菌",是茯砖茶发酵中的优势菌种,该菌在不同的渗透压胁迫下产生不同类型的孢子。采用抑制性差减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH),以低渗条件下产生的子囊孢子和高渗条件下产生的分生孢子为材料分别与营养菌丝体构建两个正反向文库。每个库随机挑选400个阳性克隆进行测序。然后将所得到的基因片段在GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比对,筛选出的差异表达的基因涉及蛋白质代谢、细胞代谢、转录调控等多个方面,其中可能参与有性产孢调控的基因有13条,可能参与无性产孢调控的基因有10条。     

草菇冷诱导相关基因的克隆及序列分析

利用差异显示技术分离获得草菇低温特异DNA片段,经与正常草菇和低温诱导草菇cDNA分别southern杂交验证后,得到低温特异性片段。采用PCR标记技术对获得的低温特异性片段进行DIG标记,以此为探针,对低温处理的草菇cDNA文库进行筛选,获得4个阳性克隆,分别进行测序。序列同源性比较分析发现,Cor3基因与s-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶有很高的同源性,Cor4基因与40S核糖体蛋白S9有很高的同源性,这两个基因可能与草菇的低温自溶现象有关。Cor1基因与脉孢菌的保守假设蛋白(conservedhypotheticalprotein)有同源性,Cor2基因与辅酶A连接酶有同源性。半定量RT-PCR验证发现Cor1和Cor2基因在正常情况下没有表达,低温处理后有表达,Cor3和Cor4基因在正常情况下有表达,低温处理后表达量增加。     

GFP质控芯片的初步研究

目的：建立一种质量控制芯片来监测样品标记、杂交和检测过程中的失误。方法：针对GFP基因设计的4条60mer寡核苷酸探针和1条阳性对照探针polv（U）与流感寡核苷酸探针一起打印在DAKO玻片上,并构建了GFP基因的克隆载体和体外表达载体,将从这两种重组载体上获得的绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein,GFP）基因的ILNA、DNA片段和人的全血样品中的DNA用限制性显示技术（Restriction Display technology,RD）扩增标记,将标记的样品和荧光标记的通用引物U分别与芯片杂交、检测,并对扫描的结果进行统计分析。结果：GFP探针与相应的样品杂交时出现阳性信号,阳性对照探针在所有的杂交中均出现阳性信号,而空白对照则未检测荧光信号。结论：建立的质控芯片具有较好的敏感性和特异性,可以用于基因芯片中的质量监控。     

麦迪霉素4〃酰化酶基因的克隆及在螺旋霉产生菌中的表达

从含麦迪霉素生物合成基因⑴的初级克隆pCN6C5中,发现并分离了麦迪霉素4〃酰化酶基因,与质粒载体plJ680相连,获得重组质粒p66B,在螺旋霉素产生菌中得到表达,其主要产物为4〃异戍酰螺旋霉素。以p66B DNA BamHI—BamHI2．3kb插入片段为探针,从麦迪霉素产生菌基因文库中获得了另一阳性克隆pcNlOF5,southern分子杂交确定pcNlOF5BamHI—Bamm 8．Okb为同源片段。以pwHM3及pJJ680为载体,获得重组质粒pwF5及p6F5,分子大小分别为15．2kb及13．3kb。通过DNA转化,并经分子杂交实验证明,获得含重组质粒的螺旋霉素产生菌克隆菌株。其主要产物经分离、纯化后,分析其理化性质和光谱数据,鉴定为丙酰螺旋霉素Ⅲ和Ⅱ。研究还表明,麦迪霉素基因文库中只有pcNl0F5DNA与碳霉素产生菌的4〃异戊酰化酶基因同源,提示pcN6c5克隆携带的麦迪霉素4〃酰化酶基因与pcNlOF5的4〃丙酰化酶基因及碳霉素4〃异戊酰化酶基因有一定的区别。     

绿色木霉纤维素酶CBHII基因的分子克隆

本文以噬菌体lambda EMBL3 DNA为载体,通过克隆绿色木酶(Trichoderma viride)高分子量基因组DNA的部分酶解片段,并将重组分子进行体外包装后侵染Escherichia.coli K802,由此构建了绿色木霉基因文库。以李氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶CBHII基因的末端片段为探针,用轮迥噬菌斑原位杂交从文库中筛选出CBHII基因的阳性克隆5个,随机取其中3个克隆用上述探针作斑点杂交,结果进一步证明克隆了全长或近全长的绿色木霉CBHII基因,用李氏木霉CBHI基因的末端片段探针作斑点杂交,结果提示CBHI与CBHII基因的末端序列之间无同源性存在。从斑点杂交的阳性克隆中提取DNA,酶切鉴定插入片段的长度,并克隆于质粒pUC19,Southern杂交结果证明获得了含绿色木霉CBHII基因的重组质粒pCBHII-14。     

瓦氏雅罗鱼生殖洄游过程中离子调节相关生理变化研究

为了解达里湖瓦氏雅罗鱼(Leuciscus waleckii)生殖洄游过程中血清离子调节相关生理变化, 对比了达里湖和贡格尔河瓦氏雅罗鱼血清离子(Na+、K+、Cl?、Ca2+和Mg2+)水平, 鳃、肠和肾组织Na+/K+-ATPase和鳃Ca2+/Mg2+-ATPase活性、血清催乳素(PRL)、生长激素(GH)和类胰岛素生长因子-1(IGF-1)水平及鳃组织结构差异; 并利用实验生态学方法, 研究达里湖中瓦氏雅罗鱼转入贡格尔河水24h后上述生理参数的响应。研究结果显示, 与达里湖未洄游的瓦氏雅罗鱼相比, 洄游到贡格尔河后其血清Na+含量显著降低(P<0.05), Cl?含量显著升高(P<0.05), 肾脏和肠组织中Na+/K+-ATPase活性显著升高(P<0.05), 而鳃组织中Na+/K+-ATPase活性无显著变化; 血清K+、Ca2+、Mg2+水平和GH、IGF-1、PRL含量无显著变化。将达里湖瓦氏雅罗鱼转入河水中24h后, 其血清Cl?含量显著升高(P<0.05)、K+含量显著降低(P<0.05), 且在鳃、肠和肾组织中Na+/K+-ATPase及鳃Ca2+/Mg2+-ATPase活性均显著升高(P<0.05), 血清PRL和IGF-1水平显著升高(P<0.05); 比较湖中和河中瓦氏雅罗鱼鳃组织形态结构, 显示湖中瓦氏雅罗鱼鳃基底膜分布着大量黏液细胞, 洄游到河水中后黏液细胞数量明显减少, 鳃基底膜上氯细胞体积增大而数量未见明显变化。本研究结果表明: 瓦氏雅罗鱼从达里湖洄游到贡格尔河后通过提高血清PRL和IGF-1水平, 进而介导鳃、肠和肾组织中Na+/K+-ATPase活性增加, 从而维持鱼体较高或稳定的血清离子水平。     

以可转化人工染色体(TAC)载体为基础的百脉根基因组文库的构建及筛选

可转化人工染色体(transformation-competentartificial chromosome,TAC)载体是具有克隆和转移大片段DNA特征的新型载体,是植物基因克隆和转化的有效工具.该研究把它用于豆科植物百脉根(Lotus japonicus)基因组文库的构建.此文库由1.8×105个克隆组成,平均插入片段大小为15kb左右,约覆盖百脉根基因组6倍.文库保存在12块96孔板中,每个孔中约含150个不同的重组克隆.用与花发育相关的同源基因Ljcen1片段为探针,筛选得到6个阳性克隆,酶切后验证这些阳性克隆,结果表明这些克隆含有同一个基因片段.此基因组文库可直接用于植物转化,为百脉根功能基因组的研究打下基础.     

小菜蛾对溴氰菊酯抗性相关的DNA片段的克隆与分析

采用代表性差异分析（representational difference analysis, RDA ）方法,以小菜蛾Plutella xylostella (L.)的敏感品系作为对照组,溴氰菊酯抗性近等基因系（near isogenic line）作为测试组,通过三轮消减杂交得到大小为 150～300 bp的差异扩增带,经亚克隆测序并与GenBank等数据库同源比较,发现差异片段与已知抗性相关基因无同源性;以随机选取的差异片段作探针进行Southern blot分析,在测试组扩增子和三轮差异产物中都获得了阳性结果,而在对照组扩增子中的结果是阴性的。这些结果表明测序片段可能是与抗性相关的新基因序列或调控序列。     

青岛文昌鱼LIM类基因Bblim同源框区的cDNA克隆、序列分析及其在胚胎发育中的表达

不同卵裂球发育命运的特化、亦即胚胎细胞的分化是动物胚胎发育的重要特征。多数胚胎细胞尽管形态特征完全一致,却具有不同的发育命运。预示着：在这些细胞中存在有决定发育命运的因素－决定子。本工作克隆了青岛文昌鱼LIM类同源框基因的同源框片段。目的在于揭示决定子的分子本质。青岛近海采集性成熟的成年青岛文昌鱼,收集未受精卵、受精卵以及各处不同时期的胚胎,液氮冻存备用。分别制备总RNA。根据其它动物LIM类同源框基因的序列设计引物（Tab.1),连续进行RT－PCR和PCR两次扩增。其中,原肠胚来源的第二次PCR产物经电泳鉴定（Fig.1)后,酶切、克隆入质粒、测序、将该片段所在的基因命名为Bblim基因,该自然称为Bblim同源框。根据Bblim基因同源框的核苷酸序列推导出其相应的氨基酸序列（Fig.2),与其它LIM类同源框基因进行比较（Fig.3)后,认为：Bblim基因可归入lim3类基因。比较胚胎发育各个不同时期第二次PCR产物的含量－即Bblim基因的转录（Fig.4),提示：该基因可能在受精后和原肠成形前后两个发育阶段起作用。此外,Bblim基因的同源域与海鞘Hrlim的同源域高度同源,表达模式也相似,提示,Bblim基因可能是Hrlim基因在文昌鱼中的类似物。