应用双抗体夹心ELISA法定量检测人源破伤风毒素单克隆抗体中的IgG含量

采用山羊抗人IgG作为包被抗体,辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG作为标记抗体,建立一种双抗体夹心法用于定量检测人源破伤风毒素单克隆抗体的IgG含量。以纯化的IgG作标准,用平行线法测得亲和层析纯化的人源破伤风毒素单克隆抗体G2的含量为0．512μg／ml,与分光光度法测得的结果基本一致。因而样品检测采用纯化G2作参考标准,制作标准曲线,测定了已知样品和未知样品的抗体含量。结果表明本法重复性好,特异性强,可定量测定培养及纯化样品中人源单克隆抗体的含量。     

抗甲肝病毒基因工程单抗分离纯化与鉴定

为克服血源免疫球蛋白制品的不足,开发了抗甲肝病毒基因工程单克隆抗体anti-HAV IgG。用无血清培养基培养rCHO工程细胞株,上清液经过rProtein A SFF亲和层析→脱盐→离子交换层析→超滤换液纯化后,所得anti-HAV IgG纯度达99%以上,比活性约100IU/mg,anti-HAV IgG活性回收率40%。所纯化的anti-HAV IgG分子量150kD,等电点8.4～9.3。免疫印迹实验证实anti-HAV IgG为人源全抗体分子。亲和层析介质rProtein A SFF确实存在亲和配基脱落问题,但通过后续纯化步骤可有效除去。在亲和层析过程中加入高盐清洗步骤,可有效降低宿主DNA残留量水平。对样品中自由巯基含量进行了测定,认为非还原电泳图谱中低分子量条带是由于抗体分子内存在自由巯基引起。用该工艺制备的anti-HAV IgG各项纯度检测指标均达到我国对基因工程产品的质量要求。     

锯缘青蟹主要过敏原的纯化与鉴定

以锯缘青蟹为研究对象,从免疫鉴定、分离纯化、抗体制备和免疫学分析等方面对其主要过敏原进行研究。首先利用过敏者血清的免疫印迹法,确定锯缘青蟹的主要过敏原为分子量约38kD的蛋白。然后通过制备丙酮粉、等电点沉淀、硫酸铵沉淀及加热处理对分子量为38kD的主要过敏蛋白进行了高度纯化。该蛋白的pI约为4.5,与虾的原肌球蛋白Pena1性质相近,证实了锯缘青蟹的主要过敏原为原肌球蛋白。通过免疫新西兰大白兔,制备了原肌球蛋白的抗血清,采用Protein A Sepharose亲和层析柱对动物抗体进行了纯化。该抗血清效价高,经4×105倍稀释后仍能与抗原进行反应。该抗体与甲壳类动物及软体动物的原肌球蛋白具有较强的免疫交叉反应,可用于食品过敏原检测。       

九种重要经济动物二级抗体的制备和HRP标记

目的制备兔抗9种重要经济动物的二级抗体,并进行辣根过氧化酶标记,为经济动物血清学检测系统的建立提供工具。方法利用饱和硫酸铵沉淀粗纯抗体后,再利用protein A或protein G亲和层析的方法进一步纯化动物血清IgG,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散来检测抗血清的效价,并用Protein A亲和层析的方法纯化兔抗经济动物的二级抗体,采用简易过碘酸钠法对纯化的二级抗体进行HRP标记,通过ELISA方法测定标记抗体的效价,并利用Western blotting考察标记抗体的特异性。结果纯化了家猪,绵羊、山羊、牛、马、驴、狐狸、貉和黑貂9种重要经济动物的血清IgG,免疫双扩散法测定兔抗血清效价均达到1：32,并对纯化的兔抗家猪,绵羊、山羊、牛、马、驴、狐狸、貉和黑貂9种重要经济动物二级抗体进行了HRP标记,ELISA测定标记抗体的效价达到1：（2000～15000）左右,Western blots显示标记抗体具有很好的特异性。结论成功制备了HRP标记的兔抗9种重要经济动物的二级抗体,为经济动物血清学检测体系的建立提供了工具。     

红笛鲷Integrin-β基因的克隆及表达分析

为了探讨鱼类Integrin-β的组织分布及其在病原刺激后的表达模式,本研究以中国南方主要海水养殖品种-红笛鲷为研究对象,根据实验室构建红笛鲷cDNA差减文库中的EST片段,设计引物,通过RACE技术得到红笛鲷Integrin-β基因的cDNA全长(GenBank登录号:MG792792,命名为Ls-Integrin-β),该基因全长3 976 bp,开放阅读框(ORF)包含2 409 bp碱基,编码802个氨基酸,理论分子量大小为88.99 kD。氨基酸推导序列分析发现Ls-Integrin-β具有整合素家族保守结构域,C端存在一个跨膜结构域。系统进化树分析红笛鲷与鰤Integrin-β相似度最高。Ls-Integrin-β在健康红笛鲷体内的多种组织均有表达,其中肌肉表达量最高,脑、体肾、皮肤其次,肠道表达量最低。哈氏弧菌刺激后,红笛鲷脾脏中Integrin-β的表达在感染后6 h显著性(p0.05)上调,在12 h达到顶峰。以上结果表明,Integrin-β可能参与了宿主抵御病原入侵的免疫反应,为进一步了解红笛鲷抗菌免疫提供理论基础。     

拟南芥转录因子NF-YC的原核表达及多克隆抗体制备

采用PCR方法扩增NF-YC基因得到其全长cDNA序列,并将其克隆至原核表达载体pET-48b中,在大肠杆菌BL21中用IPTG诱导出分子量约为45 kD的融合蛋白,SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物。利用亲和层析技术对融合蛋白进行纯化,纯化后的目的蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。间接ELISA检测抗体效价大于1 62 500,Western blotting结果显示,该抗体可特异性识别NF-YC蛋白。     

东亚飞蝗谷胱甘肽S-转移酶分离纯化

通过硫酸铵沉淀技术和GSH-agarose亲和层析对东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis(Meyen)5龄若虫谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)进行了分离纯化。结果表明GSTs活性在硫酸铵各沉淀段均有分布,但在55%～100%沉淀段活性较高,在硫酸铵饱和度为85%时比活力最高,达到420.33μmol/min/mg protein,纯化倍数为18.86。根据硫酸铵粗沉淀谷胱甘肽S-转移酶结果,选择硫酸铵浓度为60%～90%沉淀段进行GSH-agarose亲和层析,纯化后比活力最高达到1365.29μmol/min/mg protein,纯化倍数达到61.25。经SDS-PAGE鉴定,得到的GST为1条带,亚基的分子量约为24kDa。     

Ezrin多克隆抗体制作及应用

构建Ezrin原核重组表达载体pET-28a(+)-ezrin,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导获得Ezrin蛋白,将经镍柱亲和层析纯化后的蛋白分别免疫新西兰大耳兔和昆明小鼠(KM),获得抗血清,采用ELISA和Western blotting,免疫荧光测定其效价和特异性。ELISA对抗血清进行效价测定表明抗血清可与抗原发生特异性免疫反应;通过Western blotting对抗血清进行鉴定表明抗血清可以识别几种细胞株内的特异性条带,其相对分子量为82 kD,与预测分子量相符;免疫荧光试验表明抗血清可以识别细胞内的Ezrin蛋白,且定位情况与文献报道相符。最后通过protein G对抗血清进行了纯化。结果表明用该方法制备的Ezrin多克隆抗体有较高的特异性和灵敏度。     

重组人β-干扰素的表达、纯化与鉴定

经 1 5L发酵罐制备重组人β 干扰素 (recombinanthumanIFN β,rhIFN β)。以免疫亲和层析方法纯化发酵液中rhIFN β并与蓝谱亲和层析纯化法比较 ,探索快速高效纯化rhIFN β的方法。以ELISA测定rhIFN β含量及经免疫亲和层析纯化的rhIFN β中鼠IgG残留量 ;以PAGE法鉴定rhIFN β的分子量 ;以CPEI法测定rhIFN β的生物活性。取 2L发酵液经免疫亲和层析纯化后 ,得到 3.0 3mgrhIFN β ;经蓝谱亲和层析纯化后 ,得到2 .6 5mg ;分子量为 2 2kD ;沉淀带灰度值分别为 96 .2 %和 95 .1 % ;CPEI比活性分别为 1 .4 3× 1 0 7IU/mg和 1 .6 3× 1 0 7IU/mg ;经免疫亲和层析后纯化物中鼠IgG残留量小于 5 0 μg/L。实验结果表明 ,所采用的免疫亲和层析和蓝谱亲和层析均可快速高效地从酵母菌发酵上清液中分离纯化rhIFN β基因产物     

貉血清IgG纯化及抗血清的制备

目的 制备高纯度貉血清IgG和兔抗貉IgG抗血清,作为建立多种动物抗体检测技术的储备。方法 采用Hitrap Protein A亲和层析及盐析再沉淀法纯化貉血清IgG,通过PAGE电泳和Western-Blot免疫印迹法对IgG作纯度及免疫活性检测;常规免疫法制备兔抗貉IgG血清。结果 貉血清IgG与Protein G虽有较强的结合力,但同时也结合血清中其他杂蛋白;用二步纯化法可从5 mL貉血清中纯化IgG约7 mg,电泳和免疫印迹测定显示,IgG纯度大于95%,常规免疫法制备抗血清免疫双扩散效价达1∶32。结论 建立了可行的貉血清IgG的纯化方法和高效价的兔抗貉血清IgG抗血清,为貉血清IgG二级抗体酶联物的制备储备了资源。