毒力岛基因ibeT有助于大肠杆菌抵抗人脑微血管内皮细胞溶酶体的降解

大肠杆菌是导致新生儿细菌性脑膜炎最常见的革兰氏阴性致病菌.为探讨毒力岛基因ibeT在大肠杆菌K1株致病过程中的作用,构建了ibeT基因缺失的大肠杆菌K1株,细菌在细胞内存活试验结果显示,ibeT基因缺失抑制了大肠杆菌K1株在人脑微血管内皮细胞中的生长.利用激光共聚焦扫描显微镜观察到,在细菌侵袭进入人脑微血管内皮细胞后,与野生型相比,ibeT基因缺失突变株较多地滞留在溶酶体内;透射电镜结果进一步显示,ibeT基因缺失使大肠杆菌K1株逃逸ECV(含有大肠杆茼的囊泡)的能力发生了下降,继而使其在细胞浆内的复制减少.利用体外模拟的弱酸性环境,检测大肠杆菌菌体胞内的缓冲容量,发现ibeT基因缺失突变株菌体胞内的缓冲能力较野生型低.这些结果提示,在大肠杆茼K1株侵袭进入人脑微血管内皮细胞后,ibeT基因有利于大肠杆菌降解ECV膜,避免与溶酶体融合,进而促使大肠杆菌逃逸进入细胞浆并进行复制.     

SBi4211阻断HIV-1 gp41促进新生隐球菌对人脑微血管内皮细胞的黏附作用

【背景】目前艾滋病和新型隐球菌性脑膜炎共病因素导致其高发病率和死亡率的机制尚不明确。【目的】探索S100B抑制剂SBi4211对HIV-1 gp41促进新生隐球菌黏附人脑微血管内皮细胞的影响和可能机制。【方法】黏附实验分析SBi4211是否能阻断HIV-1 gp41诱导下新生隐球菌黏附人脑微血管内皮细胞。使用免疫印迹方法进一步检测在此过程中SBi4211对脑微血管内皮细胞上新生隐球菌透明质酸受体CD44表达的影响。【结果】SBi4211可显著抑制HIV-1gp41对新生隐球菌黏附脑微血管内皮细胞的增强作用,且呈时间、剂量效应(P0.05);免疫印迹结果显示SBi4211可抑制新生隐球菌和/或HIV-1 gp41增加脑微血管内皮细胞上新生隐球菌透明质酸受体CD44的表达。【结论】SBi4211可通过下调受体CD44来阻断HIV-1 gp41对新生隐球菌黏附人脑微血管内皮细胞的增强效应,这为了解HIV-1与新生隐球菌共病机制及其防治策略提供了新思路。     

高糖、糖基化终产物对人脐静脉内皮细胞巨噬细胞炎性蛋白-1α mRNA表达的影响

目的探讨高糖浓度和糖基化终产物(AGEs)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)巨噬细胞炎性蛋白-1α mRNA表达的影响.方法将HUVECs用不同浓度AGEs(100mg/L、200mg/L、400mg/L)单独培养24h;并且用22mmol/L葡萄糖和400mg/LAGEs联合培养24h.采用原位杂交法检测巨噬细胞炎性蛋白-1α mRNA的表达水平.结果对照组内皮细胞内巨噬细胞炎性蛋白-1α mRNA呈弱表达;100mg/L、200mg/L及400mg/LAGEs孵育24h后,各组内皮细胞内巨噬细胞炎性蛋白-1α mRNA表达的平均积分光密度值分别为18.76±3.17、26.58±1.61及34.23±2.25(对照组为13.83±1.24,P<0.05);22mmol/L葡萄糖和400mg/LAGEs联合培养24h后,内皮细胞内巨噬细胞炎性蛋白-1α mRNA表达的平均积分光密度值为40.56±1.97(P<0.05).结论 AGEs能刺激HUVECs MIP-1α mRNA表达增加,且与高糖具有协同作用.     

大鼠海马内注射β淀粉样蛋白诱导外周血T细胞MIP-1α过表达及其穿过血脑屏障

为观察脑内β淀粉样蛋白(amyloidbeta,Aβ)沉积对外周血T细胞穿过血脑屏障的影响,通过立体定位仪将Aβ1～42肽注射到大鼠双侧海马(以Aβ42～1反序列肽为对照),实时定量PCR(RT-qPCR)检测发现,Aβ1～42上调了外周血T细胞中巨嗜细胞炎症蛋白(macrophageinflammatoryprotein-1α,MIP-1α)的表达,同时免疫荧光分析显示,脑内的Aβ1～42也引起了脑微血管内皮上MIP-1α受体(CCR5)的表达增加,以及伴随的脑实质内T细胞数量的增加.然而,大鼠腹腔内注射抗MIP-1α中和抗体则阻断了Aβ1～42所致的脑内T细胞数量的增加.提示脑内Aβ沉积能诱导外周血T细胞MIP-1α依赖性迁移入脑.     

细菌性脓毒症患者中性粒细胞表面CD64及巨噬细胞炎性蛋白1α表达水平及诊断价值分析

目的 探讨细菌性脓毒症患者中性粒细胞表面CD64（nCD64）及巨噬细胞炎性蛋白1α（MIP-1α）的表达水平和诊断价值。 方法 选取2015年6月至2019年3月我院诊治的305例细菌性脓毒症患者为研究对象,根据急诊科脓毒症相关病死率评分（MEDS）结果将入选患者分为高危组和中低危组,另选取50例健康体检者作为健康对照组,检测外周血nCD64、MIP-1α表达水平,分析nCD64、MIP-1α对细菌性脓毒症的诊断价值。 结果 细菌性脓毒症患者血清nCD64、MIP-1α水平均明显高于健康对照组,高危组患者血清nCD64、MIP-1α水平明显高于中低危组,差异有统计学意义（均P结论 外周血nCD64、MIP-1α表达水平可反应细菌性脓毒症的严重程度,对细菌性脓毒症具有较高诊断价值     

Gli1蛋白和PDGFRα在大肠癌组织中的表达及临床意义

Gli1蛋白和血小板衍生生长因子受体α(PDGFRα)的表达在大肠癌的发生发展过程中的作用还不清楚.通过免疫组化法检测60例大肠癌及30例正常组织中Gli1和PDGFRα的表达,并与临床病理因素进行相关性分析,研究两者在大肠癌中的作用.研究发现,Gli1和PDGFRα蛋白在大肠癌组织中的阳性率分别为73.7%和78.3%,明显高于正常组织的表达(P<0.05).Gli1和PDGFRα蛋白表达与患者年龄、肿瘤大小、组织学类型等均无关(P>0.05),但是Gli1蛋白和PDGFRα表达与淋巴结转移状况和Duke分期相关(P<0.05).Spear-man相关分析显示,Gli1与PDGFRα蛋白表达正相关(r=0.298,P<0.05).结果表明Gli1和PDGFRα在大肠癌发生、发展中呈协同和相互调节作用,Gli1和PDGFRα的表达参与大肠癌的侵袭和转移过程.联合检测可作为判断大肠癌预后,筛选高危转移患者的有效指标,同时也可用于指导大肠癌的靶向药物治疗.     

MIP-1α、 RANTES在原发性肝癌患者外周血中的表达及临床意义

为了探讨巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)、调节活化正常T细胞分泌与表达因子(RANTES)在肝癌患者外周血中的表达及临床意义,本研究抽取本院2015年6月至2017年6月收治的乙肝相关肝细胞癌(HCC) 50例、乙肝肝硬化(LC) 38例、慢性乙肝(CHB) 43例,分别记为HCC组、LC组、CHB组,且选择同期健康体检正常人员40例为对照组进行研究。观察其外周血MIP-1α、RANTES水平,并分析外周血MIP-1α、RANTES水平与原发性肝癌患者临床病理特点的关系。实验显示,原发性肝癌患者TNM分期越大,分化程度越低,外周血MIP-1α水平越低,RANREs水平越高(p0.05),原发性肝癌转移外周血MIP-1α水平显著低于非转移者、RANREs水平显著高于非转移者(p0.05)。本研究表明,原发性肝癌患者外周血MIP-1α水平低,RANTES水平高,均与原发性肝癌患者临床分期、分化程度及转移有关。     

病毒巨噬细胞炎症蛋白-Ⅱ对载脂蛋白B mRNA编辑酶催化样蛋白3G和正常T细胞表达分泌的调节活化蛋白表达的影响

目的:明确病毒巨噬细胞炎症蛋白-II(viral macrophage inflammatory protein-II,vMIP-II)对HIV-1抑制因子:载脂蛋白BmRNA编辑酶催化蛋白3G(apolipoproteon B mRNA-editing catalytic polypeptide-3G,APOBEC 3G)和正常T细胞表达分泌的调节活化蛋白(regulated upon activation normal T expressed and secreted,RANTES)表达的影响。方法:构建vMIP-II真核表达载pEGFP-N3-vMIP-II,分别采用电穿孔和脂质体转染的方法将其转染至Jurkat和293T细胞。荧光定量PCR检测vMIP-II基因对Jurkat细胞和293T细胞内的抗艾滋病基因APOBEC3G和RANTES表达水平的影响。结果:测序结果显示成功构建了的vMIP-II真核表达载体,荧光显微镜观察估计转染效率达到50%左右。与空载体组相比较,转染pEGFP-N3-vMIP-II组的Jurkat细胞内的APOBEC3G和RANTES分别上调4.97倍和7.31倍,293T细胞内的APOBEC3G和RANTES分别上调为5.73倍和8.14倍。结论:vMIP-II基因不同程度的上调了Jurkat细胞和293T细胞内的抗艾滋病基因APOBEC3G和RANTES的表达。     

小凹蛋白-1下调人脐静脉内皮细胞外钙敏感受体介导的钙内流

为了探讨小凹蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)细胞外钙敏感受体(extracellular Ca2+-sensing receptor,CaR)介导Ca2+内流中的作用,本实验研究了细胞膜穴样凹陷(caveolae)结构破坏剂Filipin或Cav-1基因沉默后对CaR介导Ca2+内流的影响。Fura-2/AM负载检测细胞内Ca2+浓度(intracellular Ca2+ concentration,[Ca2+]i)。结果显示,HUVECs中CaR对不同浓度细胞外Ca2+刺激无反应。无论细胞外为零钙液或含钙液时,精胺(Spermine,2mmol/L)刺激CaR时均引起[Ca2+]i升高(P<0.05),其中细胞外液为含钙液时,[Ca2+]i升高较细胞外为零钙液时更明显(P<0.05),CaR的负性变构调节剂Calhex231(1μmol/L)均可完全阻断Spermine刺激引起的[Ca2+]i升高(P<0.05);相反,Spermine升高[Ca2+]i作用可被Filipin(1.5μ...     

小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件的原核表达及多克隆抗体制备

目的:用原核表达的方法获得带有6个His标记的小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件的重组蛋白,并制备其多克隆抗体。方法:利用RT-PCR技术,从小鼠心肌组织中扩增出小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件cDNA片段,将该片段与原核表达载体pET-28a连接,构建重组表达质粒pETLG1-3并转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组表达菌株。用IPTG诱导重组大肠杆菌BL21(DE3)/pETLG1-3表达,SDS-PAGE分析表明在相对分子质量60000处有特异性重组蛋白表达条带,并经Western印迹进一步鉴定。用含融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒免疫家兔,制备抗小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件多克隆抗体,ELISA方法检测抗体滴度。结果:从小鼠心肌组织中克隆了层粘连蛋白α5链LG3组件的基因,并在大肠杆菌得以表达和纯化;制备了重组蛋白的多克隆抗体,其滴度可达到1∶10240。结论:小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件重组蛋白及其多克隆抗体的获得,为后续研究其功能打下了基础。     

研究: 肺炎衣原体抑制LXRα-ABCA1途径促进巨噬细胞脂质蓄积

为探讨肝X受体α (LXRα)-三磷酸腺苷结合盒转运体A1 (ABCA1)途径在肺炎衣原体 (C. pneumoniae)促巨噬细胞脂质蓄积中的作用和机制,以THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞为模型,采用高效液相色谱分析细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯含量,液体闪烁计数器检测细胞内胆固醇流出,RT-PCR检测ABCA1和LXRα mRNA的表达,蛋白质印迹检测ABCA1和LXRα的蛋白质表达;使用LXRα的特异性激动剂T0901317对细胞进行预处理,再观察上述指标的变化．结果显示,C. pneumoniae可促进THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯含量增加,抑制胆固醇外流,降低细胞ABCA1和LXRα的表达;使用ABCA1激动剂8-溴-环磷酸腺苷预处理细胞或LXR激动剂T0901317预处理细胞后,可明显减弱C. pneumoniae对THP-1细胞ABCA1的表达抑制,促进细胞胆固醇流出,降低细胞内胆固醇的含量．结果提示,C. pneumoniae促进巨噬细胞脂质蓄积及胆固醇流出障碍,其机制可能与LXRα-ABCA1途径有关．     

缺氧诱导因子-1α调节叉头框蛋白1表达促进大鼠外周血间充质干细胞缺氧存活

间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是再生医学中临床使用最多的干细胞之一。外周血间充质干细胞(peripheral blood mesenchymal stem cells, PBMSCs)以其获取简便、创伤小和具有多向分化能力等优势,在人类缺血性疾病的治疗方面具有重要应用前景。但尚未建立在缺氧环境下,使PBMSCs高存活和高扩增培养方法。本研究旨在探讨HIF-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)通过调节叉头框蛋白1(forkhead box C1, FoxC1)表达,促进PBMSCs缺氧存活和扩增的作用。采取SD大鼠外周血,分离出单个核细胞(mononuclear cells, MNCs),培养第3代后得到MSCs,随机将细胞进行以下3种处理,并分组：未处理组(Control, CON)、HIF-1α激动剂组(dimethyloxallyl glycine, DMOG,0.1 mmol/L,DMOG组)和HIF-1α抑制剂组(BAY87-2243,50 nmol/L,BAY组),进行缺氧培养PBMSCs,观...     

高迁移率族蛋白B1介导大鼠创伤性脑损伤后小胶质细胞M1极化和神经炎症

目的 观察高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)通路调控小胶质细胞极化对创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)后神经炎症反应的影响,探讨伤后神经炎症可能的干预靶点.方法 健康雄性SD大鼠96只,随机分为4组:假手术组(Sham)、脑损伤组(TB...     

膜周蛋白PICK1促进细胞膜上P2Y6受体表达及小胶质细胞的吞噬功能

膜周蛋白PICK1(protein interactingC-kinase-1)参与多种膜受体与膜上蛋白的运输并影响细胞的功能。本研究旨在探索小胶质细胞PICK1与P2Y6受体之间的相互作用是否可改变P2Y6受体在细胞膜上的表达,以及对小胶质细胞吞噬功能的影响。采用小鼠脑内皮层原代培养的小胶质细胞进行免疫共沉淀实验揭示,与PICK1敲除小鼠比较,野生小鼠皮层小胶质细胞内存在PICK1-P2Y6受体相互作用。生物素化、密度梯度离心结合蛋白质印迹实验证明,PICK1基因敲除小鼠的小胶质细胞膜表面P2Y6受体表达水平降低。荧光胶珠吞噬实验结合免疫组织化学染色显示,PICK1基因敲除小鼠的小胶质细胞对UDP（刺激）引起的荧光胶珠吞噬作用减弱。蛋白质印迹实验显示,与野生型小鼠比较,PICK1基因敲除小鼠小胶质细胞中的Akt 308T磷酸化水平明显降低|使用Akt抑制剂API-2能有效抑制Akt 在小胶质细胞内的（磷酸化）激活及UDP刺激引起的吞噬作用。上述结果表明,敲除PICK1能下调小胶质细胞膜上P2Y6受体的表达,并降低小胶质细胞的吞噬功能,且这一过程依赖Akt磷酸化修饰。总之,PICK1可促进P2Y6受体在细胞膜上的表达,是小胶质细胞吞噬功能的重要调节子|敲除PICK1可下调P2Y6膜受体表达,并降低小胶质细胞的吞噬功能。这一结果可加深对小胶质细胞的吞噬功能及机制的认识。     

葡萄糖6-磷酸脱氢酶调控细胞周期蛋白E1和细胞周期蛋白依赖性激酶2促进细胞增殖及其在肾透明细胞癌中的预后价值

肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是一种转移率高、预后差的细胞代谢性疾病,对其有效诊疗及预后分子标志物的研究十分重要。葡萄糖6-磷酸脱氢酶(glucose 6-phosphatedehydrogenase, G6PD)在ccRCC中高表达,并提示患者不良预后,其促进ccRCC细胞增殖的分子机制有待进一步揭示。本研究发现,降低G6PD可抑制细胞周期G₁/S期转化并显著抑制ccRCC细胞增殖。G6PD可在细胞水平调控G₁/S期转化及增殖相关因子Cyclin D1,CDK4,CDK6,Cyclin E1和CDK2基因表达。TCGA数据库分析结果表明,ccRCC 中Cyclin D1,Cyclin E1 和 CDK2的mRNA 水平显著升高,而CDK4表达无明显差异,CDK6表达却显著降低。相关性分析结果显示,G6PD与Cyclin D1呈显著负相关(P<0.0001),G6PD与CDK4,CDK6之间无显著相关性(P>0.05),G6PD与Cyclin E1(P<0.0001)以及CDK2(P<0.05)显著正相关。进一步免疫组化检测结果表明,Cyclin E1和 CDK2在ccRCC肿瘤组织中表达显著升高。生存预后分析结果显示,Cyclin D1高表达提示ccRCC患者整体预后更为良好,CDK4和CDK6表达水平在ccRCC患者总生存率预测中无意义;而Cyclin E1和CDK2高表达均可提示ccRCC患者预后不良。进一步细胞水平检测发现,Cyclin E1、CDK2表达降低可显著逆转G6PD促进ccRCC细胞增殖的能力。综上,与增殖相关因子Cyclin D1,CDK4和CDK6相比,G6PD有可能通过促进Cyclin E1和CDK2表达升高而发挥促进 ccRCC肿瘤细胞增殖的作用,并且这3者的异常高表达有望成为ccRCC患者不良预后的独立生存预测因素。