β-半乳糖苷酶的筛选、克隆表达、酶学性质及其酶法合成低聚半乳糖

采用人工底物邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(o NPG)为筛选标记,从耐有机溶剂微生物菌库中,筛选出具有较高水解活性的β-半乳糖苷酶产生菌,再以乳糖为底物考察菌株低聚半乳糖的合成性能,筛选得到1株产β-半乳糖苷酶的Erwinia billingiae WX1。根据Gen Bank中相同属种的基因组序列推测β-半乳糖苷酶基因,克隆得到β-半乳糖苷酶基因gal,并在大肠杆菌中实现了来源于Erwinia billingiae菌β-半乳糖苷酶的克隆表达。该基因的开放阅读框(ORF)为1 428 bp,编码475个氨基酸,理论相对分子质量为5.2×104。镍柱法分离纯化得到电泳纯的β-半乳糖苷酶GAL,其酶学性质研究表明最适催化温度55℃,最适p H 7.0;Mg~(2+)、Mn~(2+)对该酶起较强促进作用,EDTA对该酶抑制作用较强。利用β-半乳糖苷酶GAL的转糖基作用,以乳糖为底物合成低聚半乳糖,初步优化的反应条件:底物乳糖质量浓度400 g/L,每克乳糖添加酶量1.0 U,在40℃反应16 h后,低聚半乳糖合成率达到34%(质量分数),显示了较好的开发前景。     

新型海洋源β-半乳糖苷酶在毕赤酵母中的表达与酶学性质

从海洋环境β-半乳糖苷酶基因出发,采用毕赤酵母表达体系,构建产β-半乳糖苷酶的基因工程菌,并对重组酶酶学性质进行表征。结果发现:海洋源β-半乳糖苷酶具有优良的乳制品用酶特性,该重组酶的最适pH为7.0~8.0,最适温度为45℃,在50℃以下孵育1 h可保持55%以上的活力,能耐受Fe~(2+)、Na~(2+)、K~(2+)、Ca~(2+)等多种金属离子。宽广的pH、温度、金属离子稳定性,以及低温活性赋予该酶良好的乳制品用酶特性。     

海枣曲霉β-半乳糖苷酶的催化性质

 通过测定海枣曲霉β-半乳糖苷酶的底物特异性,表明该酶水解对-硝基酚基β-半乳糖苷(PNP-β-gal)的活力最高。该酶水解PNP-β-gal,乳糖和对-硝基酚基β-D-岩藻糖苷(PNP-β-fuc)的相对活力为100,63.1,10.3。不同测定方法的结果均表明,这一PNP-β-fuc水解活性来自β-半乳糖苷酶本身。Hg~(2+)、D-半乳糖和D-半乳糖-r-内酯对该酶有强烈的抑制作用,Ag~+和4mol/l脲也有较强的抑制作用。该酶水解PNP-β-gal和乳糖的Km值分别为1.3及36.2mmol/l,Vmax则分别为478和189μmol.min~(-1).mg~(-1)。Lineweaver-Burk作图法及Dixon作图法均表明D-半乳糖和D-半乳糖酸-γ-内酯对该酶显示竞争性抑制作用,其Ki分别为4和0.9mmol/l。     

碳源对K.fragilis LFS-8611β-D-半乳糖苷酶合成的影响

探讨了碳源对脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)LFS-8611生长、β-D-半乳糖苷酶合成的影响及碳源对该酶合成的诱导作用。脆壁克鲁维酵母(K,fragilis)LFS-8611生长与β-D-半乳糖苷酶合成同步。该菌株生长和产酶的最适碳源为半乳糖,乳糖次之。菌体生物量和酶活力随着培养基中乳糖浓度的增加而增加,乳糖浓度为12mg／mL,菌体生物量和酶活力达到峰值,分别为5．84g／L、19,12U／mL。半乳糖和乳糖对β-D-半乳糖苷酶合成具有诱导作用。诱导物浓度对β-D-半乳糖苷酶的诱导合成有较大影响。半乳糖诱导以山梨醇为碳源预培养的K．fragilis LFS-8611细胞合成β-D-半乳糖苷酶的最适浓度为10mg／mL。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的催化性质

通过测定黑曲霉β-葡萄糖苷酶的底物特异性,表明该酶不仅能水解纤维二糖和对硝基苯-β-D葡萄糖苷,还能微弱地水解对硝基苯-β-D-半乳糖苷和β-D-木糖苷。Ag~+、Cu~(2+)和Hg~(2+)对该酶有较强的抑制作用。该酶水解对硝基苯-β-D-葡萄糖苷、水杨苷和纤维二糖的Km值分别为2.32、19.11和30.18mmol/L,V_(max)则分别为412、237和198μmol·min~(-1)·mg~(-1),Lineweaver-Burk作图法表明,D-葡萄糖和δ-葡萄糖酸内酯对该酶显示竞争性抑制作用,其Ki分别为5.17和1.31mmol/L。     

一株产低温β-半乳糖苷酶微杆菌的筛选鉴定、产酶条件及其酶学特性

【背景】低温β-半乳糖苷酶能在低温下仍保持较高的乳糖水解活性,筛选酶学特性适合在牛乳体系中高效水解乳糖的β-半乳糖苷酶生产菌株,是低乳糖牛乳加工产业关注的焦点。【目的】对天山中国一号冰川沉积物中分离的一株产低温β-半乳糖苷酶菌株的产酶条件和酶学特性进行研究。【方法】结合X-Gal平板法初筛和测定粗酶液酶活复筛,获得产低温β-半乳糖苷酶的菌株。通过形态学、生理生化试验及16S rRNA基因测序分析对筛选菌株进行鉴定,单因素摇瓶实验优化菌株的产酶条件,硫酸铵分级沉淀初步纯化β-半乳糖苷酶并对其酶学特性进行分析。【结果】通过形态学、生理生化特征和16S rRNA基因鉴定,确定菌株LW106为微杆菌属(Microbacterium)菌株;该菌株最适产酶温度为25°C,最佳产酶碳源为可溶性淀粉,培养基初始pH为7.0,接种量为3%;对初步纯化的低温β-半乳糖苷酶酶学性质的研究表明,LW106所产β-半乳糖苷酶的最适pH为6.0,最适反应温度为35°C,4°C时酶活为最大酶活的78%,4°C和pH 7.0时的稳定性最好,10 mmol/L的Na+对酶活性基本没有抑制作用,Ca~(2+)对酶活性具有一定的激活作用。【结论】菌株LW106所产低温β-半乳糖苷酶的酶学特性表明该酶在乳品低温加工领域具有进一步研究和应用的价值。     

赤豆子叶β-半乳糖苷酶的纯化及其性质的研究

β-半乳糖苷酶 ( EC3.2 .1 .2 )广泛存在于动植物的组织中 ,如在杏仁、桃子、大豆、咖啡豆等植物 ,蜗牛 ,哺乳动物的肠道中都有 β-半乳糖苷酶 .同样 ,微生物也能产生β-半乳糖苷酶 ,俗称乳糖酶 .乳糖操纵子学说的提出就是建立在对微生物β-半乳糖苷酶研究基础之上的 .在过去的研究中 ,关于微生物、动物来源的乳糖酶报道较多[1] ,而对于植物来源的β-半乳糖苷酶研究报道却相对较少[2 ] .它可能降解多糖中 β-构型半乳糖苷键 ,为种子生长发育提供必要的能量来源 .但目前对β-半乳糖苷酶在植物中确切的生理生化功能尚不清楚 .为了进一步阐明…     

产β-半乳糖苷酶菌株的分离和筛选

β-半乳糖苷酶(EC_(3.2.1.23))俗称乳糖酶,它可催化乳糖水解为葡萄糖和半乳糖。有的婴儿在肠道中先天性缺乏此酶,对乳制品中的乳糖消化吸收极差,以致产生腹胀、腹泻等症状,称之为乳糖不耐症。又因乳糖在水中的溶解度较     

钙调神经磷酸酶B亚基及钙调素的EPR研究

根据顺磁离子Mn~(2+)的取代特性,用EPR方法研究了钙调神经磷酸酶B亚基与其4个Ca~(2+)的结合位点,以及它们亲和力的细微差别。并同时进行了钙调素的对比研究。实验和Scatchard作图表明,B亚基有4个Ca~(2+)结合位点,2个高亲和力结合位点,其解离常数为4×10~(-6)mol/L;2个低亲和力结合位点,解离常数为9×10~(-5)mol/L。钙调素也有2个Ca~(2+)高亲和力结合位点,其解离常数为8×10~(-6)mol/L,2个低亲和力结合位点,解离常数为7×10~(-5)mol/L。钙调神经磷酸酶B亚基和钙调素Mn~(2+)结合位点的EPR研究对B亚基和钙调素在共同调节钙调神经磷酸酶中的作用提供了有用的信息。     

半乳糖凝集素糖结合的新模式：一个糖结合域的双重配体结合

半乳糖凝集素家族通过糖识别结构域(CRD)可以专一性识别和结合含β-半乳糖的多糖配体来发挥其生物学功能.到目前发现的CRD对β-半乳糖的识别模式是非常保守的,在结构已知的半乳糖凝集素结构中,一个CRD只能结合一个多糖配体分子.最近,通过对人源半乳糖凝聚素-3 CRD与对硝基TF二糖(TFN)复合物的晶体结构解析首次发现,一个CRD可以同时结合2个TFN分子.与这2个TFN分子有双向结合的残基突变体E165A结构分析显示,一个残基的突变引起的结构上的微小变化会使结合位点2丧失结合糖底物的能力,而位点1的配体结合却不受影响.这表明,结合位点1对糖底物保守的识别和结合是基本的、主要的,而结合位点2对于糖有条件的结合,是额外的、次要的.序列比对和立体化学分析显示,参与新位点2结合的关键残基在其他半乳糖凝集素分子中都是保守的,而它们参与糖配体结合并不常见,表明它们作用的发挥是有条件的.可能在复杂寡聚结构的情况下,如有多重分支结构,双重结合位点将有利于对这类配体分子的辨识和结合,已有一系列研究报道,具有分支结构的寡糖与半乳糖分子的亲和势明显高于单价糖配体,与上述分析相一致.对这类双重位点糖结合的可能生物学意义进行了讨论.     

黑曲霉(Aspergillus niger)β-D-葡萄糖苷酶的纯化及其性质

利用垂直板凝胶制备电泳从黑曲霉(Aspergillus niger,AS 3.316)中分离提纯了β-D-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21),经凝胶电泳鉴定为单一带。酶作用的最适pH为4.4,在pH4.0—6.2稳定;最适温度65℃,热稳定性较好,于60℃保温4小时,活力保留80％。此酶作用于纤维二糖的Km值为6.09mM。聚丙烯酰胺薄层等电聚焦测得其pI值为5.5;用SDS凝胶电泳测得其分子量为77000。此酶不仅能水解纤维二糖和对硝基苯-β-D-葡萄糖苷,还能微弱地水解对硝基苯β-D-半乳糖苷和β-D-木糖苷。金属离子Fe~(2+)、Hg~(2+)、Cu~(2+)、Al~(3+)、Hg~+和Ag~+等对此酶有不同程度的抑制作用,蛋白质侧链修饰剂N-溴代琥珀酰亚胺对此酶有较强的抑制作用,2-羟基-5-硝基溴苯对酶也有一定的抑制作用,推测色氨酸残基对β-D-葡萄糖苷酶的活力是非常必要的。     

大肠杆菌β—D—半乳糖苷酶的定位突变及突变酶的动力学性质

利用人工合成的寡核苷酸探针,将编码大肠杆菌β-D-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)的Lac Z基因中537位Glu密码子GAA分别用GAC(Asp)、CAA(Gln)、GTC(Val)来替代,替代后的突变酶的催化活性显著降低.同天然β-D-半乳糖苷酶相比,作用于ONPG底物时,突变酶的k_(cat)值分别为0.13%(Asp-537)、0.0006%(Gln-537)、0.0035%(Val-537),但它们的K_m值并无明显改变.无论是天然酶还是突变酶,底物类似物IPTG是一个强有力的抑制剂,而过渡态类似物2-脱氧-2-氨基-半乳糖和L-核糖只对突变酶有微弱的抑制作用.活化剂叠氮钠的激活作用小于β-D-半乳糖苷酶的Glu-461突变酶.催化甲醇成酯反应的能力小于天然酶.突变酶对热更不稳定.以上结果表明Glu-537残基是该酶催化反应的必需基团.     

耐热α-半乳糖苷酶的高效表达及酶学性质初探

[目的]实现耐热α-半乳糖苷酶在毕赤酵母中的高效表达,并初步研究其酶学性质。[方法]克隆来源于埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)的α-半乳糖苷酶基因TEgal,构建p AO815-TEgal重组表达载体,采用DNS法测定其水解活性及酶学性质;通过薄层层析研究其水解底物谱;并构建TEgal基因多拷贝表达框,实现了该基因的高效表达。[结果]TEgal对棉籽糖水解活性最高9. 5 U/m L,最适温度75℃,最适pH值3. 5; Na~+、K~+对TEgal有促进作用,Mg~(2+)、Co~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)、Fe~(2+)、Zn~(2+)均能抑制酶活,多拷贝重组表达菌株活性最高为22. 4 U/m L。[结论]成功构建耐热α-半乳糖苷酶高效表达菌株,通过提升基因剂量将酶活和蛋白含量提高了135%和356%。     

植物β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶是一个与细胞壁降解相关的酶,广泛分布于植物组织中,参与一系列的生理生化过程,如植物的花粉发育、果实成熟及生长过程中多糖的裂解。目前,已从多种植物中分离到β-半乳糖苷酶基因。β-半乳糖苷酶基因属于多基因家族,随着研究的深入,其不同水平的转录本在不同植物的不同组织中被发现。但目前β-半乳糖苷酶在植物发育中确切的作用机制尚不明确。现介绍目前这一领域内细胞与分子生物学方面的研究进展,并结合所在课题组的研究结果进行相关探讨,为进一步研究β-半乳糖苷酶在植物中的作用机制提供新的线索。     

植物β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶是一个与细胞壁降解相关的酶,广泛分布于植物组织中,参与一系列的生理生化过程,如植物的花粉发育、果实成熟及生长过程中多糖的裂解。目前,已从多种植物中分离到β-半乳糖苷酶基因。β-半乳糖苷酶基因属于多基因家族,随着研究的深入,其不同水平的转录本在不同植物的不同组织中被发现。但目前β-半乳糖苷酶在植物发育中确切的作用机制尚不明确。现介绍目前这一领域内细胞与分子生物学方面的研究进展,并结合所在课题组的研究结果进行相关探讨,为进一步研究β-半乳糖苷酶在植物中的作用机制提供新的线索。     

分枝犁头霉a-半乳糖苷酶的底物特异性

测定了43种碳水化合物对酶活力的影啊。其中半乳糖、甘油醛及纤维二糖使酶活力下降50％以上,D-阿拉伯糖、塔格糖、半乳糖醛酸、D-枝糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖酸内酯．乳糖及蔗糖使酶活下降到70％左右;而二羟丙酮、2-脱氧-D-半乳糖及异丙基β-D-硫代半乳糖苷使酶话提高50％左右;其余的碳水化合物对酶活无明显影响。测定了Hg2+、甘油醛及半乳糖对酶的抑制类型。结果表明,Hg2+是a-半乳糖苷酶的非竞争性抑制剂,半乳糖及甘油醛是酶的竞争性抑制剂,后两者的K,值分别为8．3及12．5 mmol／L。     

香蕉果实软化相关β-半乳糖苷酶基因的克隆及其表达分析

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）通过分解细胞壁半纤维素切除半乳糖键而参与果实软化。为了阐明香蕉（Musasp．）果实成熟过程中的软化与细胞壁代谢酶β-半乳糖苷酶基因表达之间的关系,采用RT-PCR方法,从成熟香蕉果实果肉中分离了编码β-半乳糖苷酶基因的部分cDNA（MA-Gal）,序列分析表明,MA-Gal包含927bp,编码309个氨基酸,包含5个β-半乳糖苷酶结构域（典型真核生物中β-半乳糖苷酶包含7个结构域）,推导的MA-Gal蛋白质中有β-半乳糖苷酶蛋白的催化活性部位GGPIILSQIENEY（F）;系统进化树分析结果表明MA-Gal属于第一类β-半乳糖苷酶基因（该类主要在果实中表达）;β-半乳糖苷酶活性和硬度的变化表明其与香蕉果实硬度变化密切相关;Northern分析显示,跃变前期的果肉中,MA-Gal基因的表达量很低,后随着果实的软化表达量不断增加,并在呼吸跃变后达到最高。所有结果表明,MA-Gal参与香蕉果实成熟过程中的软化。     

γ-聚谷氨酸与D-半乳糖酯化衍生物-顺铂复合物的制备及其生物活性

介绍了制备一种γ-聚谷氨酸-D-半乳糖酯化衍生物-顺铂复合物［poly (γ-glutamic acid)-D-galactose esterifiable derivative-cisplatin complex compound,γ-D+-DDP］,并考察其抗肿瘤活性。主要通过生物发酵获得大分子γ-聚谷氨酸［poly (γ-glutamic acid) ,γ-PGA］,利用酸降解得到可以作为药物载体的小分子γ-聚谷氨酸;利用凝胶色谱柱检验小分子γ-聚谷氨酸的分子量;利用MTT法检测该复合物的体外抗肿瘤作用。结果表明：成功获得γ-聚谷氨酸-D-半乳糖酯化衍生物-顺铂复合物,该复合物载药率达9.4% ~10.2%;该复合物对人肝癌细胞BEL-7402具有显著的杀伤作用,能引起细胞凋亡(HE染色观察得到)。因此,γ-聚谷氨酸-D-半乳糖酯化衍生物-顺铂复合物是一种有效的抗肿瘤药物,具有潜在的临床应用价值;生物发酵的γ-聚谷氨酸可用于药物载体,赋予药物新的特点。     

树脂固定化β-半乳糖苷酶制备低聚半乳糖

以树脂为载体研究β-半乳糖苷酶固定化条件,来改善酶性质。以吸附率和回收率最高的离子交换树脂I002为载体,通过先吸附后交联的方法固定β-半乳糖苷酶,优化固定化条件。结果表明:加酶量为51.8 U(以1 g树脂计),固定p H为6.5,温度是25℃,吸附时间12 h,戊二醛体积分数为4%,交联温度是40℃,时间是6 h时,固定化效果最好。获得的固定化酶活可达16.2 U,固定酶回收率为39.1%,得到低聚半乳糖(GOS)的产率为24.2%。该研究为工业化利用固定化乳糖酶连续生产低聚半乳糖提供了技术依据。     

大肠杆菌β-D-半乳糖苷酶的定位突变及突变酶的动力学性质

利用人工合成的寡核苷酸探针,将编码大肠杆菌β-D-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)的Lac Z基因中537位Glu密码子GAA分别用GAC(Asp)、CAA(Gln)、GTC(Val)来替代,替代后的突变酶的催化活性显著降低.同天然β-D-半乳糖苷酶相比,作用于ONPG底物时,突变酶的k_(cat)值分别为0.13%(Asp-537)、0.0006%(Gln-537)、0.0035%(Val-537),但它们的K_m值并无明显改变.无论是天然酶还是突变酶,底物类似物IPTG是一个强有力的抑制剂,而过渡态类似物2-脱氧-2-氨基-半乳糖和L-核糖只对突变酶有微弱的抑制作用.活化剂叠氮钠的激活作用小于β-D-半乳糖苷酶的Glu-461突变酶.催化甲醇成酯反应的能力小于天然酶.突变酶对热更不稳定.以上结果表明Glu-537残基是该酶催化反应的必需基团.