视黄酸对人肝癌细胞的逆转作用——生物学研究

 SMMC-7721人肝癌细胞株在10μmol/L的视黄酸(又称维甲酸,Retinoic Acid,RA)处理后,增殖明显受到抑制。RA作用后的细胞~3H-TdR总参入量明显下降,而单个细胞的~3H-TdR参入率却变化不明显。流式细胞仪分析表明该细胞株G_0/G_1、S及G_2+M期的百分率分别为49.6％、16.7％、33.7％,而RA处理3天的细胞则相应地为59.1％、15.4％、25.5％。经RA处理3天后,细胞染色体的主流范围由对照细胞的48—56转变为44—50,其中二倍体细胞数由4％上升至15％。     

蛋白激酶与细胞分化—两种分化诱导剂对酪氨酸蛋白激酶的抑制

在报道视黄酸(RA)是人肝癌细胞株SMMC-7721分化诱导剂的基础上,本文继续报道8-溴-环磷酸腺苷对该细胞也有分化诱导作用,两者都抑制细胞的增殖,降低γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)比活力和升高(ALP)碱性磷酸酶的比活力。在10μmol/LRA和0.5mmol/L-8-Br-cAMP处理细胞1、3、5天后,胞液和膜性组分中的酪氨酸蛋白激酶(TPK)的比活力均降低,其中RA对胞液TPK的作用在早期较明显,约降低30％,而对膜性TPK的影响则随培养天数而逐渐增加,至第5天下降达50％以上。8Br-cAMP则相反,对胞浆TPK的抑制主要发生在3天以后;约抑制43—53％,而对膜性组分则抑制率逐日降低,在第一天较为明显。因TPK是一个细胞增殖恶变的标志,故RA和8-溴-cAMP对TPK的抑制进一步证明这两种分化诱导剂对SMMC-7721细胞的逆转作用。     

视黄酸对人肝癌细胞表面N糖链类型及天线数的影响

本文采用系列凝集素柱层析法,并配合外切糖苷酶处理研究了在视黄酸(RA)作用1—5天过程中人肝癌细胞株SMMC-7721细胞表面N糖链结构的变化。结果表明,RA促进3~H-甘露糖(Man)参入细胞表面N糖链,使高甘露糖型N糖链的百分比下降,复杂型百分比上升,并促进二天线N糖链的生物合成,使多天线特别是四天线和C_2,C_(21)b三天线N糖链的合成减少。结果提示,N糖链结构的这些变化可能是RA诱导SMMC-7721细胞向正常方向分化的结果。     

维甲酸对人肝癌细胞磷脂酰胆碱专一性磷脂酶D的作用

为了解细胞信号转导与细胞分化间的关系,研究了诱导分化剂全反式视黄酸(ATRA)和13顺视黄酸(13 cis-RA)对7721人肝癌细胞中磷脂酰胆碱专一性磷脂酶D(PC-PLD)的影响。发现ATRA和13 cis-RA除能抑制7721细胞生长,并在形态上向正常方向分化外,分别在第2或第4天使膜结合性PC-PLD的比活力升高,用每瓶细胞的总活力计算,ATRA的作用在第2天也高于13 cis-RA,但13 cis-RA在第4天的效应却高于ATRA,说明13 cis-RA较ATRA的效应滞后。每天更换培养液的条件较不更换时细胞生长速度较快,且更能引起PC-PLD比活力的上升,提示新鲜培养液中可能存在促进生长和增强维甲酸升高PC-PLD的化合物。ATRA在第2天对PC-PLD比活力的作用高于第4天,可能由于第4天细胞增殖加快,细胞中蛋白质含量上升,以至使以蛋白含量计算的酶比活力下降。进一步研究维甲酸使膜结合性PC-PLD升高与蛋白激酶的关系,发现ATRA不论在第2天和第4天均使膜结合性和胞液中蛋白激酶C(PKC)和酪氨酸蛋白激酶(TPK)的比活力下降,说明ATRA使膜结合性PC-PLD活力的升高不是通过PKC 或TPK对PC-PLD的激活作用来实现,其机理有待进一步研究。对维甲酸引起PC-PLD升高的生物学意义作了讨论。     

视黄酸对胃癌细胞周期的调控

视黄酸(RA)能够抑制许多类型癌细胞生长、诱导细胞凋亡和调节细胞周期。本文研究了全反式视黄酸(ATRA)对人胃癌细胞的作用机理。结果表明,ATRA通过诱导细胞滞留在G_0/G_1期而显著抑制胃癌细胞生长,但ATRA不能诱导胃癌细胞凋亡;ATRA调控细胞周期与c-myc、磷酸化Rb水平的下调和p21~(WAF1/CIP1)、p53水平的上调有关,而cyclinD_1和CDK_4水平没有明显变化。在RA抗性细胞中,ATRA不能调节这些基因表达。结果证实,ATRA对胃癌细胞生长抑制与其诱导细胞滞留在G_0/G_1期有关,而与细胞凋亡的诱导无关,许多重要的、与周期相关的分子,包括cmyc、p21~(WAF1/CIP1、p53和Rb等参与细胞周期的调控。     

视黄酸促进限定性内胚层细胞向胰腺前体细胞分化

研究视黄酸（RA）在限定性内胚层细胞向胰腺前体细胞诱导过程中的最佳作用方式。在无饲养层培养体系下联合多因子分阶段诱导经历10天时间获得胰腺前体细胞。获得的细胞不仅表达胰腺前体细胞的标记pdx1,但是也同时表达肝脏前体细胞的标记afp。有研究表明在胰腺特化过程中RA能起到抑制afp的作用,因此在不同的时间点添加RA并持续不同的作用时间来调节内胚层细胞向肝胰分化的命运。收集d7到d10的细胞用免疫组化和RT—PCR检测pdx1和afp的表达情况。结果显示RA从d3开始持续作用到d10可以获得更高的pdx1阳性细胞同时能有效的抑制afp的表达,并且在d9可以获得最高比率的pdxl阳性细胞,提示RA持续作用促进限定性内胚层细胞向胰腺前体细胞分化。     

视黄酸对人肝癌细胞蛋白激酶的影响

 视黄酸(RA)处理SMMC-7721人肝癌细胞株72小时后,胞浆、膜性组分的蛋白激酶C(PK-C)的活力及比活力均下降,活力分别下降44.9％和48.8％,比活力下降42.7％和35.0％。然而,胞浆与膜性组分的活力,比活力比值在RA处理前后并无十分明显的变化,这提示在RA作用过程中,未发生PK-C的膜-浆转位。蛋白激酶A(PK-A)的变化则相反,RA处理72小时,活力、比活力上升了295％,258％。PK-A/PK-C的活力比值则从0.342增加到1.849,比活力比值从0.210增加到0.897。因PKC和PKA分别和细胞的去分化性增殖和分化有关,故上述结果和我们已报道的RA可抑制SMMC-7721细胞株的增殖和促进其分化相一致。     

黑麦叶肉原生质体的分离、培养与幼小愈伤组织的形成

黑麦叶肉原生质体系用纤维素酶溶去壁后分离出来的。酶液混合液为:纤维素酶(2％)、果胶酶(0.5％)溶于0.65M的甘露醇中,保温在24～26℃。将生长5—6天的黑麦叶片在酶掖中处理2—3小时后,就可使90％以上的原生质体分离下来。将每毫升含有5×10~4—10~5密度的原生质体培养在液体培养基中(表1),其中附加2,4-D(1毫克/升)、6BA(0.5毫克/升)、CH(1克/升)和0.56M蔗糖。培养条件为光照800—2000米烛光,温度23—26℃。培养48小时后长出新壁。第3天出现第一次分裂,4—7天进行第二、三次分裂,9天后形成细胞团,25天后长成大细咆团。此后,定期加等体积的新鲜培养液,继续培养一个时期后便形成了幼小愈伤组织。     

水杨酸对丹参培养细胞中迷迭香酸生物合成及其相关酶的影响

迷迭香酸(RA)是丹参中一种重要的酚酸类次生代谢物。为探讨水杨酸(SA)诱导子对丹参悬浮培养细胞中RA的生物合成及其相关酶的影响,考察了SA诱导子和酪氨酸氨基转移酶(TAT)的竞争性抑制剂(AOPP)对RA合成积累量、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和TAT活性的影响。发现在培养的第6天用浓度为6.25 mg/L的SA处理后,PAL活性在诱导后4 h出现高峰,为对照组水平的124%;RA的积累量在诱导后8 h出现峰值(5.914±0.296)mg/g。用浓度为0.1μmol/L的AOPP处理,6 h后AOPP对TAT活性影响较小(与对照组无显著差异),但明显抑制了PAL活性(为对照组水平的44%),且在PAL活性明显降低的同时RA的积累量显著减少(4.709±0.204)mg/g。进一步用0.1μmol/L AOPP和6.25 mg/L SA共处理,AOPP对PAL的抑制作用可得到一定程度的缓解,且RA的积累量较AOPP单独处理的高。表明SA可以诱导丹参悬浮培养细胞中RA积累量的增加,且在RA合成过程中PAL的限速作用比TAT明显。     

视黄酸诱导人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞分化过程中核基质蛋白组成的变化

在鉴定视黄酸(retinoic acid, RA)诱导人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞分化的基础上,应用免疫细胞化学、选择性抽提和蛋白质组学分析技术,对SK-N-SH细胞诱导分化过程中核基质蛋白组成变化进行了系统研究.实验结果显示,经1 μmol/L RA处理后SK-N-SH细胞呈极性状,伸出较长的轴突样突起,胞体逐渐变小变圆.免疫细胞化学结果显示,处理后神经细胞特异表达的蛋白synaptophysin、NSE、MAP2的表达量都较对照组有明显增强.双向凝胶电泳分析显示,在RA诱导SK-N-SH细胞分化前后存在52个差异表达的核基质蛋白,经质谱分析,鉴定了其中的41个蛋白.蛋白印迹杂交进一步确证了诱导分化差异表达核基质蛋白中nucleophosmin和prohibitin等的表达变化.研究结果表明,1 μmol/L RA对SK-N-SH细胞具有显著的诱导分化作用,在SK-N-SH细胞分化过程中,其核基质蛋白组成发生了明显变化.这些变化对于揭示人神经母细胞瘤细胞癌变与逆转机制和肿瘤细胞增殖与分化调控机理均有十分重要的意义,从而为研究神经系统正常发育过程及神经系统疾病的发病机理提供科学依据.     

防风悬浮细胞的原生质体再生植株

防风(Saposhnikovia divaricata(Turcz.)Schischk)试管苗的根尖,下胚轴或叶柄切段在含有1mg/l 2,4-D 的 MS 固体培养基上,形成含有胚性细胞团的愈伤组织。愈伤组织经液体振荡培养,形成含有大量胚性细胞团的悬浮培养物。用含有 Onozuka R-10 1.5%、Mace-rozyme R-10 0.3%、蜗牛酶0.5%、CaCl_2 5mmol/l 和甘露醇0.6 mol/l(pH=5.8)的酶液从胚性细胞团游离得到原生质体。原生质体在培养的第4天出现第一次分裂,50天左右形成的细胞团大小为1—2mm。这些细胞团在含有0.5 mg/l 2,4-D 的 MS 固体培养基上形成愈伤组织。在含有0.1 mg/l 6-BA 或0.1 mg/l 2,4-D+0.5mg/l 6-BA 的 MS 固体培养基上,原生质体再生的愈伤组织分化出胚状体。胚状体在不含任何生长调节剂的 MS 固体培养基上发育成完整的原生质体再生植株。     

两株克隆F9细胞株的初步比较研究

我们用有限稀释法从F9细胞克隆得到了F9-1和F9-3两个克隆亚株,实验结果表明它们在生长行为,分化发育潜能RA诱导提高AKP活力和合成AFP等方面都存在着差异。F9-1细胞是以团块贴壁生长为主,F9-3细胞是以单个和少数细胞的团块悬浮生长为主。将F9-1细胞接种到129/SV-ter小鼠皮下,长出的瘤组织的切片表明,除了EC细胞组成的未分化的神经管样结构外,还含有分化的腺管组成。经RA处理后的F9-1细胞,长出的瘤块中腺管增多并具有分泌功能。不管RA处理与否。从F9-3细胞长出的瘤块中几乎全由未分化的EC细胞构成。F9-1细胞经RA处理72小时,AKP酶活力明显增加,比相应对照组细胞的酶活力提高2—3倍;而F9-3细胞经RA处理后酶活力无明显提高。F9-1细胞经RA处理72小时,AFP免疫酶染色呈现细胞质阳性反应,对照组呈阴性或弱阳性;而F9-3细胞经RA处理后,与不处理的对照组细胞一样,细胞质的AFP免疫酶染色都呈阴性反应。以上结果表明,F9-1克隆株是一株对RA反应比较敏感的EC细胞,能被RA诱导分化,提高AKP活力并诱导合成AFP。F9-3克隆株是一株对RA不敏感的EC细胞,不能诱导分化,AKP酶活力不增加,也不能合成AFP,这些特性似乎更接近于无能EC细胞。     

诱导子人参寡糖对红花培养细胞的生理效应

从人参(Panax ginseng)培养细胞中分离纯化出不同寡糖。这些寡糖能促进红花(Car-thamus tinctorius)培养细胞的生长及提高细胞中α-生育酚的含量。其中以Ⅶ、Ⅷ、Ⅵ等三种寡糖的效果较为显著。这三种寡糖的最适浓度在愈伤组织培养(5—8 mg/L)中要比在细胞悬浮培养(1—2mg/L)中高。对Ⅶ、Ⅷ两种寡糖不同时期加入的效应进行了试验,结果发现,加入寡糖后1—3天,α-生育酚的含量即提高。在红花细胞悬浮培养过程中同时加入2mg/L 的寡糖Ⅵ和寡糖Ⅶ及1mg/L 的寡糖Ⅷ,可使红花细胞生长速率提高18.11%,α-生育酚含量比对照提高3.5倍,其产率比对照提高4.3倍。     

维生素A酸和双丁酰基环腺苷单磷酸对小鼠胚胎干细胞的诱导分化

我们用建系的小鼠胚胎干细胞ES-5细胞为材料,研究了维生素A酸(RA)和双丁酰基环腺苷单磷酸(dBcAMP)对该胚胎干细胞的体外诱导分化。在ES-5细胞单层培养的条件下,RA单独作用或RA与dBcAMP共同作用,都产生神经元样和成纤维样两种细胞;在后一种作用情况下分化细胞可达90—95%,通过对细胞形态特征表型标志(GFAP,层粘蛋白等)的分析,初步证明绝大部分细胞为神经胶质细胞。除单层培养外,我们还研究了RA对ES-5细胞聚集体贴壁培养的诱导分化,在这种条件下,分化细胞类型较多,其是最突出的是有节律收缩的心肌样细胞。本文讨论了ES-5细胞单层培养与细胞聚集体贴壁培养两种条件下,RA诱导的差异及其可能原因。     

视黄酸对大鼠肝癌细胞γ-丁基甜菜碱双加氧酶的表达及肉碱合成的影响

为研究大鼠原发性肝癌γ-丁基甜菜碱双加氧酶(γ-BBD)的基因表达以及视黄酸对大鼠肝癌细胞γ-BBD表达的影响。研究用50 mg/kg公斤体重的二乙基亚硝胺(DEN)腹腔每周注射一次的给药方案在体内诱发大鼠原发性肝癌,并通过western blotting和real-time PCR技术对大鼠原发性肝癌模型肝组织中肉碱合成关键酶γ-BBD以及维甲酸X受体γ(RXRγ)的表达水平进行了检测;在体外,本研究通过western blotting和real-time PCR检测了1μmol/L 13-顺式视黄酸(13-cis-RA)处理的大鼠肝癌细胞(RH-35细胞)γ-BBD和RXRγ的表达水平,并通过流式细胞术分析了13-cis-RA处理的RH-35细胞的细胞周期。结果显示,与对照组相比,γ-BBD和RXRγ在大鼠原发性肝癌模型组织中的mRNA丰度和蛋白表达水平显著降低;但是,与对照组相比,在用视黄酸处理48 h、处于明显G1期阻滞的大鼠肝癌细胞内,γ-BBD和RXRγ的mRNA丰度和蛋白表达水平显著升高。这些结果表明,γ-BBD和RXRγ在DEN诱导的原发性肝细胞癌中的表达水平明显下调,而13-cis-RA能诱导并上调大鼠肝癌细胞RXRγ和γ-BBD的表达。提示13-cis-RA对γ-BBD表达的影响可能对大鼠肝癌细胞肉碱的合成具有促进作用。     

过表达miR-498通过下调STAT3抑制类风湿性关节炎患者Th17细胞分化

本文旨在探讨微小RNA-498(miR-498)影响类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中Th17细胞分化的作用机制。从50例RA患者和50例对照人群中分别收集外周血,分离PBMCs。流式细胞术检测CD4~+IL-17~+T(Th17)细胞或者CD4~+FOXP3~+T(Treg)细胞比例,并分析Th17/Treg比值。Real-time PCR检测细胞中miR-498和STAT3基因表达,Western blot检测STAT3的蛋白表达,ELISA检测外周血血清或细胞上清中IL-17的浓度。荧光素酶报告基因实验验证miR-498靶向结合STAT3的3’非翻译(3’untranslated region,3’UTR)。miR-498 mimic或/和pc DNA-STAT3瞬时转染CD4~+T细胞,进一步考察miR-498影响Th17细胞分化的机制。结果显示,RA患者的PBMCs中,Th17细胞比例显著高于对照,且Th17/Treg比值也显著高于对照(P0.05)。miR-498低表达而STAT3高表达于RA患者的PBMCs中,且RA患者血清中的IL-17浓度显著高于对照(P0.05)。在转染野生型STAT3报告基因质粒的细胞中转染miR-498 mimic/inhibitor后,荧光酶活性、STAT3的基因和蛋白表达均明显改变(P0.05),但是在转染突变型STAT3报告基因质粒的细胞中转染miR-498 mimic/inhibitor,上述指标没有显著变化(P0.05)。此外,miR-498 mimic转染CD4~+T细胞后,显著降低Th17细胞比例,且细胞分泌IL-17的水平减少(P0.05),而与pcDNA-STAT3共转CD4~+T细胞后,Th17细胞比例明显提高,细胞分泌IL-17的水平增加(P0.05)。以上结果提示,在RA患者CD4~+T细胞中,过表达miR-498靶向下调STAT3,进而抑制Th17细胞分化。     

视黄酸缺乏对斑马鱼心脏房室分化的影响

目的 通过化学遗传学方法建立视黄酸缺乏的斑马鱼模型,探讨视黄酸缺乏对斑马鱼胚胎心脏前后轴发育即房室分化的影响.方法 在斑马鱼胚胎孵育的5 hpf,用不同浓度梯度的视黄醛脱氢酶2抑制剂DEAB(1×10-6、5×10-6、10×10-6、25×10-6 mol/L)处理斑马鱼胚胎,实时观察斑马鱼胚胎发育的全过程.通过给予斑马鱼胚胎外源性视黄酸,观察其对DEAB的拮抗作用.应用胚胎整体原位杂交观察视黄酸缺乏对心脏特异基因vmhc和amhc表达的影响.结果 斑马鱼胚胎的生存率随着DEAB处理浓度的增加而降低,当DEAB浓度≥5×10-6 mol/L时,斑马鱼的畸胎率达100%.5×10-6 mol/L DEAB的致畸作用能够被1×10-9mol/L外源性视黄酸所拮抗.整体原位杂交结果显示视黄酸缺乏会导致斑马鱼胚胎心脏房室分化异常,表现为vmhc表达细胞的范围增大,amhc表达细胞的范围缩小.结论 通过外源性DEAB处理能有效地建立视黄酸缺乏的斑马鱼模型,DEAB影响胚胎发育存在剂量依赖性.视黄酸在斑马鱼心脏前后轴发育过程中起重要调控作用,心脏发育早期视黄酸缺乏会抑制心房的发育而支持心室的发育,出现房室分化异常.     

维甲酸对人肝癌细胞磷脂酰胆碱专一性磷脂酶D的作用

为了解细胞信号转导与细胞分化间的关系,研究了诱导分化剂全反式视黄酸（ＡＴＲＡ）和１３顺视黄酸对７７２１人肝癌细胞中磷脂酰胆碱专一性磷脂酶Ｄ（ＰＣ－ＰＬＤ）的影响。发现ＡＴＲＡ和１３ｃｉｓ－ＲＡ除能抑制７７２１细胞生长,并在形态上向正常方向分化外,分别在第２或第４天使膜结合性ＰＣ－ＰＬＤ的比活力升高,用每瓶细胞的总活力计算,ＡＴＲＡ的作用在第２天也高于１３ｃｉｓ－ＲＡ,但１３ｃｉｓ－ＲＡｄ ｔｘ ４     

丙型肝炎病毒核心基因置换对病毒复制和感染影响的初步研究

本文旨在探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心(core)蛋白在病毒复制和感染中的作用,采取基因置换的方法,用HCV1b型J4株的核心基因平行置换2a型J6JFH1株的核心区,构建了FL-J6JFH/J4core嵌合复制子。体外制备RNA转录体,以脂质体介导转染Huh7.5.1肝癌细胞。转染后第5天,用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测细胞内HCVRNA水平。第8天,以丙型肝炎患者血清为一抗,免疫荧光法(IFA)检测转染细胞内HCV蛋白表达。同时收集转染后第8天的细胞上清液,感染naveHuh7.5.1肝癌细胞,72h后IFA检测HCV蛋白表达。结果显示,FL-J6JFH/J4core转染组第5天细胞内RNA水平与野生型FL-J6JFH1接近,无显著差异(n=4,P0.05)。免疫荧光检测显示,FL-J6JFH/J4core转染细胞后第8天及其上清液感染的naveHuh7.5.1细胞的HCV阳性细胞数都低于野生型。本研究结果初步表明,HCV各株间核心基因的替换会影响HCV的蛋白翻译和感染性病毒颗粒的产生与释放。     

诱发大鼠肝癌早期病变中蛋白激酶和磷脂的变化

<正> 近年来发现蛋白激酶不但参与细胞的代谢调节,还与细胞的增殖和分化密切相关。除酪氨酸蛋白激酶是某些癌基因的表达产物外,钙-磷脂依赖性蛋白激酶(又称蛋白激酶C,PK-C)是促癌剂TPA(12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-aeetatc)的受体。作者在前文中曾报导:分化诱导剂视黄酸可使人肝癌细胞株SMMC-7721中蛋白激酶C的活力明显降低;而蛋白激酶A(cAMP依赖性蛋白激酶,PKA)则明显增加。本文研究化学诱发大鼠肝癌早期病变中这两种蛋白激酶的变化,观察有无和视黄酸处理时相反的改变。为了证实诱癌是否成