利用Red重组工程技术解决外源基因在大肠杆菌染色体lac操纵子中的表达

为了应用Red重组工程技术实现外源基因在大肠杆菌染色体上的表达, 寻找染色体上外源蛋白的稳定高效表达位点, 使用Red重组工程系统和kan/sacB无痕迹修饰技术, 将易于定量分析的荧光素酶报告基因替换DY330染色体lac操纵子中的lacZ基因。检测该位点的表达效率结果显示: 大肠杆菌染色体上lac操纵子能够高效稳定表达外源基因, 初步证明了染色体可以作为外源蛋白或抗原的表达载体, 不会影响细菌的生长繁殖。     

利用Red重组工程技术解决外源基因在大肠杆菌染色体lac操纵子中的表达

为了应用Red重组工程技术实现外源基因在大肠杆菌染色体上的表达, 寻找染色体上外源蛋白的稳定高效表达位点, 使用Red重组工程系统和kan/sacB无痕迹修饰技术, 将易于定量分析的荧光素酶报告基因替换DY330染色体lac操纵子中的lacZ基因。检测该位点的表达效率结果显示: 大肠杆菌染色体上lac操纵子能够高效稳定表达外源基因, 初步证明了染色体可以作为外源蛋白或抗原的表达载体, 不会影响细菌的生长繁殖。     

重组大肠杆菌高表达高密度发酵研究

大肠杆菌高密度高表达发酵技术是现代发酵工程的重要研究课题,此项技术可以有效地提高大肠杆菌的产量和外源重组蛋白的表达量,该文就影响大肠杆菌高密度发酵的主要因素如宿主菌类型、培养基组成、培养条件、生长抑制物质、补料调控等进行了阐述和讨论。     

外源蛋白在大肠杆菌中的表达定位策略

外源基因在大肠杆菌中表达是对基因重组技术的成功应用。外源基因在不同的大肠杆菌表达系统中表达产物可能定位于大肠杆菌空间结构的不同位置：胞质,胞质膜,胞周质,胞外膜和胞外培养基,五种表达定位方式各有其特点和途径。     

外源蛋白在大肠杆菌中的表达定位策略

外源基因在大肠杆菌中表达是对基因重组技术的成功应用。外源基因在不同的大肠杆菌表达系统中表达产物可能定位于大肠杆菌空间结构的不同位置:胞质,胞质膜,胞周质,胞外膜和胞外培养基,五种表达定位方式各有其特点和用途 。     

大肠杆菌外源蛋白表达载体稳定性的研究进展

构建高产、稳定、可靠的质粒载体成为基因重组表达技术的研究重点之一。宿主细胞代谢反应和质粒不稳定性相关信息的缺乏,仍然阻碍着质粒载体的优化,成为限制外源蛋白在大肠杆菌中高效表达的瓶颈之一。主要论述了大肠杆菌外源蛋白表达载体的稳定性,分别从质粒和外源基因的本身特性、重组质粒转化对宿主细胞造成的影响及其他因素等方面阐述了对质粒载体稳定性的影响,同时介绍了相关的解决办法,从而为大肠杆菌表达系统高效表达外源蛋白提供参考。     

大肠杆菌乙酸产生及其控制研究

大肠杆菌表达系统具有许多优点,是表达外源基因常用的宿主菌,然而在培养过程中易发生副产物乙酸的生成和积累,造成碳源浪费,且会抑制菌体生长及外源基因的表达,影响了大肠杆菌的生产能力.介绍了大肠杆菌乙酸产生的原因,分析了乙酸的抑制作用及其机理,并探讨控制乙酸生成和减少乙酸抑制的方法,为利用大肠杆菌生产重组蛋白提供过程控制的参考依据.     

重组大肠杆菌的分批补料培养方法

在重组大肠杆菌的培养过程中,存在着菌体的高浓度与外源蛋白的高表达这一矛盾,使得重组菌的比生长速率通常远远低于宿主菌,限制了基因工程菌由实验室规模向工业化规模的转变。要实现重组大肠杆菌的高密度培养,最常用和最有效的方法就是分批补料流加培养。     

重组大肠杆菌的发酵与代谢工程

在工程菌的发酵中,外源基因高表达条件下的高密度发酵对于提高生产效率、降低生产成本、简化产品纯化工艺以及降低扩大生产投资都具有非常重要的意义．然而在大肠杆菌的高密度发酵中遇到了许多困难［‘］,其中主要包括有机酸类代谢副产物累积并抑制细菌自身生长、供氧限制和外源基因高表达引起宿主细胞生理负担过重等问题。对此,国内外学者作了许多有意义的探索。应用代谢工程技术对工程菌进行改良,使之有利于外源基因的高表达及高密度发酵,是一项很有应用前景的研究课题,引起了广泛关注。本文拟对近年来有关应用代谢工程改良重组大肠…     

重组蛋白质在大肠杆菌体系中的可溶性表达策略

大肠杆菌表达体系因其表达量高、周期短、成本低等诸多优势特征而被广泛用作重组异源蛋白质的表达宿主。据统计超过30%的重组蛋白质药物和50%重组蛋白质的制备是使用大肠杆菌作为表达宿主。蛋白质错误折叠或未折叠以及包涵体形成是大肠杆菌表达体系更广泛应用的主要阻碍。因此,重组蛋白质在大肠杆菌体系中可溶性表达策略探索意义重大。综述了重组蛋白质在大肠杆菌表达系统中不可溶性表达的原因、机制以及影响大肠杆菌表达系统重组蛋白质可溶性的一些关键因素,并基于外源蛋白质在大肠杆菌中表达的各个步骤,总结了目前促进蛋白质在大肠杆菌表达系统中高效、可溶性表达的策略,为进一步拓展大肠杆菌表达体系在重组异源蛋白质可溶性表达中的应用提供参考。     

优化大肠杆菌表达外源蛋白的研究进展

大肠杆菌表达系统是目前表达外源蛋白的首选,利用该表达系统表达重组蛋白有许多优越性,但表达的外源蛋白容易被宿主蛋白酶攻击或未能正确折叠形成包涵体,其表达受到了限制。综述了国内外利用大肠杆菌表达外源蛋白过程中采用的一些优化策略,主要包括表达稀有密码子、应用融合标签,改变表达菌株、降低包涵体形成、单一蛋白技术、自诱导、流加培养以及高密度细胞培养等,以期探索外源蛋白表达的最优策略。     

用遗传算法进行重组大肠杆菌发酵动力学的分析

重组大肠杆菌在诱导表达人表皮生长因子的过程促使细菌的生长受到抑制,一部分重组菌丧失了分裂能力,但仍保持着一定的代谢活力,分离成为存活但不能培养的细菌,根据大肠杆菌在表达外源蛋白过程中细胞生理状态的不同将细菌分为三类,提出一个描述诱导表达过程中重组大肠杆菌分离、生长的动力学模型．应用遗传算法对不同底物浓度的细胞生长、分离和产物合成的动力学参数进行了有效地估计,避免了传统算法可能陷于局部最优的问题,模型计算结果与实验结果吻合良好．分离模型在初始糖浓为5-20g/L的范围内可以较好地描述发酵过程中细胞生长、分离和目标产物表达的过程并具有一定的预测能力．     

大肠杆菌ptsG基因敲除及其缺陷株生长特性研究

在大肠杆菌磷酸转移酶系统中,葡萄糖主要由ptsG基因编码的酶ⅡCB^Glc转运入细胞。利用代谢工程技术构建ptsG基因缺陷株,有望降低葡萄糖的摄取速率,减少乙酸累积,促进菌体生长。运用PCR技术,扩增出两翼与ptsG基因上下游序列同源,中间为氯霉素抗性基因的DNA片段。经电转化,将外源DNA片段分别转入Escherichia coli DH5a、JM109中。在Red重组酶的作用下,外源DNA片段与染色体上同源区域重组,将基因ptsG敲除,构建ptsG基因缺陷株：DH5αP,JM109P。在LB培养基中,ptsG基因缺陷株的生长状况与亲株无明显差异。在含有葡萄糖的LB培养基中,DH5αP、JM109P的最高菌密度分别是对照菌株DH5α,JM109的3．47倍和4．25倍,ptsG基因缺陷株对葡萄糖的摄入量也明显高于对照菌株。重组蛋白肿瘤坏死因子(TNF)在DH5αP、JM109P中的表达量分别占全菌蛋白的24．3％、20．8％,A600分别为8．28、7．62,TNF在缺陷株中单位体积的表达量明显高于对照菌株。以上结果说明,大肠杆菌ptsG基因缺陷株具有良好的生长能力和表达外源蛋白的能力,在大肠杆菌高密度发酵研究方面具有良好的应用前景。     

相容性溶质支持下重组免疫毒素的周质腔可溶表达及葡萄糖对其表达的影响

在基因工程的实践中,包含体的形成是人们利用大肠杆菌表达外源蛋白的一大难题。本文报道了利用山梨醇、甜菜碱等相容性溶质,在高盐胁迫下,实现了重组免疫毒素在大肠杆菌周质腔中的可溶性表达。同时发现葡萄糖的加入时机对重组免疫毒素的表达量有重要的影响。     

pBR322-Red介导的E．Coli染色体基因敲入、位点及表达研究

应用pBR322-Red介导的重组工程系统,Kan/sacB选择反选择系统,双链线性DNA重组技术和重叠引物介导的DNA重组技术,将长度为1 653 bp的luc报告基因分别敲入到E.coli W3110染色体lacZ, lacY和lacA基因的位置,建立了一系列具有新遗传表型的菌株：CWL2、CWL4和CWL6。荧光素酶分析表明,外源报告基因luc能在这3个结构基因处有效的组成型表达。为了进一步确定外源基因的表达情况,用霍乱毒素B亚单位基因ctxb替换了lacZ基因,构建了新菌株CWD1。证明了以单拷贝形式存在在大肠杆菌染色体CWD1上的ctxb基因能有效的表达CTB蛋白并能将其分泌至细胞外培养液中。结果初步确定了大肠杆菌染色体上的lac操纵子结构基因位点适合外源基因的敲入和表达。     

提高大肠杆菌可溶性重组蛋白表达产率的研究进展

大肠杆菌表达重组蛋白相比真核细胞具有成本低廉、大规模发酵容易、条件易于自动化控制等优点,通过大肠杆菌表达重组蛋白是一种高效、经济的途径,重组蛋白表达量可达到大肠杆菌总蛋白质量的50%。具有正常生化活性的重组蛋白通常为可溶性形式,因而对于以得到活性产物(如抗体、酶等)为目的的研究,通常采用可溶性表达途径。目前已有多种以可溶性重组蛋白为活性物质的治疗性药物经批准上市,但并非所有外源基因均能实现可溶性高表达,因此重组蛋白的可溶性高表达具有重要研究价值。在总结近年提高经大肠杆菌可溶性表达重组蛋白产率研究的基础上,从启动子的选择、SD序列的引入、信号肽的优化、宿主细胞的选择、共表达其他蛋白质,高密度发酵等方面阐释在大肠杆菌中提高可溶性重组蛋白表达产率的方法。     

pBR322-Red介导的E.coli染色体基因敲入、位点及表达研究

应用pBR322-Red介导的重组工程系统,kan/sacB选择反选择系统,双链线性DNA重组技术和重叠引物介导的DNA重组技术,将长度为1 653 bp的luc报告基因分别敲入到E.coli W3110染色体lacZ,lacY和lacA基因的位置,建立了一系列具有新遗传表型的菌株:CWL2、CWL4和CWL6.荧光素酶分析表明,外源报告基因luc能在这3个结构基因处有效的组成型表达.为了进一步确定外源基因的表达情况,用霍乱毒素B亚单位基因ctxb替换了lacZ基因,构建了新菌株CWD1.证明了以单拷贝形式存在在大肠杆菌染色体CWD1上的ctxb基因能有效的表达CTB蛋白并能将其分泌至细胞外培养液中.结果初步确定了大肠杆菌染色体上的lac操纵子结构基因位点适合外源基因的敲入和表达.     

非随机方法构建酿酒酵母基因工程菌

酿酒酵母是基因工程产品研究和生产的一个重要表达系统,表达载体和宿主细胞是构成表达系统的两大要素,虽然外源基因表达的方式、强度主要由表达载体控制．但宿主细胞的选择对最终获取产品的质量和数量也具有十分关键的作用。酿酒酵母基因工程宿主菌除要求具有高的DNA转化效率、细胞生长密度和稳定性、低的内源蛋白水解酶活性外,还必须具备与表达载体相对应的营养缺陷筛选标记,用传统随机诱变方法得到的营养缺陷变异株,因含有本底和隐性突变,在细胞生长密度和稳定性方面往往不能满足基因工程产品研究和生产的要求,甚至不能有效地表达外源基因。本文报道用重组技术,通过非随机方法构建了酿酒酵母基因工程宿主茁。研究表明用该方法得到的宿主菌在细胞生长密度、稳定性和表达外源基因方面优于用传统随机诱变方法得到的宿主菌。     

重组大肠杆菌YK537/pSB┐TK高密度培养过程中有机酸的RP┐HPLC快速分析

采用高压液相色谱法（ＨＰＬＣ）,利用Ｃ１８反相柱快速检测重组大肠杆菌ＹＫ５３７／ｐＳＢ－ＴＫ高密度发酵过程中细菌代谢产生的各种有机酸。分析表明,经乙醚和水两次萃取处理后能去除样品中大部分的干扰峰,可获得理想的分离效果,并能定量测出发酵过程中各种有机酸的积累。不同培养方式的结果表明用甘油代替葡萄糖作为细菌生长的碳源可减少乙酸的积累,降低其对细菌生长和外源蛋白表达的抑制作用,从而更易实现重组大肠杆菌的高表达、高密度培养。     

破菌时可自动降解宿主核酸的大肠杆菌BL21(DE3)的lpxM突变株构建

研究利用Red同源重组技术对常用大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)进行改良, 构建破菌时可自动降解宿主核酸的大肠杆菌表达宿主菌, 该菌株可望有助于解决因破菌时宿主菌染色体核酸释放给后续纯化重组蛋白工作带来的困难。将N端连有OmpA的信号肽的S. aureus nucleaseB(nucB)表达框整合至E. coli BL21(DE3)的lpxM位点, 改造后菌株(称为BLN)经诱导能表达nucB、并分泌至周质空间, 这样可使宿主核酸免受该酶“毒性”影响, 菌体裂解后, nucB释放,能自动降解宿主核酸。BLN菌体生长状态以及表达外源重组蛋白的能力与出发菌基本一致。