时间分辨荧光分析法在DNA探针检测中的初步应用

应用时间分辨荧光技术进行核酸杂交分析,选用自制整合剂异硫氰酸苯基-EDTA将铕离子标记连接于链霉亲和素分子中,通过光化学反应制备生物素标记pUC118DNA探针,与固定在聚苯乙烯微滴板中的靶DNA杂交后,以铕离子Eu(3+)标记的链霉亲和素为检测物,检测靶DNA的含量,可检测到30pg的靶DNA．     

拟南芥DNA探针的比较基因组原位杂交揭示的拟南芥与远缘植物基因组间的同源性

采用生物素标记的拟南芥基因组DNA探针在75%杂交严谨度下对双子叶植物番茄、蚕豆和单子叶植物水稻、玉米、大麦的染色体进行了比较基因组荧光原位杂交（comparative genomic in situ hybridization,cGISH）分析,以揭示拟南芥与远缘植物基因组间的同源性.cGISH信号代表了拟南芥基因组DNA中的重复DNA与靶物种染色体上同源序列的杂交.探针DNA在所有靶物种的全部染色体上都产生了杂交信号.杂交信号为散在分布,并呈现随基因组增大,杂交信号增多,且分布更加分散的趋势.所有靶物种的核仁组织区（NOR）都显示了明显强于其他区域的杂交信号,表明拟南芥基因组DNA探针可用于植物NOR的物理定位.在所有的靶物种中,信号主要分布在染色体的臂中间区和末端,着丝粒或近着丝粒区有少数信号分布.大麦染色体显示了与C-和N-带不同的独特的cGISH信号带型,表明此探针可用于不同植物染色体的识别.这些结果表明,拟南芥基因组与远缘植物基因组之间,除rDNA和端粒重复序列外,还存在其它同源的重复DNA;一些重复DNA序列在被子植物分歧进化为单子叶和双子叶植物之前就已存在,虽经历了长期的进化过程,至今在远缘物种之间仍保持了较高的同源性.结果还提示,大基因组中古老而保守的重复DNA在进化过程中发生了明显的扩增.     

荧光原位杂交技术在染色体结构研究中的应用

1969年 Gall和 Pardue首先用同位素标记的 RNA探针定位特定的靶 DNA序列 ,开创了原位杂交技术 ,但同位素探针的高背景限制了它对靶序列的精确定位 ,随后发展了一系列非同位素方法 ,最初有生物素探针 ,用荧光素标记亲合素 ,酶联反应或胶体金检测 ,其他包括乙酰氨基荧光素 ( AAF) ,汞 ,地高辛 ( DIG)和 2 -三硝基酚等。荧光原位杂交 ( fluorescence in situ hybridiza-tion FISH)技术就是指将 DNA探针用特殊修饰的核苷酸分子标记 ,通过原位杂交与靶染色体或 DNA上特定的序列结合的方法学 ,靶染色体通常固定在载玻片上 ,杂交结果用荧…     

用于HBV病毒快速诊断的分子信标探针设计

分子信标是一种高灵敏度、高特异性的新型荧光核酸探针.它在与互补DNA或RNA靶序列杂交时放出荧光.利用Genebank中调出已知HBV病毒ayr亚型基因组信息,通过BeaconDesigner4.0软件进行分子信标探针设计,共设计出6条分子信标探针,以便于为目前HBV病毒快速诊断提供参考.     

肠毒原性大肠杆菌(ETEC)不耐热肠毒素(LT)基因探针的研制

经氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心分离纯化重组质粒pMMO 30 DNA 琼脂糖凝肢电泳回收的1．TDNA—HindII片段,用DNA缺口转译技术制备a-32p标记的LT基因探针,与标准ETFC(LT+)杂交为阳性,与非ETEC杂交则无同源性。从腹泻儿童和腹泻病猪粪便中分离的、经兔肠段结扎试验和免疫沉淀测定LT呈阳性的EFEC,与基因探针杂交呈现阳性：而且一个单菌落在硝酸纤维素滤膜上裂解的DNA印迹,与探针杂交可以进行放射自显影。如果采用不同的杂交条件,还可以鉴删测定ETEC的LT基因和霍乱弧菌的CT基因,一次可以进行几百个菌落的测定。结果表明,该探针可以用于实验室诊断和流行病学调查。     

基于纳米金复合探针的基因芯片膜转印检测法

建立了一种基于纳米金复合探针的基因芯片膜转印核酸检测新方法。首先,用纳米金颗粒同时标记检测探针P2和两种长短不同且生物素化的信号探针 (T10,T40),其中检测探针与靶DNA 5￠端互补,两种信号探针起信号放大作用。当靶DNA分子存在时,芯片表面捕捉探针P1 (与靶DNA分子3￠端互补) 通过碱基互补配对原则结合靶DNA分子,将其固定于芯片上,同时检测探针通过与靶DNA 5￠端互补配对将纳米金复合探针结合于芯片表面,结果在芯片表面形成“三明治”结构,后通过链霉亲和素-生物素反应,使芯片表面对应有靶DNA分子的部位结合上碱性磷酸酶,最后利用BCIP/NBT显色系统使芯片表面信号结果镜面转印至尼龙膜表面。当检测探针和信号探针摩尔比为1∶10,T10和T40摩尔比为9:1时可以检测1 pmol/L合成靶DNA分子或0.23 pmol/L结核分枝杆菌16S rDNA PCR扩增产物,检测结果通过普通的光学扫描仪读取或肉眼直接判读信号有无。本芯片检测系统灵敏度高,操作方法简单、快速,不需要特殊仪器设备,在生物分子的检测方面具有较高的应用价值。     

基因组原位杂交的新进展及其在植物中的应用

基因组原位杂交 ( Genomic in situ hybridization GISH)是 2 0世纪 80年代末发展起来的一种原位杂交技术。它最初应用于动物方面的研究[1 ] ,但很快被植物方面所借用 ,并且使用频率高于动物方面的研究。它采用来自一个物种的总基因组 DNA作为标记探针 ,用另一物种的总基因组 DNA以适当的浓度进行封阻 ,在靶染色体上进行原位杂交。在封阻DNA和标记 DNA探针之间 ,封阻 DNA优先与一般序列杂交 ,剩下的特异性序列主要被标记探针所杂交。在此基础上 ,人们先后发展了荧光基因组原位杂交、多色基因组原位杂交和比较基因组原位杂交等技术 ,…     

特异性探针的使用

<正>为了用特异性探针检测检样中病原体的DNA,有必要使DNA相互反应形成双链DNA。在检测双链DNA时,必须预先标记特异性探针。有同位素标记和非同位素标记两种方法。用同位素标记者,在反应后洗去未反应的探针,仅测定放射强度便可。(图1)用非同位素法标记的DNA,在反应后,使之与碱性磷酸酶(ALP),过氧化物酶、β—D半乳糖苷酶等结合,以酶抗体法的原理检测杂交的DNA(图2)。由于最近市售一种与ALP直 (图1)用游离法杂交     

分子生物学技术讲座（五）：放射性标记的DNA和RNA探针的制备

放射性标记的核酸探针（DNA和RNA探针）目前已被广泛地应用于分子生物学的各个领域,例如克隆的筛选,Southern杂交分析,基因表达水平的测定等等。放射性核酸分子探针是指特定的已知核酸分子片段,内含放射性核素（例：‘千、‘H和”S）,并能与被检测的核酸分子退火杂交（核酸序列互补）,因此可用于待测核酸样品中特定基因序列片段的探测。1探针的种类和选择根据核酸分子探针的来源及其性质可将其分成3大类,即：DNA探针、RNA探针和人工合成的寡聚核青酸探针。而DNA探针又可分为基因组DNA探针和。DNA探针。探针的选择是根据不…     

烟草花叶病毒辽宁分离物Northern杂交检测体系的建立

为了建立烟草花叶病毒辽宁分离物(TMV-LN)的高特异性、高灵敏度的分子杂交检测体系,从粗提纯的TMV-LN粒子中提取RNA,设计特异性引物通过RT-PCR扩增TMV-LN的CP和3'端非翻译区域,将片段连至p UC119载体获得重组质粒p UCTMV-PP,体外转录获得地高辛(DIG)标记的TMV-LN正义链RNA杂交检测探针,同时构建DNA检测探针作为对照。采用点印迹(Dot-blot)杂交和Northern杂交对比RNA探针和DNA探针对TMV-LN的检测特异性和灵敏性。检测结果表明,RNA探针和DNA探针在点印记杂交和Northern杂交中均表现出良好的检测特异性,RNA探针在检测灵敏度方面要略好于DNA探针,且点印迹杂交体系在病毒定性方面较为快捷,Northern杂交体系在病毒基因组RNA的定量方面具有明显优势。     

基因芯片技术及其在植物上的应用

基因芯片技术（gene chip technology)是采用光导原位合成或缩微印刷等方法,将大量特定的DNA探针片段有序地固定于固相载体的表面,形成DNA微阵列,然后与待测的标记样品靶DNA或RNA分子杂交,对杂交信号进行扫描及计算机检测分析,从而获取所需的生物信息。该技术在植物研究中广泛应用于寻找特异性相关基因和新基因,基因表达分析,基因突变和多态性检测,DNA测序等。     

生物素标记DNA探针杂交条件探讨

DNA探针技术正越来越广泛地应用于医学基础研究和临床检测.生物素标记探针已在某些领域部分取代同位素标记探针而发挥作用。杂交是DNA探针技术中重要一环.各种杂交条件的变化均会对杂交结果并最终对检测结果产生影响。文献中关于杂交条     

光敏生物素标记总DNA探针对大豆根瘤菌的检测

以光敏生物素标记慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)USDA110总DNA作为探针,与快生型大豆根瘤菌杂交时,没有杂交斑点形成,而与慢生型大豆根瘤菌中的部分菌株能形成杂交斑点,表明该探针具有种和部分菌株特异性,用该探针与压碎的根瘤汁液进行DNA杂交,检测USDA110在不灭菌的盆栽土壤中的竞争结瘤能力,发现USDA110在大豆不同生育期的占瘤率为70%～90%。     

从植物共生菌宏基因组文库筛选新的生物催化酶基因

【目的】通过建立宏基因组文库的高通量保存与基于探针洗脱的多次膜杂交筛选方法,从植物共生菌宏基因组文库筛选具有生物催化潜力的新酶基因。【方法】首先根据滴度将初始文库噬菌体包装颗粒感染到EPI300-T1R E.coli,过夜培养后对应保存于96孔板;提取粘粒进行文库的杂交筛选。【结果】描述的洗脱条件可完全去除尼龙膜上与靶DNA结合的探针,并且尼龙膜上的靶DNA至少可用于7次探针杂交,从而明显提高宏基因组文库的筛选效率。【结论】以Enoate reductase(ER)和短链脱氢酶(SDR)的同源基因片段为探针,运用该方法经两轮筛选获得候选单克隆并进行了部分粘粒的测序,发现了新的ER和SDR同源基因,并克隆到相应的全长基因序列用于后续的表达与酶化学研究。     

电场驱动微悬臂生物传感器及对DNA 的快速、高灵敏度检测

微悬臂列阵传感器在生物检测方面具有快速、痕量和非标记的特性. 我们以镀金并在其上固定了 DNA 探针的微悬臂为正极,在靶杂交液槽内引入另一电极作为负极,构成电场驱动微悬臂 DNA 生物传感器. 对该传感器系统施加静电场,驱动 DNA 分子朝正极迁移,使溶液中的 DNA 分子富集在微悬臂上,促进 DNA 分子的杂交. 结果表明： a. DNA 在微悬臂上的杂交时间仅需 3 min,加快了微悬臂生物传感器对 DNA 分子的检测速度; b. 提高了微悬臂生物传感器的灵敏度,可以检测到皮克级的 DNA 分子.     

酶标探针在转基因植物检测中的应用

采用碱性磷酸酶标记DNA制备分子探针, 并首次在植物中应用。酶在苯醌作用下与单链DNA联结, 形成DNA和酶的共价复合物即酶标探针。此探针通过分子杂交与待测DNA结合, 再与酶的底物作用显色, 3～6h 内可观察结果。用此探针检测转基因植物中的UidA基因, 点杂交和Southern杂交结果表明, 所合成的酶标探针具有快速、准确、安全而经济的优点。点杂交证明外源UidA基因被成功转化到受体植物中, Southern 杂交对转基因的材料检测的结果证明, 该材料包含多个外源UidA基因拷贝, 初步确定其外源UidA基因拷贝数在5个以上。     

~(125)Ⅰ标记乙型肝炎病毒DNA探针的制备及应用

本文报道用国产~125I-碘化钠标记乙型肝炎病毒DNA制备探针,可得到较高比度的产物,一般稳定在10~7—10(?)cpm/μg DNA。用该探针对不标记的乙型肝炎病毒DNA进行点分子杂交。可检测到5pg左右DNA。对17例血液标本进行点分子杂交,结果与32p-标记乙型肝炎病毒DNA探针杂交结果基本一致。     

荧光探针研究新进展

自从Southern(1975)首次进行DNA探针杂交后,至今核酸分子杂交已成为分子生物学的最基本方法。Matthews和Kricka[1]总结了各种杂交方法,将其归为两大类:一是异相杂交(heterogeneousassay)即固相杂交,目的核酸结合于不溶性支持物上;二是同相杂交(homogeneousassay)即液相杂交,一般同时使用两个探针。为了检测杂交,寡核苷酸探针需要标记,探针的标记物有放射性同位素和非放射性标记物。固相杂交常使用放射性同位素,荧光素是一种非放射性标记物,它能检测到的DNA浓度比吸收减色测定方法所需DNA浓度低100-1000倍[2],在同相杂交中广泛用于探针的标记。最近,荧光探针研究获得了新的进展,Tyagi和Krammer(1996)建立了一种新的荧光探针-分子信标探针,并得到许多应用,我们实验室也开展了这方面的研究。本文拟对荧光探针的研究进展作一综述。     

克隆化反向杂交探针的制备

反向斑点杂交是将寡核苷酸探针固定在膜上,用标记的靶序列与固定在膜上的探针进行杂交．与正向杂交相比,它通过一次杂交即可确定多种基因型,是一种快速筛查DNA点突变的诊断方法.我们选择β－地中海贫血基因-28 (A→ G), CD17 (A→T) and CD41～42 (-TTCT) 三种点突变为模型采用PCR扩增产生串联多拷贝序列探针并将其克隆化．将克隆化探针固定于尼龙膜上,与同位素标记的β－珠蛋白基因PCR片段进行杂交,检测β－地贫患者的基因型．     

间隔臂和探针长度与寡核苷酸芯片重复性相关性研究

研究寡核苷酸芯片的重复性与间隔臂（spacer）和探针长度之间的相关性。设计12条不同长度的带有不同spacer的探针,与749bp荧光标记靶序列杂交。扫描分析三次杂交结果,用Quantrray定量分析软件进行分析,随探针长度的延长,杂交信号的变异系数逐步降低,15mer的探针杂交的信号较弱,杂交不够稳定,重复性也相对较差,20mer、25mer、30mer的探针的变异系数逐渐降低。spacer为15时变异系数最小。说明选择spacer为poly（dT）15的25mer和30mer的探针可以获得较好的重复性。