哈尔滨和湛江雄性褐家鼠Gsk3β差异甲基化区域DNA序列多态性分析与调控功能鉴定

糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase 3β, Gsk3β）基因能够参与多条细胞周期信号传导通路,从而通过调控细胞分裂过程,影响组织与器官的发育。本实验室前期研究发现,与湛江褐家鼠种群相比,哈尔滨褐家鼠种群在秋冬季存在睾丸发育受抑制的现象,并通过基因组与甲基化组联合分析,在Gsk3β基因内含子区域筛选到1个差异甲基化区域（differentially methylated region, DMR）。为分析该DMR 的DNA序列多态性及其在Gsk3β基因表达调控中的可能作用,本研究选取了哈尔滨（n=52）和湛江（n=39）共91个性成熟褐家鼠睾丸样品。采用PCR测序方法在群体水平上分析了该DMR的DNA序列多态性,在2个褐家鼠亚种的分化特征,并选取2个群体中具有代表性的单倍型,通过荧光素酶基因报告系统在293T细胞中检测该DMR不同单倍型的调控活性。结果表明,该DMR存在2个SNP位点,共组成3个单倍型、6个基因型。卡方检验表明,其频率在2个群体间发生显著分化（单倍型,P=1.13E-29;基因型,P=1.15E-14）。Gsk3β基因的-2 218/+238 bp区具有明显启动子活性（P<0.05）;哈尔滨和湛江2个单倍型都显示显著的沉默子活性（P<0.05）,同时表现显著的调控活性差异（P<0.05）,表明这2个单倍型可以在293T细胞中作为沉默子抑制Gsk3β基因的启动子活性。2个单倍型调控活性差异,可能与SNP导致的转录因子结合位点的获得/丢失,以及2个单倍型在不同种群中甲基化状态差异有关。本研究结果表明,该DMR可能通过调控褐家鼠Gsk3β基因表达,在睾丸发育过程中发挥作用。2个种群主要单倍型的调控活性差异,及其甲基化状态差异可能是2个种群睾丸发育表型差异的重要调控因素之一。     

转基因动物与基因表达调控的研究

十余年来,随着转基因技术的快速发展,基因表达调控的转基因研究已逐渐开展。本文在下列几方面介绍了转基因动物技术在基因表达调控中的应用。转基因动物可作为在体内研究外源基因表达调控的“反应器”,例如研究酶对底物作用的种属特异性。可以精确研究ＤＮＡ顺式作用序列,探讨包括改变基因表达在内的组织和阶段特异性表达,增强子、内含子和核基质附着区的调节作用以及各基因间相互作用。转基因动物可研究发育中的时、空调节（如β－珠蛋白基因和同源异形盒基因）以及基因多级调节系统。通过同源重组得到基因缺陷动物（基因敲除动物）可探讨目的基因突变所致的异常表型以研究基因功能与调控。     

TEC酪氨酸激酶基因是一种与肝再生调控相关的早期反应基因

 肝再生过程中立即早期反应基因的表达在成熟肝细胞由G0 期向G1期的转变中起着关键作用 .为探讨肝再生早期基因表达的变化 ,利用表达性差异显示分析 (RDA)技术研究了 2 3肝部分切除后 1h再生肝选择性基因表达 ,发现一株TEC酪氨酸激酶同源序列存在于差减产物中 ,RNA狭缝杂交证实确为差异表达基因 .从大鼠肝cDNA文库中分离其全长cDNA ,序列分析结果表明 ,该基因为小鼠 人TEC酪氨酸激酶的同源体 ,进而以该cDNA为探针 ,用Northern杂交证实 2 3肝部分切除后TEC酪氨酸激酶基因在 1h内呈现瞬间表达增加 ,其表达水平较基础水平增高 2 5倍 ;在原代培养大鼠肝细胞体系中 ,EGF可迅速诱导TEC基因表达 ,且不被蛋白合成抑制剂阻断 .结果表明 ,TEC基因是一种与肝再生调控密切相关的早期反应基因 .     

不同调控序列作用下GUS基因在烟草中瞬时表达活性

以pB1121为出发质粒,利用烟草泛素启动子Ubi．U4、CaMV35S启动子以及Kozak序列构建4种GUS基因表达载体,通过叶盘转化法转化烟草叶片,检测瞬时表达活性,研究不同调控序列对外源基因表达的调控作用。结果表明：CaMV35S启动子附加Kozak序列后使GUS活性比独立使用CaMV35S提高了近2倍：双CaMV35S启动子附加Kozak序列驱动GUS基因的表达活性与单CaMV35S附加Kozak序列相当;烟草泛素启动子附加Kozak序列的表达活性为CaMV35S启动子附加Kozak序列的1．5倍;Ubi．U4-CaMV35S复合启动子附加Kozak序列驱动GUS基因表达水平最高,其表达效率是双CaMV35S启动子附加Kozak序列调控下GUS表达效率的3倍,为CaMV35S独立作用时的10倍。     

中华猕猴桃和美昧猕猴桃的倍性变异及地理分布研究

根据已有的猕猴桃自然地理分布资料,通过对中华猕猴桃（Actinidia chinensis）和美味猕猴桃（A．deliciosa）野外分布居群的详细调查,利用流式细胞技术对我国西部高原台地向中东部丘陵平原过渡地带6个纯中华猕猴桃、1个纯美味猕猴桃和5个中华／美味猕猴桃同域分布居群共276个个体的倍性进行了检测。结果表明：（1）中华猕猴桃存在二倍体和四倍体,美味猕猴桃存在四倍体、五倍体和六倍体;（2）中华猕猴桃和美昧猕猴桃在经度和纬度的分布上存在显著差异（P〈0．05）,中华猕猴桃在经度上偏东分布而美味猕猴桃偏西,纬度分布上中华猕猴桃偏南而美味猕猴桃偏北;而且不同倍性小种在经、纬度分布上呈现显著差异（P〈0．05）,二倍体、四倍体、六倍体的分布在经度上依次从东到西、纬度上从南到北;（3）中华猕猴桃和美味猕猴桃不同倍性小种的海拔分布存在显著性差异（P〈0．05）,二倍体小种分布海拔最低,四倍体小种次之,六倍体小种海拔分布最高,但通过LSD分析四倍体个体和六倍体个体在海拔分布上不存在显著差异（P〉0．05）。通过对中华／美味猕猴桃这两种具有重要经济价值的果树的倍性变异及地理分布的探讨,提出了猕猴桃倍性小种分布的上述规律并给猕猴桃种质资源收集、评价、创新和可持续利用方面提供了初步的研究基础,尤其是为我国猕猴桃新品种选育提供了基础数据和科学依据。     

中华猕猴桃和美味猕猴桃的倍性变异及地理分布研究

根据已有的猕猴桃自然地理分布资料,通过对中华猕猴桃（Actinidia chinensis）和美味猕猴桃（A．deliciosa）野外分布居群的详细调查,利用流式细胞技术对我国西部高原台地向中东部丘陵平原过渡地带6个纯中华猕猴桃、1个纯美味猕猴桃和5个中华／美味猕猴桃同域分布居群共276个个体的倍性进行了检测。结果表明：（1）中华猕猴桃存在二倍体和四倍体,美味猕猴桃存在四倍体、五倍体和六倍体;（2）中华猕猴桃和美昧猕猴桃在经度和纬度的分布上存在显著差异（P〈0．05）,中华猕猴桃在经度上偏东分布而美味猕猴桃偏西,纬度分布上中华猕猴桃偏南而美味猕猴桃偏北;而且不同倍性小种在经、纬度分布上呈现显著差异（P〈0．05）,二倍体、四倍体、六倍体的分布在经度上依次从东到西、纬度上从南到北;（3）中华猕猴桃和美味猕猴桃不同倍性小种的海拔分布存在显著性差异（P〈0．05）,二倍体小种分布海拔最低,四倍体小种次之,六倍体小种海拔分布最高,但通过LSD分析四倍体个体和六倍体个体在海拔分布上不存在显著差异（P〉0．05）。通过对中华／美味猕猴桃这两种具有重要经济价值的果树的倍性变异及地理分布的探讨,提出了猕猴桃倍性小种分布的上述规律并给猕猴桃种质资源收集、评价、创新和可持续利用方面提供了初步的研究基础,尤其是为我国猕猴桃新品种选育提供了基础数据和科学依据。     

药物诱导玉米远缘杂种雌配子体产生异源种质纯系(英文)

中国玉米种质资源少,只有远缘杂交才有可能获得遗传多样性。但是,远缘杂交Ｆ２的疯狂分离,使得一个优良性状的稳定往往需要经过多代选择,耗时费力。我们利用从孤雌生殖产生的纯合２倍体,仅２～３年即选育出了优良异源种质纯系５４０（Ｆｉｇ．１）,而常规育种至少要５～６年。本工作选用ｚｉ３３０,旋９,ＭＯ１７,黄早４等自交系与远缘种属２倍体多年生类玉米（ＤＰ）杂交,将其Ｆ１的ＢＣ１去雄,在花丝上喷撒ＭＨ,ＤＭＳＯ,ＰＥＧ,诱导孤性生殖。纯系５４０的株高、穗位、穗长等农艺性状（Ｆｉｇ．３）优于ＤＰ（Ｆｉｇ．２）,但其抗逆性优于亲本ｚｉ３３０。染色体分带结果：纯系５４０（Ｆｉｇ．６）的总带数为８,与亲本（Ｆｉｇ．４＆５）相同。但其Ｃ带特征,一方面,兼有二者的特点,如：第２对同源染体的一条染色体长臂,和第５对同源染色体的两条长臂均表现ＤＰ的Ｃ带特征,为异染色质末端带;另一方面,出现两者之间没有的现象,如：第８对同源染色体的长臂近末端显示异染色质带,为同型配对,而ｚｉ３３０的笫８对同源体不显带。这可能是染色体重组的结果。     

不同倍性西瓜基因组DNA甲基化水平与模式的MSAP分析

DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式之一,在基因表达调控中发挥重要作用。本研究以不同倍性（2x、3x、4x）西瓜为试材,采用基于DNA甲基化敏感酶的扩增多态性分析（Methylation-Sensitive Ampliftcation Polymorphism,MSAP）方法,在全基因组水平上探究西瓜同源多倍化过程中DNA序列中CCGG位点的甲基化水平及模式变化特征。研究中选用23对选扩引物,共检测到1883个基因位点。二倍体、三倍体、四倍体中检测到的位点数分别为647、655和581;其中发生甲基化的位点数分别为181、150和159。相应的扩增总甲基化率分别为28．0％、22．9％和27．4％：全甲基化位点数分别为121、80和82,相应的全甲基化率分别为18．7％、12．2％和14．1％。进一步对不同倍性西瓜DNA甲基化模式的变化特征进行分析,结果显示：四倍体西瓜与二倍体西瓜相比有超过半数的位点（54．4％）DNA甲基化模式发生了变化,其与三倍体西瓜相比也有近一半的位点（45．4％）DNA甲基化模式发生了变化,并且变化趋势都以四倍体西瓜甲基化程度升高为主：而三倍体西瓜与二倍体西瓜相比．虽然也有41．6％的位点DNA甲基化模式发生了改变,但变化趋势以三倍体西瓜甲基化程度降低略占优势：与之相似,三倍体西瓜与四倍体相比较。甲基化的变化趋势也是以三倍体西瓜甲基化程度降低为主。以上结果表明：不同倍性西瓜中DNA甲基化事件虽均有发生．但不论是从总甲基化率还是全甲基化率来看,DNA甲基化水平与倍性高低关系不大．三倍体西瓜表现出较为显著的低甲基化水平特征。DNA甲基化模式的分析也表明。与二倍体及四倍体西瓜相比．三倍体西瓜DNA甲基化模式的调整主要以去甲基化为主。显示出三倍体西瓜基因组独特的DNA甲基化特征。本研究为进一步从表观遗传学的角度探讨西瓜的三倍体优?     

调控通路内基因表达的相关性分析

本研究从基因表达调控通路的角度分析了基因功能与基因表达之间的关系,利用7套酿酒酵母基因芯片表达谱数据和通路数据库（KEGG和CYGD）所提供的信息,应用我们研制的Genehub软件分析研究了同一基因表达调控通路内的基因在mRNA表达水平上的相关性,共涉及16条通路,495个基因。通过Pearson相关系数和Spearman相关系数两种相似性测度的分析,我们发现有94%（15条）的基因表达调控通路内的基因在大于等于4套的表达谱数据中是共表达的,以上结果从基因表达调控通路的角度,证实了基因功能与基因表达之间存在着一定的相关性。     

GTL2基因在体细胞核移植牛中的印记状态分析

体细胞核移植技术（SCNT）在医学研究、畜牧业生产和拯救濒危动物方面有重要的应用价值,而核移植效率低是制约其应用的主要因素．印记基因在哺乳动物胚胎发育和出生后的正常生长中都具有十分重要的作用,GTL2基因是在人和鼠中已被鉴定的印记基因,它作为一种RNA调解分子调控目的mRNA的转录．为了研究GTL2基因在自然繁殖牛和体细胞核移植牛中的印记状态,首先应用PCR-SSCP方法对GTL2基因多态性进行检测,鉴定自然繁殖牛和体细胞核移植牛中的杂合子,进而利用RT-PCR-SSCP技术对GTL2基因在杂合子牛的心、肝、脾、肺、肾、大脑中的表达状态进行分析．研究结果表明：GTL2基因在自然繁殖牛的被检测的6个组织中均表现为单等位基因表达,在体细胞核移植牛的心和肝中表现为单等位基因表达,而在大脑、脾、肺、肾中为双等位基因表达,GTL2基因在体细胞核移植牛的部分组织中表达紊乱有可能是造成体细胞核移植牛器官发育异常和核移植效率低下的原因之一．     

多个顺式作用元件调节血管紧张素原基因表达

血管紧张素原是最强的血管活性物质——血管紧张素Ⅱ的唯一前体,在不同的生理和病理条件下,其水平各异．为了研究血管紧张素原基因表达的调控,将人血管紧张素原基因５′端侧翼序列１．２ｋｂ同氯霉素乙酰转移酶（ＣＡＴ）基因编码序列连接,构成表达载体,并且在此基础上构建５′端系列缺失的突变表达载体,用这些表达载体转染ＨｅｐＧ２和ＣＯＳ－７,确定了正负调控元件;同时应用ＤＮＡ－蛋白质凝胶泳动检测技术,发现核蛋白质与该顺式元件的结合,从而证明多个顺式作用元件调节血管紧张素原基因的表达．     

缺氧条件下肠毒性大肠杆菌hns和stpA基因敲除以及对LT毒素表达调控的研究

本研究首先利用Red同源重组系统对肠毒性大肠杆菌H10407/Δhns进行stp A基因敲除并进行验证。随后在模拟肠内缺氧环境条件下,研究H10407/Δhns单基因敲除和H10407/Δhns/Δstp A双基因敲除对肠毒性大肠杆菌LT毒素表达的调控影响,并利用hns基因表达载体进行功能回补实验。结果发现,Red重组系统能够高效的完成肠毒性大肠杆菌hns和stp A基因敲除;在体外有氧条件下hns基因敲除有效促进了LT毒素的表达;而在缺氧条件下,hns和stp A双敲除有效促进了LT毒素的表达,但H-NS功能回补的hns单敲除株不能有效抑制LT毒素的表达。结果表明H-NS与Stp A对LT毒素表达调控具有重要作用,而且有氧与缺氧环境中发挥作用存在差异。     

不同调控序列作用下GUS基因在烟草中瞬时表达活性的研究

以pBI121为出发质粒, 利用烟草泛素启动子Ubi.U4、CaMV35S启动子以及Kozak序列构建4种GUS基因表达载体,通过叶盘转化法转化烟草叶片, 检测瞬时表达活性, 研究不同调控序列对外源基因表达的调控作用。结果表明: CaMV35S启动子附加Kozak序列后使GUS活性比独立使用CaMV35S提高了近2倍; 双CaMV35S启动子附加Kozak序列驱动GUS基因的表达活性与单CaMV35S附加Kozak序列相当; 烟草泛素启动子附加Kozak序列的表达活性为CaMV35S启动子附加Kozak序列的1.5倍; Ubi.U4-CaMV35S复合启动子附加Kozak序列驱动GUS基因表达水平最高, 其表达效率是双CaMV35S启动子附加Kozak序列调控下GUS表达效率的3倍, 为CaMV35S独立作用时的10倍。     

双胚苗水稻中单倍体与二倍体基因表达芯片分析

本研究运用基因芯片技术,对双胚苗水稻SARⅡ-628品系中的单倍体及其对应二倍体的RNA水平的表达变化情况进行对比分析,发现单倍化后基因表达迅速发生了不同程度的变异,主要结果如下：（i）单倍化后,表达变化的序列占水稻总探针序列的2．47％,随机分布在水稻的12条染色体上,激活的序列数量多于沉默的：（ii）有33个序列在染色体上的分布具有成簇分布的特点;（iii）对单倍化中已经预测功能的575条序列进行功能分类,发现都涉及了生物过程、细胞成份和分子功能这3个方面．SNF2家族中控制转录调节的位点表达下降居多;与DNA重组修复相关的RAD54家族中只有2个位点分别发生了表达上升和降低的变化;（iv）采用RT．PCR验证基因芯片的结果,总体上83．78％序列表达结果与芯片结果相符;任选7个极端（激活和沉默）表达方式的序列,其表达结果与芯片相符率达到91．86％．     

六倍体小黑麦与普通小麦杂交的细胞遗传学研究

利用六倍体小黑麦与普通小麦杂交,Ｆ１具有两个单倍体染色体组（Ｄ、Ｒ）,在减数分裂时,单倍的染色体组（Ｄ、Ｒ）可产生较多的单价体断裂与再融合。可诱发染色体易位,同时在杂种自交的情况下探讨单倍的Ｄ、Ｒ染色体组的遗传规律性与染色体组的再形成。１材料与方法１...     

利用RNAi技术沉默小菜蛾类钙粘蛋白基因

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是一种调控基因表达的方法, 其通过体外合成一段与内源靶基因同源的双链RNA（dsRNA）或siRNA, 导入生物体内, 使内源靶基因中同源mRNA降解, 从而达到阻抑基因表达的目的。类钙粘蛋白（cadherin-like protein）是位于昆虫中肠刷状缘膜囊(brush border membrane vesicles, BBMV)上与钙粘蛋白(cadherin)结构相似的物质, 是多种昆虫体内Bt杀虫蛋白的受体。本研究利用基因特异引物通过RT-PCR扩增了小菜蛾类钙粘蛋白基因的2个片段（CAD1和CAD2）, 合成相对应的双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）; 并将dsRNA通过显微注射导入小菜蛾3龄幼虫体内, 测定了不同靶位点、不同剂量、不同检测时间对目的基因mRNA表达量的影响。结果表明: 将70 nL CAD1对应的dsRNA注射到幼虫体内48 h后, 基因表达量显著下降, 72 h后恢复。免疫印迹检测结果表明, 类钙粘蛋白在注射dsRNA 48 h后幼虫BBMV中的含量明显下降。本实验成功实现了小菜蛾类钙粘蛋白基因的沉默, 该体系的成功建立为利用RNAi技术分析小菜蛾及其他鳞翅目昆虫基因的功能提供了参考。     

拟南芥基因组中新的microRNA预测及分析

MicroRNA（miRNA）是一类存在于动植物体内、长度为21～25nt的内源性小RNA,对生物体的转录后基因调控起着关键作用,但一些低丰度的miRNA和组织特异性miRNA往往很难发现。为了系统识别拟南芥基因组中新的非同源miRNA,首先基于已报道的拟南芥miRNA的特征,从全基因组范围中筛选出453条可能的miRNA前体;其次,为了进一步对上述miRNA前体进行筛选,利用人的miRNA前体数据构建了支持向量机模型GenomicSVM,该模型对人测试集的敏感性和特异性分别为86.3％和98．1％（30个人miRNA前体和1000个阴性miRNA前体）,对拟南芥测试集的正确率为93．6％（78个miRNA前体）;最后,利用GenomicSVM预测上述453条miRNA前体序列,得到了37条候选的新的拟南芥miRNA前体,为进一步的miRNA实验发现研究提供了指导。     

脱落酸应答基因的结构,表达调控及信号转导

许多脱落酸应答的基因已被克隆,并已研究了一些基因的调控。其启动子有G－box和ABARE顺式元件。ABARE与Leuzippier（亮氨酸拉链蛋白）互相作用,ABA与某些基因产物结合以及蛋白质磷酸化在基因表达调控中起重要作用。ABA涉及的信号转导是多途径或单途径的。文中讨论了ABA应答基因的结构、表达调控及信号转导的研究方向。     

MicroRNA对动脉粥样硬化发生的调控作用及其临床应用

MicroRNA（miRNA）是新发现的基因表达调控因子,由长约21～25个核苷酸的单 链RNA分子构成,是非编码小RNA. 它可以通过与特定mRNA的3′非翻译区（3′- untranslated region,3′UTR）相结合,抑制mRNA编码蛋白质的翻译过程来调控基因表达. 动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一种慢性炎症性疾病,是多种心血 管疾病的病理基础.最近,研究发现多个miRNA与动脉粥样硬化的发生发展有关, 且其在血液和体液中稳定存在并高度保守. 本文主要综述了miRNA对动脉粥样硬化进程的调节作用及以其为靶点的相关临床研究,旨在阐明miRNA成为动脉粥样硬化诊断与治疗新靶点的重要意义.     

miRNA，siRNA，saRNA与基因表达调控

近年来的研究发现,生物体内存在着大量的非编码RNA（non．codingRNAs,ncRNA）,它们在染色质修饰、基因转录、RNA剪接和mRNA翻译等多种水平上参与了基因表达的调控。ncRNA中的小分子RNA如miRNA能够识别特定的目标mRNA,通过与mRNAs3’非翻译区结合,影响mRNA转录及蛋白质翻译;siRNA是RNA干扰的引发物,能够导致与dsRNA同源的mRNA降解,进而抑制相应基因表达;saRNA是目前最新发现的一种靶向目的基因启动子区的在转录水平激活目的基因表达的dsRNA。miRNA、siRNA和saRNA在生成机制、作用途径等方面关系密切,既区别又相互联系,小分子RNA的研究将是今后分子生物学的研究热点之一。