热休克蛋白27增强A型流感病毒NS1对β干扰素的抑制作用

热休克蛋白27(Heat shock protein 27,HSP27)是一种具有多重功能的小热休克蛋白,它在一些病毒的生命周期中也发挥着重要作用。为研究HSP27对流感病毒感染的调节作用,首先在原核及真核细胞中克隆并表达了人源的HSP27蛋白,并验证了HSP27和A型流感病毒NS1蛋白能够相互结合。通过荧光素酶检测试验发现,HSP27可以抑制病毒感染细胞中β干扰素(IFN-β)的表达,但不依赖于其自身的磷酸化状态,而且HSP27与NS1共同对于IFN-β的表达具有叠加抑制效果。进一步的结果表明HSP27可能通过RIG-I样RNA解旋酶(RLH)途径中MDA5因子抑制IFN-β的表达。研究表明,HSP27在被感染细胞的天然免疫中发挥一定作用,有助于进一步阐明宿主因子对于流感病毒感染的调节机理。     

真菌次级代谢产物11’-deoxyverticillin A（C42）通过降低自噬基因的表达抑制肝炎病毒（HBV）复制

C42属于epipolythiodioxopiperazines（ETPs）二酮呱嗪类化合物,具有多种生物学活性,包括抑制病毒复制;不过其对hepatitis B virus（HBV）复制的影响及机理鲜有报道。自噬是广泛存在于真核细胞、通过溶酶体降解长半衰期蛋白的现象,参与多种生理、病理过程。有研究发现自噬对HBV的复制至关重要。C42是否通过改变自噬来影响此病毒的复制目前还未见报道。在该研究中,我们发现表达HBV基因组的HepG2.215细胞较原始的HepG2细胞,自噬体明显增加并伴随着Akt磷酸化的增高。C42可以降低自噬基因LC3-II和p62的水平,同时会影响Akt信号通路。氯喹是一种自噬抑制剂,它的存在可以抑制C42导致的LC3-II降低,表明C42可以引起该细胞的自噬。敲降自噬基因和抑制Akt磷酸化均可以减少HBV-X蛋白表达。而利用氯喹抑制自噬体与溶酶体的融合却提高了HBV-X蛋白水平。由于HBV-X对该病毒的复制至关重要,因此,我们认为,C42通过自噬和Akt信号通路来抑制HBV的复制。     

真菌次级代谢产物11’-deoxyverticillin A(C42)通过降低自噬基因的表达抑制肝炎病毒(HBV)复制

C42属于epipolythiodioxopiperazines(ETPs)二酮呱嗪类化合物,具有多种生物学活性,包括抑制病毒复制;不过其对hepatitis B virus(HBV)复制的影响及机理鲜有报道。自噬是广泛存在于真核细胞、通过溶酶体降解长半衰期蛋白的现象,参与多种生理、病理过程。有研究发现自噬对HBV的复制至关重要。C42是否通过改变自噬来影响此病毒的复制目前还未见报道。在该研究中,我们发现表达HBV基因组的Hep G2.215细胞较原始的Hep G2细胞,自噬体明显增加并伴随着Akt磷酸化的增高。C42可以降低自噬基因LC3-II和p62的水平,同时会影响Akt信号通路。氯喹是一种自噬抑制剂,它的存在可以抑制C42导致的LC3-II降低,表明C42可以引起该细胞的自噬。敲降自噬基因和抑制Akt磷酸化均可以减少HBV-X蛋白表达。而利用氯喹抑制自噬体与溶酶体的融合却提高了HBV-X蛋白水平。由于HBV-X对该病毒的复制至关重要,因此,我们认为,C42通过自噬和Akt信号通路来抑制HBV的复制。     

TRIM21对脑心肌炎病毒的增殖调控作用研究

TRIM21是三基序蛋白家族的成员之一,与多种病毒的复制增殖相关,但其与EMCV感染的研究机制尚不明确。该研究采用脂质体介导法将构建成功的TRIM21的真核表达质粒pcDNA3.1-TRIM21以及针对该靶点的小RNA干扰序列瞬时转染至HEK293和HeLa细胞,探讨细胞内TRIM21的表达对脑心肌炎病毒复制增殖的影响,并进一步进行机制研究。结果显示, TRIM21在细胞中成功过表达; EMCV感染24 h后进行检测,结果证明,过表达TRIM21组病毒滴度、病毒拷贝数及病毒蛋白均低于对照组。RNA干扰实验下调TRIM21后,病毒滴度、病毒拷贝数及病毒蛋白显著高于对照组。此外,机制研究提示, TRIM21可正调节II型干扰素及促炎性因子IL-6的转录,从而抑制EMCV的增殖。以上结果表明, TRIM21与EMCV的复制增殖密切相关,可能通过对IFN信号通路部分蛋白及促炎性因子的调控参与对病毒复制增殖的影响。     

非编码RNA调控流感病毒复制的作用及相关机制研究进展

流感病毒是一种重要人畜共患病,严重危害人类健康和畜牧业发展。A型流感病毒（Influenza A Virus, IAV）在宿主细胞内的复制受到多种因素的影响和调节,近年来的研究证明,非编码RNA(ncRNA),包括miRNA、LncRNA、CirRNA等,在流感病毒复制过程中起到重要的调控作用。ncRNA调控流感病毒复制有直接途径和间接途径两种,其中直接途径为直接作用于病毒的vRNA或mRNA,在转录或翻译水平影响病毒的复制。间接途径为作用于细胞内不同的信号通路,通过影响细胞因子合成、诱导宿主细胞凋亡、引起细胞自噬反应等途径,影响病毒的复制。通常情况下,由宿主编码的ncRNA能够抑制病毒的复制,而由病毒编码的ncRNA能够减弱宿主细胞的抗病毒反应,促进病毒复制。通过总结和梳理近年来关于ncRNA调控流感病毒复制的研究,我们发现ncRNA能够作为调控增强宿主细胞抗病毒免疫、下调病毒转录和翻译的工具,有望开发成为抗流感病毒靶向药物。后续的机制研究应不局限于某一种或几种ncRNA的作用,而应在ncRNA在宿主细胞内的分泌机制、调控的分子网络等方面进行深层次的探究。     

Caveolin-1在EMCV感染宿主细胞中的作用

脑心肌炎病毒(EMCV)是一种重要的人畜共患病病原,但其致病机制目前尚不明确,小窝蛋白-1(Caveolin-1)可介导多种病毒感染宿主细胞。为了探究Caveolin-1在EMCV感染宿主细胞中的作用,该实验检测了EMCV感染不同时间段He La细胞中Caveolin-1的表达量,对He La细胞和HEK-293细胞中Caveolin-1进行瞬时过表达实验、瞬时沉默实验和Caveolin-1依赖型内吞途径抑制实验,然后观察EMCV对He La细胞和HEK-293细胞的感染情况。结果发现, HeLa细胞中Caveolin-1表达量会随病毒感染时间的增加而升高;在Caveolin-1瞬时过表达实验结果中,病毒滴度、病毒拷贝数、病毒蛋白检测结果均显示,上调Caveolin-1促进EMCV感染宿主细胞, Caveolin-1瞬时沉默实验和Caveolin-1依赖型内吞途径抑制实验的结果则显示,下调Caveolin-1或抑制Caveolin-1依赖型内吞途径可抑制EMCV感染宿主细胞。上述现象提示, EMCV可通过Caveolin-1依赖型内吞途径感染宿主细胞。     

lncRNA Tmevpg1对小鼠自噬和JAK-STAT信号通路关键信号分子表达水平的影响

该文主要研究lncRNA Tmevpg1对小鼠自噬和JAK-STAT信号通路关键信号分子等相关分子表达水平的影响。该研究利用生物信息学分析构建Tmevpg1、JAK-STAT信号通路及自噬互作调控网络;雷帕霉素(rapamycin, Rapa)和氯喹(chloroquine, CQ)构建小鼠自噬模型;通过细胞共培养技术构建Tmevpg1过表达与干扰细胞模型; qRT-PCR(quantitative real-time PCR)检测小鼠脾脏和细胞模型中Tmevpg1等相关分子的RNA水平, Western blot检测自噬相关蛋白、T-bet和JAKSTAT通路关键信号分子磷酸化蛋白表达水平。结果显示, Tmevpg1、IFN-γ、T-bet、STAT1和JAK1在自噬发生的一定时间点内显著上调(P0.001);过表达Tmevpg1后ULK1表达上调(P0.05), p62下调(P0.05), IFN-γ、T-bet、JAK1以及STAT1表达未发生明显改变,而干扰Tmevpg1后IFN-γ、T-bet、JAK1以及STAT1表达减少(P0.05); Western blot结果显示小鼠自噬模型构建成功, T-bet、p-STAT1和p-JAK1表达趋势与m RNA水平一致;过表达Tmevpg1可上调ULK1和LC3-Ⅱ,下调p62,同时干扰Tmevpg1后T-bet、p-JAK1和p-STAT1表达水平下降。该项研究结果表明, lncRNA Tmevpg1和JAKSTAT信号通路对细胞自噬发挥重要调控作用。     

宿主miRNA参与甲型流感病毒复制调控研究进展

流行性感冒（简称“流感”）是由流感病毒引起的急性呼吸道传染疾病,据世界卫生组织统计,流感每年可导致300万～500万严重病例,其中29万～65万病例死亡,给社会带来沉重的经济负担,是一个世界性的公共卫生难题。研究发现宿主细胞中存在多条信号通路参与对流感病毒感染的应答,越来越多的研究表明宿主miRNAs通过直接或间接的方式,在流感病毒感染、复制的不同阶段发挥着重要调控作用。本文综合分析了目前关于宿主细胞miRNA对流感病毒复制调控的研究进展,对不同的miRNA具体的调控机制进行系统地归类总结后发现：甲型流感病毒（Influenza A virus,IAV）的PB1、PB2、NA、NP、M1基因是宿主miRNA直接抑制病毒复制的主要靶基因,而在间接调控过程中宿主miRNA主要作用在RIG-I样受体信号通路,Jak-STAT信号通路和Toll样受体信号通路三条流感病毒应答信号途径中,以上发现将更有助于全面理解宿主miRNA对于流感病毒调控网络和宿主细胞与流感病毒的互作机制。     

转谷氨酰胺酶2通过mTOR通路和自噬调控全反式维甲酸诱导的白血病细胞HL60和U937的髓系分化

全反式维甲酸(ATRA)是具有融合基因PML-RARα的急性早幼粒细胞白血病(APL)特异的靶向治疗药物。此外，ATRA在无PML-RARα融合的急性髓系白血病及其它一些肿瘤中也有一定治疗效果。但ATRA治疗也会引起一些并发症或发生愈后复发。因此，对ATRA诱导分化调控机制的研究非常重要。转谷氨酰胺酶2(TGM2)是一种多功能酶，能调控mTOR信号通路和自噬等。ATRA能诱导APL细胞中TGM2表达上调，TGM2敲低抑制ATRA诱导的细胞分化。但其调控机制及涉及的信号通路尚不明确。本研究发现，在HL60和U937细胞中，ATRA能够上调CD11b和TGM2的表达(P<0.05),抑制mTOR信号通路，并增强自噬；与对照相比，敲低TGM2,mTOR信号通路增强，自噬被抑制，而ATRA诱导的CD11b表达被抑制(P<0.05),分化减弱，被ATRA抑制的mTOR信号通路得到部分恢复，而被ATRA增强的自噬适当减弱。这表明ATRA使HL60和U937细胞发生髓系分化，并诱导TGM2表达升高；而TGM2通过mTOR信号通路和自噬途径调控ATRA诱导的髓系分化。该研究将有利于更深入地...     

猪流行性腹泻病毒nsp1蛋白对Ⅰ型干扰素应答的影响

猪流行性腹泻病毒 (PEDV) 能抑制宿主Ⅰ型干扰素及其诱导的细胞抗病毒免疫应答,但是PEDV抑制Ⅰ型干扰素应答的分子机制尚不明了,尤其是PEDV非结构蛋白 (Nonstructural proteins,nsps) 在Ⅰ型干扰素应答中的调控作用研究不多。为研究PEDV非结构蛋白1 (nsp1) 对细胞Ⅰ型干扰素应答的影响,构建了真核表达载体pCAGGS-nsp1,采用Western blotting和间接免疫荧光试验确定nsp1在细胞中的表达。通过报告基因法、ELISA以及病毒复制抑制试验评估nsp1对Ⅰ型IFN的影响。结果显示,nsp1在转染细胞和病毒感染细胞中均高效表达;双荧光报告基因试验结果表明,nsp1能显著抑制IFN-β启动子活性,且具有剂量依赖性。ELISA结果显示,nsp1能显著抑制IFN-β蛋白的表达。水泡性口炎病毒 (VSV) 复制抑制试验结果显示,nsp1明显抑制poly(I:C)介导的Ⅰ型IFN的抗病毒作用。结果提示,nsp1作为PEDV的保守蛋白,具有拮抗Ⅰ型干扰素启动子活性和应答的功能,为揭示PEDV逃逸宿主天然免疫应答的机制和研发新型高效抗PEDV疫苗奠定基础。     

猪流行性腹泻病毒nsp1对Ⅰ型干扰素应答的影响

猪流行性腹泻病毒(PEDV)能抑制宿主Ⅰ型干扰素及其诱导的细胞抗病毒免疫应答,但是PEDV抑制Ⅰ型干扰素应答的分子机制尚不明了,尤其是PEDV非结构蛋白(Nonstructural proteins,nsps)在Ⅰ型干扰素应答中的调控作用研究不多。为研究PEDV非结构蛋白1(nsp1)对细胞Ⅰ型干扰素应答的影响,构建了真核表达载体p CAGGS-nsp1,采用Western blotting和间接免疫荧光试验确定nsp1在细胞中的表达。通过报告基因法、ELISA以及病毒复制抑制试验评估nsp1对Ⅰ型IFN的影响。结果显示,nsp1在转染细胞和病毒感染细胞中均高效表达。双荧光报告基因试验结果表明,nsp1能显著抑制IFN-β启动子活性,且具有剂量依赖性。ELISA结果显示,nsp1能显著抑制IFN-β蛋白的表达。水泡性口炎病毒(VSV)复制抑制试验结果显示,nsp1明显抑制poly(I:C)介导的Ⅰ型IFN的抗病毒作用。结果提示,nsp1作为PEDV的保守蛋白,具有拮抗Ⅰ型干扰素启动子活性和应答的功能,为揭示PEDV逃逸宿主天然免疫应答的机制和研发新型高效抗PEDV疫苗奠定基础。     

细胞自噬与病毒复制

细胞自噬是真核生物中一种高度保守的细胞内容物降解过程,在维持细胞的内环境稳定中起着重要作用。同时,自噬参与固有免疫系统对病原微生物的识别,以帮助吞噬细胞进行有效的吞噬作用并清除细胞内外的病原体。而病毒,尤其是RNA病毒,具有快速进化以应对宿主细胞中的变化的能力,能通过利用或抑制宿主细胞的自噬作用来为自身的复制服务。因此,针对自噬途径的药物筛选和治疗策略越来越成为抗病毒研究的热点。     

细胞自噬与病毒复制

细胞自噬是真核生物中一种高度保守的细胞内容物降解过程,在维持细胞的内环境稳定中起着重要作用。同时,自噬参与固有免疫系统对病原微生物的识别,以帮助吞噬细胞进行有效的吞噬作用并清除细胞内外的病原体。而病毒,尤其是RNA病毒,具有快速进化以应对宿主细胞中的变化的能力,能通过利用或抑制宿主细胞的自噬作用来为自身的复制服务。因此,针对自噬途径的药物筛选和治疗策略越来越成为抗病毒研究的热点。     

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)vIL-6通过IRF-3负性调控IFN-β转录表达

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV),又称人类疱疹病毒8型(Human herpesvirus 8,HHV-8),是艾滋病感染者中发病率最高的肿瘤-卡波氏肉瘤的致病性病原体。本实验对KSHV裂解期蛋白-病毒白细胞介素6(Viral interleukin-6,vIL-6)抑制宿主固有免疫机制进行初步探讨。利用仙台病毒刺激人胚肾细胞(HEK293T)激活抗病毒固有免疫,观察vIL-6过表达后对IFN-β的作用及机制,利用实时定量PCR检测IFN-β基因表达及双荧光素酶实验分析IFN-β基因启动子的活性。过表达vIL-6后,IFN-β基因mRNA水平表达明显下降,进一步实验证明vIL-6可抑制IFN-β基因启动子活性,且vIL-6可特异性作用于IFN-β基因启动子PRDIII-PRDI区。本研究首次证实了KSHV vIL-6可通过抑制IFN-β启动子活性从而调控IFN-β表达,且这种作用主要通过IRF-3信号途径。     

柯萨奇病毒B组5型非结构蛋白抑制NF-κB信号通路的作用机制研究

目的 柯萨奇病毒B组5型（CVB5）是手足口病的重要病原体之一,可导致发热、皮疹或疱疹等临床症状,重症者出现神经系统疾病,甚至死亡。天然免疫应答是机体抗病毒入侵的第一道防线,其中核因子κB (NF-κB)是宿主天然免疫反应中的重要蛋白质,然而关于CVB5感染后调控NF-κB介导信号通路的研究尚鲜有报道。方法 本研究通过检测启动子活性、促炎因子水平以及通路中关键蛋白表达等,阐明CVB5对NF-κB信号通路的调控作用机制。结果 CVB5感染可抑制促炎因子表达和p65的磷酸化。CVB5非结构蛋白（NSP）可抑制促炎因子表达以及重要蛋白p65和IκBα的磷酸化。经STRING11.1数据库预测表明,CVB5 3CD蛋白与宿主多聚胞嘧啶结合蛋白1 (PCBP1)具有相互作用,且PCBP1可促进IκBα和p65的磷酸化,抑制病毒复制。结论 CVB5 NSP可负调控NF-κB信号通路,且与3CD相互作用的PCBP1蛋白可通过调控NF-κB通路抑制CVB5复制。本研究探索病毒与宿主天然免疫应答的调控作用,从而为研制抗CVB5感染的药物提供作用靶点。     

HBx与宿主蛋白质的相互作用

HBx是哺乳动物嗜肝性HBV的X读码框所编码的HBV中唯一具有多种调控功能的病毒蛋白质。这些调控作用包括：激活宿主细胞和病毒自身基因的转录、调控凋亡、抑制细胞中受损DNA的外切修复反应以及激活细胞中信号转导通路如：MAPK、JAK、STAT的级联反应等;HBx通过这样的多种调控作用直接或间接地对病毒自身的复制与增殖以及宿主细胞中基因的表达与调控、细胞的凋亡与癌变等过程都产生了广泛的影响。     

口蹄疫病毒结构蛋白VP0抑制Ⅰ型干扰素信号通路的激活

【目的】研究口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP0对Ⅰ型干扰素信号通路的影响。【方法】通过反转录PCR构建VP0真核表达载体,利用Western blotting验证VP0蛋白转染HEK-293T细胞后的表达情况;Real-time PCR检测VP0蛋白对FMDV在BHK细胞上复制的影响,检测VP0蛋白对SeV诱导的干扰素信号通路分子RIG-I、IRF3、IFN-β及下游刺激基因ISG15、ISG20表达的影响;双荧光素酶报告基因检测系统检测VP0蛋白对SeV诱导的IFN-β和NF-κB启动子激活以及对RIG-I样受体(RIG-I-like receptors,RLRs)信号通路分子激活IFN启动子的影响;免疫共沉淀检测VP0蛋白与RLRs信号通路中关键分子的相互作用。【结果】成功构建了p CAGGs-VP0真核表达载体,可以在HEK-293T细胞中表达;FMDV感染后的4–6 h,VP0蛋白显著促进FMDV在BHK细胞上的复制(P0.01或P0.05);VP0蛋白明显抑制干扰素下游刺激基因的表达(P0.01或P0.05)。在双荧光素酶报告基因检测实验中,VP0蛋白抑制SeV诱导IFN-β和NF-κB的活化具有剂量依赖性(P0.01),并对RIG-I、MDA5、VISA、TBK1和IRF3介导的IFN-β产生具有抑制作用,但是对IRF7没有明显的影响。免疫共沉淀显示VP0蛋白可与IRF3发生相互作用。【结论】证实VP0蛋白可以通过与IRF3相互作用来抑制Ⅰ型干扰素信号通路的激活。     

mTORC1信号通路调控细胞自噬的研究进展

蛋白激酶mTORC1主要感应细胞内的营养状态和细胞外的压力刺激,通过磷酸化众多下游底物蛋白,参与调控细胞的生长、增殖和代谢等过程.近年来的研究表明, m TORC1信号通路在细胞内的重要分解代谢过程——细胞自噬的调控中发挥主导作用.在细胞自噬过程的不同阶段发挥作用的多个蛋白陆续被鉴定为mTORC1的直接磷酸化底物,表明mTORC1在细胞自噬过程的不同阶段均发挥调控作用.以上作用机制让mTORC1精确而全面地控制细胞自噬的起始、终止和强度,进而帮助细胞更好地应对细胞内外环境的改变.本文将围绕mTORC1信号通路在细胞自噬调控中的主导作用综述近年来的相关研究进展.     

细胞MEK1/2蛋白及其相关通路在单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）复制中的作用

基于细胞Raf/MEK/ERK信号通路与病毒复制的关系,应用Western印迹检测 p-ERK1/2蛋白的表达、用终点滴定法测定病毒增殖量（TCID_５０）,以及观察感染细胞的细胞病变效应（CPE）等,揭示单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)复制与 ERK通路的关系. 结果表明,HSV-2的复制可引起细胞ERK通路的活化;用U0126预先抑制ERK通路的活化,或用特异性siRNA敲减MEK1/2基因的表达可显著地抑制病毒复制.提示ERK信号通路以及MEK1/2蛋白对HSV-2的复制具有重要的作用.该研究对进一步阐明细胞ERK通路各激酶蛋白在病毒复制中的作用机制、寻找抗病毒作用靶标等奠定了良好的基础.