毛白杨PtFT1和PtFT2基因编码区克隆与表达模式分析

以毛白杨为材料,采用同源基因克隆法从毛白杨中分离了FT(FLOWERING LOCUS T)同源基因PtFT1和PtFT2编码区序列。测序结果表明PtFT1和PtFT2 编码区长度均为525bp,可编码174个氨基酸。蛋白序列比对发现这两个基因与拟南芥、葡萄等物种中FT同源基因所编码的氨基酸同源性达到75%以上, PtFT1 和 PtFT2 所推测的氨基酸序列包含FT类蛋白保守基序(LGRQTVYAPGWRQN)和两个关键性氨基酸残基Tyr84(Y),Gln139(Q)。系统进化分析进一步表明 PtFT1 和 PtFT2 属于FT亚家族成员。采用Real-time qRT-PCR技术检测 PtFT1 和 PtFT2 在各个组织部位中的表达模式,结果表明 PtFT1 和 PtFT2 在各个组织部位均有表达,但这两个基因的表达水平存在差异;两个基因在早期雌雄花芽(7月5日)表达量明显高于成熟雌雄花芽(翌年3月10日)表达量,进而推测在毛白杨中 PtFT1 和 PtFT2 的表达响应日照长短,长日照条件促进这两个基因的表达,它们可能在光周期调控的开花途径中促进花芽分化和开花发挥特定作用。这些研究对于阐明 PtFT1 和 PtFT2 在光周期开花调控途径中的作用机制具有重要意义,为进一步开展毛白杨开花调控基因工程研究奠定了工作基础。     

芒果SEPALAATA基因的克隆与表达分析

以芒果品种‘吕宋’(Mangifera indica L.Carabao)为试材,利用同源克隆和RACE技术从花序中获得了1个芒果SEPALAATA(SEP)基因cDNA全长,命名为MSEP1(GenBank中登录号为KP702299)。MSEP1基因的cDNA全长为921bp,包含一个长度为726bp开放阅读框,编码241个氨基酸,蛋白质相对分子质量为27.7kD,理论等电点为5.79。序列比对和系统进化树分析表明,MSEP1具有保守的MADS-box及半保守的K区,属于MADS-box家族的SEP亚家族。器官特异性表达分析表明,MSEP1基因在芒果根、茎中表达量较低,在叶片、花芽中表达量较高,而在花序中表达量最高。研究推测,MSEP1基因可能在芒果生殖生长中发挥重要作用。     

朵丽蝶兰MADS-box基因DtpsMADS1的克隆与表达特性

植物MADS-box基因家族编码高度保守的转录因子,参与了包括花器官发育和开花在内的多种发育进程。为阐释兰科植物成花的分子调控机制,根据MADS-box基因保守序列设计简并引物,用RACE方法从朵丽蝶兰花葶中克隆到1个MADS-box家族基因,该基因cDNA全长960 bp,包含37 bp 5'UTR,一个738 bp的开放阅读框(ORF)和185 bp 3'UTR,共编码245个氨基酸。序列和系统进化树分析表明,该基因与其他植物的MADS-box基因具有很高的同源性,属于AP1/FUL-like亚家族,命名为DtpsMADS1,GeneBank登录号为JQ065097。实时荧光定量PCR检测结果显示:DtpsMADS1具有明显的组织表达特异性;在根和叶中,DtpsMADS1在花前期和花后期表达量较高;苗期和盛花期表达量较低;DtpsMADS1在花葶中的表达趋势与根和叶相似;而在花器官中,DtpsMADS1只有痕量表达。由此推断,DtpsMADS1可能参与开花进程调控,而不参与花器官的形态建成。     

茶树CsGGDPS7基因的克隆和表达分析

从茶树基因组鉴定得到牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因CsGGDPS7,以铁观音茶树为材料克隆获得全长cDNA(GenBank登录号MH891780)。CsGGDPS7序列全长1 185bp,包含1 098bp开放阅读框(ORF),编码365个氨基酸。预测结果显示在N端包含叶绿体转运肽,亚细胞定位于叶绿体中。氨基酸序列分析结果显示,具有类异戊二烯合成酶家族的5个保守域和2个特征功能域(DDXXXXD和DDXXD)。进化树结果表明与油橄榄(Olea europaea)OeGGDPS7亲缘关系最近。荧光定量检测显示,CsGGDPS7在叶片中的表达量显著高于其他组织,但花发育阶段CsGGDPS7表达量差异不显著。在乌龙茶做青过程中,CsGGDPS7在晒青阶段就快速上调表达并在三摇达到峰值。CsGGDPS1和CsGGDPS2表达也受做青调控,但CsGGDPS4不受做青调控。研究推测,CsGGDPS7可能与乌龙茶萜类香气物质合成密切相关。     

小黑杨FLC基因的克隆及功能解析

MADS-box家族蛋白是一类重要的调控开花的转录因子,FLC是其家族成员的编码基因之一。FLC在调节开花过程,其功能的发挥受多个途径的调控。本研究利用RT-PCR方法在小黑杨雄花芽中克隆出FLC基因的全长c DNA序列Pn FLC。该基因的开放读码框为726 bp,编码241个氨基酸残基组成的分子量为27.559 k D的蛋白质,蛋白质的等电点为9.37。实时定量荧光PCR结果显示,春化能够使Pn FLC在小黑杨根、茎、叶各组织中表达量下调57.9%~84%;启动子GUS染色结果表明,Pn FLC启动子在分裂活跃的组织中活性较高。拟南芥的遗传转化结果显示,Pn FLC可以调控At AP1、At SOC1和At FT基因的表达,同时延迟拟南芥的开花时间。     

草莓APETALA2同源基因的克隆及表达分析

利用同源克隆方法首次从草莓花芽cDNA中分离出APETALA2同源基因SAP2。SAP2全长182bp,编码435个氨基酸。序列分析表明,SAP2具有AP2家族典型的结构域。采用RT-PCR方法分析SAP2在不同组织中的表达情况,结果显示SAP2在草莓营养组织、花芽以及不同花器官中均有表达,与拟南芥AP2、矮牵牛PhAP2A的表达模式一致。以上结果说明SAP2是草莓的AP2同源基因。     

粉菠萝FVE同源基因的克隆及表达分析

FV E是植物自主开花途径中的关键基因,主要通过抑制FLC的表达来调控花发育过程。本研究利用粉菠萝(Aechmea fasciata)茎尖组织转录组序列数据,通过RACE技术克隆获得了粉菠萝中FVE同源基因AfF-V E的cDNA全长序列。该序列全长为1672 bp,开放阅读框为1404 bp,编码由468个氨基酸残基组成的蛋白,该蛋白序列中含有6个保守的WD重复区域。氨基酸序列比对结果表明,A fFV E基因编码的氨基酸序列与其它物种中FV E的同源序列具有较高的相似性。qRT-PCR (实时荧光定量PCR)分析结果显示,粉菠萝中A fFV E基因对外源乙烯的刺激产生了应答。在采用乙烯利灌心处理不同时间的过程中,发现A fFV E基因的转录水平均在处理后1 d时达到最大,推测AfFVE可能参与乙烯信号反应,该基因在粉菠萝自主开花途径中的调节作用可能受乙烯影响。     

毛白杨二氢黄酮醇-4-还原酶基因PtDFR的克隆和特性分析

二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol-4-reductase,DFR)是调控花青素合成的关键酶。DFR对底物的选择是决定植物中花色苷种类的重要因素,并在很大程度上决定花青素的比例,最终使植物呈现不同的颜色。此外,DFR基因家族中的不同成员对底物具有不同的催化效率,影响了植物中花青素的种类和含量,从而使植物组织或器官呈现不同的颜色。该文在分析已有毛白杨转录组数据的基础上,以毛白杨二氢黄酮醇-4-还原酶基因为研究对象,设计了一对PCR引物,以毛白杨基因组DNA为模板,通过PCR扩增获得了毛白杨DFR基因家族的1个成员,命名为PtDFR。测序结果表明,该基因序列全长为1 591 bp,包含6个外显子和5个内含子,CDS长度为954 bp,编码317个氨基酸,具有1个NADP(H)保守结构域。氨基酸序列相似性分析和进化分析表明,毛白杨与银白杨、毛果杨DFR的氨基酸相似性分别高达95.65%和94.21%,而与柑橘、枣、葡萄等7个物种DFR的氨基酸相似性达到82.14%～89.29%。转录组数据分析显示,PtDFR在不同组织器官中的表达量存在明显差异,萌动营养芽表达量最高,休眠营养芽最低,且不同时期雌雄花芽表达趋势相似,该研究结果将为深入探究PtDFR的功能奠定基础。     

苦荞查尔酮合酶基因CHS的结构及花期不同组织表达量分析

采用同源克隆、染色体步移和RT-PCR技术,首次克隆到苦荞查尔酮合酶基因(CHS)的全长DNA序列和cDNA开放阅读框(ORF)序列.序列分析表明,苦荞CHS DNA序列(GU172165)全长1 632 bp,含1个445 bp的内含子;cDNA编码区(HM852753)全长1 188 bp,编码395个氨基酸,命名为FtCHS.生物信息学分析表明,FtCHS和推导的氨基酸序列与其它植物CHS基因同源率在95%以上,含有CHS多基因家族的标签序列(GFGPG)、活性位点、底物结合口袋位点和环化反应口袋位点.半定量RT-PCR分析苦荞花期FtCHS空间表达模型表明,其表达量未成熟种子叶茎花根成熟种子,与苦荞芦丁含量的分布基本一致,具有组织特异性。     

黄花梨bZIP的cDNA克隆与表达分析

为探讨黄花梨(Pyrus pyrifolia‘Huanghua’)PpbZIP基因的功能,根据同源基因bZIP从黄花梨花芽中克隆到PpbZIP基因(GenBank登录号:KC951877)。PpbZIP基因的全长cDNA为1843 bp,其中开放阅读框长度1227 bp,编码408个氨基酸,与同为蔷薇科的苹果bZIP蛋白序列的同源性高达92%。PpbZIP基因的QRT-PCR分析表明,PpbZIP基因在黄花梨花芽从休眠到休眠解除后的表达量呈先升高后降低的趋势。这表明PpbZIP参与了黄花梨花芽休眠过程的调控。     

无籽刺梨(Rosa kweichonensis var.sterilis)RksAGL基因克隆及表达分析

以无籽刺梨(Rosa kweichonensis var.sterilis)花芽提取的RNA为模板,采用同源克隆结合RACE技术克隆得到无籽刺梨AGL基因的c DNA全长,命名为Rks AGL。序列分析表明,c DNA全长1 089 bp,开放阅读框长度为747 bp,可编码248个氨基酸。编码蛋白分子质量预测为28.56 k D,等电点为9.40,无信号肽序列。分析表明,Rks AGL基因属于MADS-box基因家族C类基因,其编码的蛋白与其它植物AGAMOUS类蛋白具有较高的同源性。实时定量PCR分析表明,RksAGL基因仅在雄蕊和心皮中表达,在萼片和花瓣中不表达     

金柑FcSOC1同源基因的克隆及表达分析

通过检测这对同源基因的表达水平,来分析这对同源基因与花器官发育的关系。采用同源克隆技术从金柑花中克隆出Fc SOC1基因的c DNA全长序列并进行生物信息分析;利用实时荧光定量PCR技术分析Fc SOC1基因在金柑不同组织、器官的表达特性。序列分析表明获得这对同源基因全长为660 bp和636 bp,分别编码220和212个氨基酸,分别命名他们为Fc SOC1a和Fc SOC1b。同源性分析显示,其与同属于芸香科的克里曼丁桔,相似性达98%,和甜橙的相似性也达到90%以上。实时荧光定量PCR表示Fc SOC1a和Fc SOC1b在营养器官和生殖器官均有表达。在营养器官的表达略有不同,但是在生殖器官的表达均在花蕾发育初期与后期急剧升高,并且在花中的表达量明显大于在其他部位的表达量。这对同源基因的高表达部位为茎、叶、花蕾、花芽、花瓣、花托、子房。Fc SOC1a和Fc SOC1b在花中显著表达,根据其表达特性推测,其可能在调控花器官发育上起着重要作用。根据这两个基因在营养器官的表达不同以及之间同源性较低,说明其功能已经出现分化。     

大豆GmDAO1基因的功能预测及表达分析

本研究通过在大豆基因组数据库中检索拟南芥AtDAO1在大豆中的同源基因,获得了GmDAO1基因序列。通过对GmDAO1基因编码的氨基酸序列及启动子序列进行生物信息学分析,我们发现GmDAO1基因CDS序列全长951bp,编码316个氨基酸。GmDAO1编码的蛋白为亲水性蛋白,具有1个N-糖基化位点、3个激酶磷酸化位点与1个豆蔻酰化位点。结构域分析表明GmDAO1含有双加氧酶与2OG-Fe(II)加氧酶结构域,是2-酮戊二酸依赖性双加氧酶基因(2-ODD)家族的成员。GmDAO1预测的启动子区域含有与激素、胁迫、光应答、生物钟调控和转录因子结合相关的顺式作用元件。系统进化分析结果表明DAO1在豆科植物进化过程中比较保守。组织特异性表达分析结果显示GmDAO1在叶片中表达量最低,在根中表达量最高。因此我们推测其可能参与生长素的代谢途径。     

苦荞查尔酮合成酶基因CHS的结构及花期不同组织表达量分析

采用同源克隆、染色体步移和RT-PCR技术,首次克隆到苦荞查尔酮合酶基因（CHS）的全长DNA序列和cDNA开放阅读框（ORF)序列. 序列分析表明,苦荞CHS DNA序列（GU172165）全长1 632 bp,含1个445 bp的内含子;cDNA编码区（HM852753）全长1 188 bp,编码395个氨基酸,命名为FtCHS. 生物信息学分析表明,FtCHS和推导的氨基酸序列与其它植物CHS基因同源率在95%以上,含有CHS多基因家族的标签序列（GFGPG）、活性位点、底物结合口袋位点和环化反应口袋位点. 半定量RT-PCR分析苦荞花期FtCHS空间表达模型表明,其表达量未成熟种子＞叶＞茎＞花＞根＞成熟种子,与苦荞芦丁含量的分布基本一致,具有组织特异性.     

毛白杨蔗糖合酶基因PtSS2克隆与表达分析

为了解毛白杨蔗糖合酶(sucrose synthase,SS)基因功能和表达模式,以毛白杨茎段来源的cDNA为模板,根据毛果杨PtrSS2CDS序列信息设计特异引物,采用RT-PCR技术分离克隆了PtSS2基因。测序分析表明,PtSS2基因序列全长为2 412bp,编码803个氨基酸,蛋白大小为92.14kD,理论等电点6.00,属于酸性蛋白;氨基酸序列同源性分析表明,PtSS2与毛果杨PtrSS2和PtrSS1一致性分别高达100%和98.63%;结构域分析表明,PtSS2含有2个高度保守的功能域,即蔗糖合酶(5~552)和糖基化转移酶(554~744)功能域。qRT-PCR检测表明,PtSS2在毛白杨根、茎、叶、营养芽、雄雌花芽等各个组织中均有表达,但在营养芽和花芽中表达量较高,根部相对较低,总体呈组成型表达模式;在干旱胁迫下,PtSS2表达水平提升。研究结果推测,蔗糖合酶基因PtSS2在毛白杨各组织器官发育过程及干旱胁迫响应过程中具有重要功能。     

春兰CgSEP3基因的克隆和表达分析

该研究采用RT-PCR和RACE技术从春兰(Cymbidium goeringii)中分离到1个SEPALLATA3(SEP3)基因。序列分析表明,该基因含有1个732bp的开放阅读框(ORF),共编码243个氨基酸。系统进化树分析显示,该基因是MADS-box基因家族AP1/AGL9组SEP的同源基因,其编码蛋白与其它植物SEP3类蛋白具有较高的一致性,命名为CgSEP3(登录号为KF924272)。实时荧光定量分析表明,CgSEP3在春兰花器官中均有表达,其中在唇瓣、侧瓣和萼片中的表达量较高,在子房和蕊柱中的表达量较低;而且CgSEP3在花发育各个时期都有表达,在1~2cm的花芽中表达量最高,在盛开的花中的表达量最低。研究认为,CgSEP3基因可能在春兰花瓣和萼片的形成过程中具有重要作用。     

蕙兰CyfaSTK基因的克隆与表达分析

采用同源克隆的方法,从蕙兰（Cymbidium faberi Rolfe）花芽中克隆获得CyfaSTK基因的cDNA序列,并对其进行生物信息学分析及基因表达分析。结果显示,该基因全长843 bp,其中开放阅读框（ORF）长705 bp,共编码234个氨基酸和1个终止密码子。同源蛋白序列比对及分子系统发育分析结果表明,CyfaSTK蛋白属于D类MADS-box转录因子STK-like进化系,含有MADS、I、K和C等4个结构域,其C末端转录激活区含有2个保守的基元：AG motifⅠ和AG motifⅡ,此外,还具有一个在天门冬目植物中相对保守的基元MD motif。基因表达的组织特异性分析结果显示：蕙兰CyfaSTK基因在花萼、花瓣、唇瓣、药帽、子房中均有表达,但在叶片中不表达,其中在子房中的表达量与其他组织相比,差异达到极显著水平;CyfaSTK在花芽经过休眠后的萌动期表达量最高,且在开花当天该基因表达量有上升趋势。研究结果表明CyfaSTK基因不仅参与调控蕙兰花器官的发育过程,且对子房及合蕊柱的正常发育具有重要作用。     

蕙兰CyfaSTK基因的克隆与表达分析

采用同源克隆的方法,从蕙兰(Cymbidium faberi Rolfe)花芽中克隆获得CyfaSTK基因的cDNA序列,并对其进行生物信息学分析及基因表达分析。结果显示,该基因全长843 bp,其中开放阅读框(ORF)长705 bp,共编码234个氨基酸和1个终止密码子。同源蛋白序列比对及分子系统发育分析结果表明,CyfaSTK蛋白属于D类MADS-box转录因子STK-like进化系,含有MADS、I、K和C等4个结构域,其C末端转录激活区含有2个保守的基元:AG motifⅠ和AG motifⅡ,此外,还具有一个在天门冬目植物中相对保守的基元MD motif。基因表达的组织特异性分析结果显示:蕙兰CyfaSTK基因在花萼、花瓣、唇瓣、药帽、子房中均有表达,但在叶片中不表达,其中在子房中的表达量与其他组织相比,差异达到极显著水平; CyfaSTK在花芽经过休眠后的萌动期表达量最高,且在开花当天该基因表达量有上升趋势。研究结果表明CyfaSTK基因不仅参与调控蕙兰花器官的发育过程,且对子房及合蕊柱的正常发育具有重要作用。     

中国水仙NtSOC1基因克隆及亚细胞定位

以中国水仙‘金盏银台’为实验材料,采用RACE和RT-PCR技术获得1个与开花相关的转录因子(SOC1)的同源基因NtSOC1。NtSOC1的cDNA全长1 603bp,含有1个687bp开放阅读框,编码228个氨基酸。生物信息学分析表明,NtSOC1与单子叶植物的SOC1同源基因的氨基酸序列较为相似,且在C末端同样含有一个保守性很高的SOC1motif序列,说明NtSOC1是属于SOC1/TM3亚家族基因。荧光定量PCR分析显示,NtSOC1在花芽分化阶段的表达量随着花芽的分化而升高,花芽分化结束时减少,表明NtSOC1基因可能参与中国水仙的花芽分化。成功构建了NtSOC1基因表达载体pCAMBIA1302-NtSOC1,通过农杆菌转化洋葱表皮对编码蛋白进行亚细胞定位结果显示,NtSOC1基因编码蛋白定位于细胞核,符合转录因子的亚细胞定位特征。该实验结果为进一步研究NtSOC1基因的生物学功能奠定了基础。     

砂梨CONSTANS基因的克隆及原核表达分析

为了探索梨树植物的开花调控机制,本研究以砂梨(Pyrus pyrifolia Nakai)叶片为材料,采用同源序列克隆法,进行了开花调控相关基因CONSTANS的克隆,命名为PyCO,GenBank登录号为KF246572。序列分析表明,该基因包含一个1023 bp的开放阅读框,编码340个氨基酸,推测蛋白质分子量为37.81 kD,等电点为5.95。PyCO蛋白具有典型的植物CO家族的结构特征,含有2个高度保守的B-box及CCT结构域。进化树分析表明,该氨基酸序列与苹果的同源性接近93%,与碧桃、可可树、草莓等其他高等植物的CO类蛋白同源性也在70%以上。原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白,分子量约为58.5 kD,为进一步探索梨树开花调控机理奠定了基础。