miR-217慢病毒表达载体及稳转胶质瘤细胞系的构建

目的:构建mi R-217慢病毒表达载体并建立稳定表达mi R-217的胶质瘤细胞系,为深入研究mi R-217在胶质瘤细胞生长及功能中的作用及机制提供条件。方法:利用人基因组中mi R-217前体序列,设计并合成引物。采用PCR的方法扩增含mi R-217前体的目的片段,酶切后连接至慢病毒表达载体p LVX-EGFP-Puro。将带有mi R-217前体的慢病毒载体及辅助质粒用脂质体的方法转染293细胞,24小时后收集上清液测定病毒滴度。利用实时定量PCR检测mi R-217的表达水平,确定慢病毒载体的表达能力。将病毒感染胶质瘤细胞系U251,通过荧光观察和嘌呤霉素(Puromycin)筛选,获得稳定转染mi R-217的胶质瘤细胞系。结果:克隆的mi R-217前体目的片段经PCR检测和测序分析,序列完全正确、无突变。实时定量PCR检测发现慢病毒感染293T细胞后,mi R-217的表达水平明显升高(P0.01),表明mi R-217慢病毒表达载体构建成功。经嘌呤霉素筛选后,荧光显微镜观察发现细胞均有稳定的绿色荧光表达,并且mi R-217的表达水平显著升高(P0.01),是对照组的12.5倍。结论:成功构建了mi R-127慢病毒表达载体和稳转胶质瘤细胞系,为后续研究奠定了良好基础。     

hsa-miR-20a低表达慢病毒载体的构建及其表达鉴定

目的:构建hsa-mi R-20a低表达慢病毒载体,检测其在HL-60中表达。方法:采用In-fusion重组交换克隆法设计并合成hsa-mi R-20a前体序列的扩增引物,扩增获得目的片段插入慢病毒GV159中,得到重组的LV-hsa-mi R-20a表达载体,通过与包装质粒共转染293T细胞,获得携带hsa-mi R-20a的重组慢病毒并测定病毒滴度。取对数生长期HL-60细胞根据病毒滴度及细胞MOI值感染慢病毒,感染后24 h、48 h、72 h、96 h镜下观察荧光表达情况,判断感染效率,q RT-PCR检测HL-60细胞hsa-mi R-20a的表达变化。结果:成功构建LV-hsa-mi R-20a低表达慢病毒载体,其病毒滴度为(8E+8)TU/m L。该病毒感染HL-60细胞的效率可高达到80%,并可有效降低HL-60细胞hsa-mi R-20a表达水平。结论:成功构建了hsa-mi R-20a低表达慢病毒载体,包被的慢病毒可以在HL-60细胞中实现低表达效果,为后续功能研究奠定了基础。     

慢病毒载体介导RAB27A基因过表达对人HepG2肝癌细胞增殖的影响

目的：构建RAB27A基因慢病毒表达载体,并研究RAB27A 对人HepG2肝癌细胞增殖能力的影响。方法：以pEGFP-C1-RAB27A质粒为模板,PCR扩增出融合绿色荧光蛋白的RAB27A基因全长,酶切后插入穿梭载体pENTR/U6,再应用Gateway技术,基因重组到表达载体pHAGE-EF1α-puro-DEST上,构建得到重组慢病毒表达载体pHAGE-GFP-RAB27A-puro。测序鉴定序列正确后,将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转HEK-293T细胞进行慢病毒包装。收集并浓缩培养上清以获得慢病毒颗粒感染HepG2细胞。荧光显微镜下观察HEK-293T细胞和慢病毒感染HepG2细胞绿色荧光强度;Western blot检测稳定感染HepG2细胞株RAB27A 蛋白表达水平;CCK8和平皿克隆形成实验检测稳定过表达RAB27A的HepG2细胞增殖活力的变化;流式细胞术检测稳定过表达RAB27A的HepG2细胞周期分布情况。结果：经双酶切及测序结果证实重组慢病毒表达载体构建正确;浓缩后病毒滴度较高;重组慢病毒感染HepG2细胞后,细胞外源RAB27A的蛋白表达水平显著上调,HepG2细胞的增殖活力和克隆形成能力受到明显抑制（P<0.01）,S期细胞分布比例明显降低（P<0.01）。结论： RAB27A 基因重组慢病毒表达载体构建成功,外源过表达RAB27A 基因可显著抑制HepG2细胞增殖能力。RAB27A在肝细胞癌发生发展和迁移中扮演了重要角色。     

SIRT1过表达慢病毒稳转细胞系的构建及其对脂肪合成的影响

目的：通过油红O及BODIPY染色选取脂肪代谢理想的细胞模型,并运用高内涵仪器检测SIRT1高表达细胞系中脂肪的变化。方法：在L-02、HepG2、Huh7细胞中进行油红O和BODIPY染色,观察在不同油酸浓度下脂滴的生成情况;将构建成功的SIRT1过表达慢病毒载体GV166．SIRT1及空载体病毒GV166．Control感染L．02细胞,qPCR及Western．Blot检测感染细胞中SIRT1的表达水平;高内涵系统检测L-02SIRT1和L-02control细胞系产生的脂滴荧光强度,以确定油酸诱导的最佳浓度及最佳刺激时间。结果：通过油红O及BODIPY染色发现L-02细胞更适宜作为脂肪代谢的细胞模型;成功构建SIRT1过表达慢病毒载体GV166-SIRT1及空载体病毒GV166．Control,qPCR及Western．Blot检测显示转染病毒后SIRT1在细胞中的表达水平明显升高;在油酸刺激浓度0．4mM、诱导时间12h时,L-02SIRT1细胞中脂滴的荧光强度明显较L．02control为低。且这种差异达到最大化。结论：成功建立SIRT1过表达稳定转染细胞系,并证明高表达SIRT1能够抑制脂肪合成。     

SIRT1 过表达慢病毒稳转细胞系的构建及其对脂肪合成的影响

目的：通过油红O 及BODIPY染色选取脂肪代谢理想的细胞模型,并运用高内涵仪器检测SIRT1 高表达细胞系中脂肪的 变化。方法：在L-02、HepG2、Huh7 细胞中进行油红O 和BODIPY 染色,观察在不同油酸浓度下脂滴的生成情况;将构建成功的 SIRT1 过表达慢病毒载体GV166-SIRT1 及空载体病毒GV166-Control 感染L-02 细胞,qPCR 及Western-Blot 检测感染细胞中 SIRT1 的表达水平;高内涵系统检测L-02 SIRT1 和L-02 control细胞系产生的脂滴荧光强度,以确定油酸诱导的最佳浓度及最佳 刺激时间。结果：通过油红O 及BODIPY染色发现L-02 细胞更适宜作为脂肪代谢的细胞模型;成功构建SIRT1 过表达慢病毒载 体GV166-SIRT1 及空载体病毒GV166-Control,qPCR 及Western-Blot检测显示转染病毒后SIRT1 在细胞中的表达水平明显升 高;在油酸刺激浓度0.4mM、诱导时间12h 时,L-02 SIRT1细胞中脂滴的荧光强度明显较L-02 control 为低,且这种差异达到最大 化。结论：成功建立SIRT1过表达稳定转染细胞系,并证明高表达SIRT1 能够抑制脂肪合成。     

miR-125b慢病毒表达载体的构建及其对卵巢癌SKOV3细胞增殖和迁移的影响

构建并鉴定miR-125b慢病毒过表达载体,研究miR-125b对卵巢癌细胞增殖和迁移的影响及其可能机制。将PcR扩增的rniR-125b前体序列与经过酶切后的GP—SupersilencingVector进行连接,产生miR-125b重组慢病毒表达载体。将重组慢病毒载体质粒、pGag／Pol、pRev和pVSV-G共转染293T细胞,包装产生慢病毒。使用收获的病毒颗粒感染卵巢癌SKOV3细胞,嘌呤霉素筛选稳定感染细胞株;实时荧光定量PCR（Real．timeqPCR）检测miR-125b在SKV03细胞中的表达;Westernblot检测其潜在靶基因HER-2的表达：MTT实验和Transwell侵袭实验分别观察miR-125b过表达后SKOV3细胞增殖和迁移能力的改变。该研究成功构建miR-125b陧病毒过表达载体,感染卵巢癌SKOV3细胞后,能够过表达miR-125b,并抑制SKOV3细胞的增殖及迁移,降低潜在靶基因HER-2的表达。该研究证叽miR-125b能够抑制SKOV3细胞的增殖及迁移,并可能通过降低潜在靶基因HER-2的表达而实现。     

人CYP39A1基因过表达慢病毒载体构建及其在HepG2中表达

[目的]构建人CYP39A1基因过表达慢病毒载体,并建立CYP39A1基因过表达的HepG2细胞株,为研究CYP39A1在肝细胞肝癌中的作用机制奠定基础.[方法]构建具有嘌呤霉素抗性的CYP39A1慢病毒载体,经酶切鉴定及DNA测序鉴定后,包装成重组慢病毒颗粒;用嘌呤霉素筛选获得CYP39A1过表达的HepG2稳转细胞...     

CCL20及其受体CCR6在肝细胞肝癌中的作用

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)(简称肝癌)是常见的血管侵袭性高、耐药性强的恶性肿瘤之一.CC趋化因子配体20(CC chemokine ligand 20,CCL20)作为一种炎症介质能够诱导肿瘤细胞定向迁移,与其唯一受体趋化因子受体6(chemokine receptor 6,...     

慢病毒介导的RNA干扰ppGalNAc-T2基因表达抑制Jurkat细胞增殖和迁移

在肿瘤中,黏蛋白O-糖基化有着重要的生物学功能.控制O-糖基化起始合成的是多肽∶N-乙酰氨基半乳糖转移酶家族,研究该酶家族对阐明O-糖基化在肿瘤中的作用机制有重要的意义.探讨了靶向干扰ppGalNAc-T2基因表达对白血病Jurkat细胞株增殖及迁移的影响.首先合成ppGalNAc-T2特异shRNA干扰及对照序列,将其连接至慢病毒干扰载体YH1;重组载体经双酶切、测序鉴定正确后与包装质粒共转染293T细胞,获得的病毒颗粒经过滤纯化后感染Jurkat细胞,流式细胞分选仪进行细胞分选以获得ppGalNAc-T2基因稳定干扰表达的Jurkat细胞,然后使用RT-PCR和Western blot方法对各组别细胞中ppGalNAc-T2基因表达情况进行分析,以确定ppGalNAc-T2基因表达被有效干扰;进一步利用MTT实验和Transwell实验分析ppGalNAc-T2基因干扰表达对Jurkat细胞增殖及迁移的影响.结果表明,成功构建了靶向干扰ppGalNAc-T2基因表达的慢病毒载体,感染Jurkat细胞后能稳定干扰ppGalNAc-T2基因表达.MTT和Transwell实验研究发现,下调ppGalNAc-T2基因表达对Jurkat细胞增殖和迁移有抑制作用.     

利用慢病毒载体观察microRNA-194 对人骨肉瘤细胞系U2-OS 生物学特性的影响

目的：通过构建携带针对microRNA-194 的shRNA载体及过表达载体,包装慢病毒,感染人骨肉瘤细胞系U2-OS,改变细胞 内microRNA-194 基因的表达水平,研究microRNA-194 对细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响,为探索microRNA-194作为骨肉瘤 生物治疗的新靶点提供理论和实验依据。方法：PCR扩增pri-miR-194 及miR-194-5 成熟体,克隆于慢病毒载体plent-i GFP 中,转 染大肠杆菌感受态细胞,收获并浓缩慢病毒颗粒,感染人骨肉瘤细胞系U2-OS。进行MTT,流式,平板克隆等试验。结果：1.重组慢 病毒表达质粒构建正确,过表达及抑制过表达重组慢病毒的滴度分别为1.5× 108 TU/ml及4× 108 TU/ml;2. microRNA-194过表 达的人骨肉瘤细胞系U2-OS 细胞增殖速度,凋亡率及细胞周期相较于其它实验组都有明显变化(P<0.01)。结论：成功构建了 microRNA-194 过表达及抑制过表达慢病毒表达载体;miR-194 的表达水平对U2-OS 细胞的增殖和凋亡造成显著影响。 microRNA-194 可能成为骨肉瘤治疗的潜在新靶点,但该基因对骨肉瘤发生发展的作用及其机制尚待进一步研究。     

人肝癌细胞系的糖蛋白质组学研究

糖基化是最重要的蛋白质翻译后形式之一,糖基化蛋白的糖链部分影响着蛋白质的折叠和稳定性以及其生物学功能.许多恶性肿瘤组织与正常组织相比已显示出蛋白质糖基化的差异.采用蛋白质组学分析方法结合先进的糖蛋白荧光染色技术,研究了正常人肝细胞系(ChangLiver)和人肝癌细胞系(Hep3B)糖蛋白糖基化的差异.首先用细胞裂解法提取细胞总蛋白质,进行双向电泳(2-DE),然后用pro-QEmerald488糖蛋白荧光染料进行糖蛋白染色,得到两种细胞系糖基化蛋白表达谱,经2-DE分析软件Dymension分析2-DE图像,比较糖蛋白的糖基化程度,并对糖基化蛋白进行质谱鉴定.结果显示正常人肝细胞表达(74±2)个(n=3),而人肝癌细胞系表达(78±3)个糖蛋白(n=3).两者匹配的糖蛋白质点31个,Hep3B表达而ChangLiver不表达的糖蛋白质点47个,ChangLiver表达而Hep3B不表达的糖蛋白质点43个.两种细胞系糖基化程度存在明显差异,与正常人肝细胞相比,肝癌细胞发生糖基化改变的糖蛋白有25个,其中糖基化水平上调的有10个,下调的有15个,质谱鉴定出12个发生糖基化改变的糖蛋白.这些结果显示蛋白质糖基化改变可能在肝癌的发生和发展中起一定作用.     

RNF149通过泛素化介导的CD9降解调控细胞增殖

选取功能未知的泛素连接酶RNF149作为研究对象．该分子同GRAIL(gene related to anergy in lymphocytes)具有较高的同源性,属于Ⅰ型跨膜蛋白．激光共聚焦显微镜的观察结果显示,RNF149是一个定位在溶酶体上的蛋白质,它与CD9在细胞内有共定位．免疫共沉淀实验证明RNF149与CD9有相互作用．RNF149通过泛素分子的第48位赖氨酸多泛素化CD9．在HeLa细胞中转染数量一定的CD9质粒和数量梯度增加的RNF149质粒24 h后,蛋白质印迹检测外源RNF149和CD9的表达,结果表明,随外源RNF149表达量梯度增高,外源CD9的表达量梯度降低．在HEK293T细胞内以shRNA敲低内源的RNF149,并检测内源CD9的变化,发现RNF149被敲低后内源CD9的量增多．上述结果提示,CD9很有可能是RNF149的底物,被RNF149通过泛素化降解．此外,RNF149被敲低的HEK293T细胞增殖受到抑制,这可能与其内源CD9的量增多有关,提示RNF149可能是一种细胞增殖的调控因子．     

miR-155对肝癌细胞增殖的影响

目的:在肝癌细胞系中过表达miR-155,研究其对肝癌细胞增殖的影响。方法:将pc DNA3.0-miR-155表达载体瞬时转染Huh7.5.1及Hcclm3肝癌细胞系,通过实时定量PCR技术对miR-155在转录水平的表达进行检测,采用CCK8法及克隆形成实验检测miR-155过表达后对Huh7.5.1及Hcclm3肝癌细胞系增殖的影响。结果:转染细胞后72 h,经实时定量PCR检测,Huh7.5.1及Hcclm3肝癌细胞中成熟miR-155的表达分别上调约431及16倍(P0.01),说明其能有效高表达;CCK8法及克隆形成实验结果显示,miR-155能够明显促进肝癌细胞增殖(P0.01)。结论:pc DNA3.0-miR-155转染Huh7.5.1及Hcclm3肝癌细胞系后能高效表达成熟miR-155,同时证明过表达miR-155能使肝癌细胞的增殖受到非常明显的促进。     

肝癌细胞系中SP及CD133+细胞的特性分析

近年的研究表明体外培养的肝癌细胞系中存在着少量具有肝癌干细胞功能的细胞群。有研究指出肝癌干细胞存在于侧群细胞(sidepopulation,SP)中,另有研究则发现CD133+细胞是肝癌干细胞的特征。本研究以三种肝癌细胞系(Hep3B、Huh-7和PLC/PRF/5)为对象,利用流式细胞术对其中的SP细胞与CD133+细胞进行了分析,并进一步检测了它们的增殖能力、表型及耐药性等特性。结果显示,肝癌细胞系中存在不同比例的SP细胞和CD133+细胞,且大部分SP细胞呈CD133阳性表达。表型特征分析显示SP细胞表达CK7和CK19,不表达AFP,而CD133+细胞则表达AFP和CK19,却不表达CK7。SP与CD133+细胞都具有较强的增殖能力。另外,相比于其它细胞,SP细胞具有最强的化疗药物抗性。结果表明,肝癌细胞系中SP细胞与CD133+细胞整体特征有一定的区别,提示了它们不同的分化途径。     

环氧化物水解酶2在肝细胞癌中的表达水平与功能作用

本研究通过公共数据和实验数据,全面分析环氧化物水解酶2(epoxide hydrolase 2, EPHX2)在肝细胞癌中的表达情况、功能作用以及预后意义。利用GEO和MitoCarta数据集,筛选肝细胞癌中呈差异表达的线粒体相关基因;利用TCGA数据库分析EPHX2及其相关基因在肝细胞癌中的表达水平;运行R包绘制Kaplan-Meier生存曲线和功能富集分析;基于STRING和GSEA构建蛋白质互作网络和基因集富集分析;荧光定量PCR和GEO数据集验证EPHX2在肝细胞癌中的表达水平。本研究共筛选得到15个在肝细胞癌中呈差异表达的线粒体相关基因。EPHX2在肝细胞癌组织中的表达水平显著降低(P<0.01)。EPHX2表达水平与肝癌患者性别、分期和级别有关,而与年龄、T分期等因素无关。与EPHX2低表达组肝癌患者相比,EPHX2高表达组肝癌患者预后较好。功能富集结果显示,EPHX2与补体途径、脂肪酸降解等信号通路有关。蛋白质互作网络结果显示,EPHX2与HAO1、AGXT、ACOX1、GSTκ1、SCP-2、CAT、CYP2C8,CYP2C9,CYP2B6,和CYP2J2等密切相关。GSEA结果显示,EPHX2低表达组与肝癌细胞增殖、肝癌复发等基因集正相关。荧光定量PCR和GEO数据集验证结果显示,EPHX2在肝细胞癌组织和肝癌细胞株中呈显著低表达。EPHX2在肝细胞癌中呈显著低表达,提示其可能在肝细胞癌发生发展过程中发挥抑癌基因作用,但具体作用机制还需进一步验证。     

肝细胞癌循环肿瘤细胞标志物及检测方法研究进展

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)在中国是一种高发病率和高死亡率的恶性肿瘤。肿瘤切除、肝移植是治疗该病最有效的手段,但术后的高复发率和高转移率是影响患者预后的重要因素。外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)是导致肝细胞癌术后复发和转移的必要因子。综述了CTCs的标记物——磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、转铁蛋白受体、甲胎蛋白、α-L岩藻糖苷酶、上皮细胞粘附因子、高尔基蛋白73和异常凝血酶原等,以及利用这些标记物检测CTCs的特异性和灵敏度,以期为肝细胞癌转移的早期检测、术后的复发、预后评估和选择治疗方案等提供依据。     

microRNA-215异常激活抑制Dicer1促进肝癌细胞迁移和转化

microRNA异常表达促进癌症的发生发展.本研究通过microRNA表达谱分析2个肝癌细胞和2个正常细胞microRNA的表达,寻找与肝癌相关的microRNA,发现microRNA-215在肝癌细胞中高表达,q RT-PCR验证microRNA-215在肝癌细胞呈显著高表达.进一步研究发现,microRNA-215直接靶向Dicer1基因的3′UTR并抑制Dicer1蛋白表达,Dicer1是microRNA加工成熟过程中必需的蛋白.过表达microRNA-215抑制Dicer1从而促进肝癌细胞迁移和转化,而抑制microRNA-215表达起相反作用.Dicer1抑制后,许多抑癌microRNA表达被抑制,从而促进迁移和转化.相对于癌旁组织,Dicer1在肝癌组织呈明显低表达.本研究揭示,microRNA-215异常活化并抑制Dicer1表达与肝癌发展相关.     

二氢丹参酮通过抑制Akt信号通路激活来增强索拉非尼对肝细胞癌的抗癌作用

目的 索拉非尼是唯一被批准用于治疗晚期肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的一线药物。然而索拉非尼的耐药性使得治疗效果并不理想。尽管索拉非尼耐药性的机制尚不清楚,但在HCC中的耐药性可能通过Akt信号通路的激活而发生。二氢丹参酮（dihydrotanshinone,DHT）是中药丹参的亲脂性成分,具有多种抗肿瘤活性并可抑制Akt活化。DHT联合索拉非尼治疗HCC的作用机制尚未明确。本文旨在研究DHT是否可增强索拉非尼对HCC的抗癌活性。方法 采用细胞计数试剂盒8（cell counting kit-8,CCK-8）和流式细胞仪检测索拉非尼和DHT对HCC细胞Huh7和HepG2细胞活力、细胞凋亡和药物敏感性的影响。通过蛋白质印迹分析Akt、P-Akt、Caspase3、GSK-3β、P-GSK3-β、核糖体蛋白S6激酶（S6K）、P-S6K、细胞周期蛋白D1、Bcl-xl、Bcl-2和Bax的表达水平。使用单因素方差分析（analysis of variance,ANOVA）和Dunnett检验对所有数据进行统计学比较。采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析。结果 DHT通过减少Akt的激活来抑制HCC细胞的增殖和促进细胞凋亡。DHT抑制Akt下游因子的表达和激活,包括GSK-3β和S6K,这些因子调节细胞凋亡反应,并被索拉非尼激活和上调。索拉非尼和DHT均下调细胞周期蛋白D1的表达,DHT上调Bax的表达并下调Bcl-2和Bcl-xl的表达。索拉非尼对Bcl-2家族蛋白质表达的影响不大。结论 DHT可能通过抑制Akt信号通路的激活来增强索拉非尼的HCC细胞增殖抑制作用和凋亡诱导作用。     

Novel Formula for Cell Kinetics in Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma Using Histologically Calculable Parameters

The growth rate of tumors should be assessed in terms of both tumor cell proliferation and death. The former is considered to be determined by growth fraction and cell-cycle time, whereas the latter is mainly determined by apoptosis, especially in tumors with a low level of necrosis. While most hepatocellular carcinomas (HCCs) in a relatively early stage contain only a small amount of necrosis, the growth rate supposedly depends mainly on growth fraction, cell-cycle time, and apoptosis. However, their quantitative relationship remains unknown. We have derived a novel theoretical formula for determining this relationship in nonnecrotic HCC, using Ki-67-positive index, apoptotic score, and a correction factor, all calculable by histological assessment without injecting labeling agents. Furthermore, we confirmed the reliability of this formula, using a xenograft model of human HCC with less than 15% necrosis. In this model the values of cell-cycle time calculated from the formula were very close to those estimated by a conventional double-labeling method and showed high correlations. Since our novel formula can clarify the cell kinetics without cumbersome labeling procedures, it is expected to be clinically applicable to HCC with a small portion of necrosis, using the radiographically measured growth rate and the histologically assessed cell kinetic parameters.