经血源子宫内膜干细胞培养、鉴定及体外分化潜能的研究

现阶段干细胞的来源常具有侵入性,该文旨在研究新来源于经血的经血源子宫内膜干细胞（menstrual blood-derived mesenchymal stem cells,MenSCs）的基本生物学特性及分化潜能。采用密度梯度法从女性经血中分离MenSCs,测定MenSCs群体倍增时间,流式细胞仪鉴定细胞表面抗原,免疫荧光法检测MenSCs nestin阳性表达情况,体外验证其成骨成脂分化潜能。结果表明,MenSCs具有典型的梭状结构,细胞倍增时间为32.2 h,均一地高表达CD29、CD90及CD105,不表达CD14、CD45、HLA-DR。免疫荧光表明,MenSCs为nestin阳性。MenSCs成脂诱导后,油红O染色为阳性。成骨诱导前期诱导组细胞胶原表达量升高,诱导两周后MenSCs形成钙结节,诱导组细胞ALP（alkaline phosphatase）活性连续3周呈上升趋势。以上证明,MenSCs具有来源广泛的优势,具有较高的增殖能力、较低免疫原性、nestin阳性及多向分化潜能等特性,可成为干细胞治疗的理想种子细胞。     

人蜕膜组织子宫内膜干细胞的分离、培养及鉴定

目的:研究人蜕膜组织中子宫内膜干细胞(endometrial stem cells,EnSCs)的分离、培养及鉴定方法。方法:取人工流产患者的蜕膜组织,用胰酶和II型胶原酶消化分离子宫内膜细胞,计数后,以极低密度接种于10 cm培养皿,分离单克隆贴壁细胞。倒置显微镜观察EnSCs形态变化及克隆形成情况;CCK-8法绘制EnSCs生长曲线,计算倍增时间;流式细胞仪分析EnSCs细胞周期及表面抗原CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD146表达情况。结果:EnSCs呈长梭形,成纤维细胞样,可见粗细不等的胞质突起,增殖至80-90%呈漩涡状生长,其克隆形成率分别为3.91%和9.14%;EnSCs生长曲线呈"S"型,接种48 h至60 h后进入对数生长期,于第9天达到平台期,倍增时间为37-52 h;流式细胞仪测定EnSCs表面抗原CD29(99.13%),CD44(97.39%),CD73(99.68%),CD90(96.76%),CD105(89.64%),CD146(77.96%)呈阳性表达,而CD31(1.30%),CD34(0.68%),CD45(1.26%)呈阴性表达,有61.79%的细胞处于G0/G1期,22.37%的细胞处于S+G2/M期。结论:采用组织消化法分离单克隆贴壁的子宫内膜细胞,能够获得纯化的EnSCs。     

子宫内膜干细胞及其与血管生成关系的研究进展

大量的临床观察和基础研究均提示,子宫内膜中存在一些干细胞,它们具有高度增殖、自我更新和的分化潜能。目前有学者研究子宫内膜干细胞是否可能成为子宫内膜病变患者进行内膜修复替代治疗的手段,以及是否可以在毛细血管重建及血管发生中发挥作用。虽然近年来在子宫内膜干细胞的鉴定和分离方面有了很大的进展,但对于它的特异性标志物仍在探索中。同时对子宫内膜干细胞的研究可为内膜异位症、子宫内膜癌等疾病的治疗提供新的思路。本文针对国内外研究者近年来在这发面的研究现状进行综述。     

组蛋白乙酰化对成体干细胞生物学性状的影响

成体干细胞（adult stem cells,ASCs）是指存在于一种已经分化组织中的未分化细胞,它们可以再生修复损伤的组织和器官,是组织工程和细胞治疗的理想细胞。但是ASCs在体外扩增过程中容易发生自主分化和衰老,影响其在临床的广泛应用。组蛋白乙酰化作为表观遗传调节的重要机制,参与细胞分化、衰老及凋亡等众多细胞活动的调控。该文就组蛋白乙酰化对成体干细胞生物学性状的影响进行综述。     

标记滞留细胞技术结合干细胞标记物检测小鼠子宫内膜干细胞

目的通过标记滞留细胞技术检测昆明小鼠子宫内膜干细胞的存在及其分布情况;观察P63和Musashi-1在不同周龄小鼠子宫内膜的表达以及两者与标记滞留细胞的关系,探讨P63和Musashi-1作为子宫内膜干细胞特异性标记物的可能性。方法出生3天雌性昆明小鼠皮下注射BrdU,分别在1w、2w、3w、4w、6w、8w和10w处死小鼠取其子宫。采用免疫组化法分别检测BrdU、P63和Musashi-1在各周龄小鼠子宫内膜的表达情况。结果标记后1w的小鼠,子宫内膜绝大部分的上皮和基质细胞都被BrdU标记。随着小鼠周龄的增加,子宫内膜BrdU阳性细胞百分率逐渐降低。至第8w时,仅在基质中有极少量的BrdU阳性细胞,主要位于基质与肌层交界处。早期小鼠子宫内膜组织中P63和Musashi-1阳性细胞数量较多,随着子宫内膜的逐渐发育成熟,P63和Musashi-1的表达逐渐减少,其表达规律及分布与标记滞留细胞基本一致。结论 (1)小鼠子宫内膜标记滞留细胞主要位于基质内膜与肌层交界处,这些细胞的分布与推测的子宫内膜干细胞的分布部位相符。(2)P63和Musashi-1是较特异的干细胞标记物。     

子宫内膜异位细胞改良体外培养技术的研究进展

体外细胞培养是子宫内膜异位性疾病研究的重要工具.本文回顾了细胞体外培养技术在分离、纯化环节的改良以及子宫内膜异位性疾病永生化细胞系改造中的研究进展,并总结了近几年来激素及细胞因子诱导培养、细胞共培养及三维培养技术在该疾病体外机制研究中的应用,并对其发展前景进行了展望.     

丹那唑对子宫内膜异位症大鼠异位内膜的影响

目的: 探讨丹那唑对子宫内膜异位症(内异症)大鼠异位内膜的影响.方法: 皮下注射丹那唑2、4、6和8周,观察其对异位内膜生长的影响;治疗8周后检测异位内膜白细胞介素-6(IL-6)mRNA的表达.结果: 治疗2、4、6和8周后,异位内膜体积缩小(P<0.01),逐渐呈萎缩状态;治疗8周后,异位内膜IL-6 mRNA表达明显减少(P<0.01).结论: 丹那唑使异位内膜逐渐萎缩退化,异位内膜IL-6 mRNA表达明显降低.     

体外培养对间充质干细胞生物学功能的影响

间充质干细胞是目前应用前景最广泛的优质再生医学资源,由于其没有配型、排异等问题,极其适合于临床研究和应用。为满足临床应用的大量需求,间充质干细胞的体外大规模扩增是必需的。然而体外培养的间充质干细胞随着传代次数的增加,会产生许多生物学变化。该文对在体外连续传代的间充质干细胞的细胞和分子水平上的特征和功能变化作一综述,旨在为进一步优化细胞治疗方案做出理论参考,力求为推动干细胞产业的标准化作出贡献。     

C-myc对子宫内膜细胞增殖和凋亡的影响

为了通过子宫内膜细胞实验检测原癌基因C-myc对子宫内膜癌发生发展的影响,本研究用蛋白免疫印迹法分别检测C-myc转染组和空白对照组中C-myc蛋白的表达情况;细胞计数盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)法分别检测C-myc转染组和空载体转染组的子宫内膜细胞活力;蛋白免疫印迹法分别检测C-myc转染组和空载体转染组的子宫内膜细胞增殖相关蛋白Ki67、凋亡相关蛋白Bax以及Bcl-2的变化;Annexin/PI流式分别检测C-myc转染组和空载体转染组的子宫内膜细胞凋亡率的变化。C-myc转染子宫内膜细胞后,细胞中C-myc蛋白表达明显高于空白对照组;C-myc转染子宫内膜细胞后,细胞活力显著低于空载体转染组(p0.05),Ki67蛋白的表达明显高于空载体转染组(p0.05);C-myc转染子宫内膜细胞后,促凋亡相关蛋白Bax的的表达显著高于空载体转染组(p0.05)以及抗凋亡相关蛋白Bcl-2的表达明显低于空载体转染组(p0.05);C-myc转染子宫内膜细胞后,细胞凋亡率明显高于空载体转染组(p0.05)。本研究表明,C-myc能够促进子宫内膜细胞增殖并诱导细胞凋亡,子宫内膜细胞的增殖过度和凋亡失衡在子宫内膜癌的发生发展中具有重要意义。     

输卵管积水对窗口期子宫内膜基因谱的影响

应用Affymetrix U133A2．0基因表达谱芯片分析正常志愿者、输卵管积水和输卵管阻塞三者在胚泡植入窗期子宫内膜基因的差异表达．正常样本与积水样本有显著差异表达的基因588个。正常样本与阻塞样本180个,积水样本与阻塞样本750个,三者均有显著差异表达的基因28个．该结果表明输卵管积水患者的低妊娠率可能与其容受性受影响相关．     

胎盘间充质干细胞的体外培养及其生物学特性研究

目的：探讨胎盘间充质干细胞（PMSCs）的体外分离和培养方法,建立稳定的PMSCs体外培养扩增体系。方法：将胎盘组织经胶原酶消化、密度梯度离心、贴壁筛选法分离,获得并培养人PMSCs,观察细胞形态及其超微结构;应用流式细胞术测定细胞周期及CD14、CD29、CD34、CD44、CD45的表达,研究其增殖和生长特性。结果：在体外培养条件下,人PMSCs贴壁生长,为成纤维细胞样,与骨髓间充质干细胞相似;CD14/CD34/CD45阴性,CD29/CD44阳性,核浆比大,细胞周期检测G0/G1期约占95%,具有原始细胞的特征。结论：体外获得的PMSCs形态单一、生长稳定、增殖能力较强,具有与骨髓间充质干细胞相似的细胞形态、表面标志。由于其来源方便、丰富,无伦理学限制,因此可进一步用于细胞治疗的研究。     

脐血CD-34单个核细胞来源间充质干细胞研究

目的 :探讨分离培养脐血CD-3 4 细胞来源间充质干细胞 (MSC)及研究其生物学特征。方法 :取足月妊娠健康产妇胎儿脐血 ,分离其中单个核细胞 (MNC) ,去除CD 3 4 细胞 ,体外用低糖型DMEM培养基培养。观察细胞形态、测定生长曲线、利用流式细胞仪对培养细胞进行表型测定、细胞周期分析、体外诱导分化实验以及检测造血因子的表达情况。结果 :脐血CD-3 4 细胞中可培养出间充质干细胞 ,可诱导向成骨和脂肪细胞分化并表达IL 6、SCF和SDF 1等造血生长因子。结论 :从足月妊娠健康产妇脐血CD-3 4 细胞可分离培养出间充质干细胞 ,具有与其它来源MSC类似的表型及分化潜能 ,在体外传代可保持其低分化状态并表达造血因子 ,可作为组织工程的种子细胞和具有促进造血作用     

Biological characteristics of human menstrual blood‐derived endometrial stem cells

Successful isolation of human endometrial stem cells from menstrual blood, namely menstrual blood‐derived endometrial stem cells (MenSCs), has provided enticing alternative seed cells for stem cell‐based therapy. MenSCs are enriched in the self‐regenerative tissue, endometrium, which shed along the periodic menstrual blood and thus their acquisition involves no physical invasiveness. However, the impact of the storage duration of menstrual blood prior to stem cell isolation, the age of the donor, the number of passages on the self‐renewing of MenSCs, the paracrine production of biological factors in MenSCs and expression of adhesion molecules on MenSCs remain elusive. In this study, we confirmed that MenSCs reside in shedding endometrium, and documented that up to 3 days of storage at 4°C has little impact on MenSCs, while the age of the donor and the number of passages are negatively associated with proliferation capacity of MenSCs. Moreover, we found that MenSCs were actually immune‐privileged and projected no risk of tumour formation. Also, we documented a lung‐ and liver‐dominated, spleen‐ and kidney‐involved organic distribution profile of MenSC 3 days after intravenous transfer into mice. At last, we suggested that MenSCs may have potentially therapeutic effects on diseases through paracrine effect and immunomodulation.     

肿瘤干细胞起源及其生物学特性

肿瘤干细胞与正常成体干细胞在自我更新与增殖分化能力、表型标记和强耐药性等诸多方面存在着相类似的生物学特征,所以肿瘤干细胞被推测为肿瘤发生的细胞起源。基于肿瘤干细胞与正常干细胞之间的相似性质和肿瘤发生的分子机制,科学家建立了一系列从肿瘤组织或肿瘤细胞系分离肿瘤干细胞的实验方法和研究肿瘤干细胞起源的动物实验模型。现就目前在肿瘤干细胞起源和生物学特性领域的研究作概括阐述。     

骨质疏松大鼠脂肪基质细胞成骨能力的研究

目的:探讨骨质疏松大鼠的脂肪基质细胞有无成骨能力。方法:采用去势法构建SD大鼠骨质疏松模型,设置2组样本,分别为19月龄骨质疏松SD雌性大鼠,正常19月龄SD雌性大鼠。每组大鼠分别取腹股沟脂肪垫中脂肪,用胶原酶消化法培养获得脂肪间充质干细胞,绘制并分析细胞生长曲线;再用经典的骨向诱导液诱导2组ASCs,比较2组细胞骨向分化能力有无差别。结果:骨质疏松大鼠与正常老龄大鼠的ASCs骨向分化能力无明显差别。结论:可用去势法构建SD大鼠骨质疏松模型,并可取其细胞行进一步研究。老龄骨质疏松大鼠的ASCs也可以考虑作为种子细胞促进其自体骨愈合,从而为利用自体ASCs促进骨质疏松骨愈合打下一定的理论基础。     

人外周血单个核细胞与脐带间充质干细胞共培养的AFM研究

采用原子力显微镜与倒置显微镜在细胞层次上观察了人外周单个核细胞(PBMCs)与同种异源脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)共培养的过程,并在单细胞水平上分析了共培养前后人外周单个核细胞的形貌和生物物理性质。结果发现:共培养后贴壁人外周单个核细胞的形态发生了很大的改变,并且表面分布着大小不一的颗粒状聚合物。利用AFM高空间分辨的力位移曲线测量系统,发现共培养72h后培养上清中人外周单个核细胞、贴壁的人外周单个核细胞的粘滞力分别是单纯培养72h的人外周单个核细胞的2倍、5倍,而细胞的硬度分别是单纯培养人外周单个核细胞的1.5倍、2倍。CCK-8检测提示,共培养过程中,干细胞的生长与外周血单个核细胞的生长出现了竞争作用。通过AFM探测人外周单个核细胞与脐带间充质干细胞共培养的可视化数据,有助于更好地了解间充质干细胞与外周血单个核细胞的相互作用。     

间充质干细胞来源的外泌体的特性及其在疾病治疗中的作用

外泌体(exosomes)是细胞主动向外环境中分泌的纳米囊泡结构,通常直径在100纳米以下。外泌体是来源细胞与靶细胞之间的物质交换和信息交流的新型载体,可以携带效应分子直接被周围细胞摄取或经血液循环至全身,在正常的生理过程或疾病的发生发展中发挥精细的调控作用。作为一种旁分泌介质,间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC）来源的外泌体(MSC-exosomes)能够起到与干细胞相似的生理作用。MSC-exosomes所携带的生物活性蛋白质、脂质及DNA、mRNA和非编码RNA等生物活性物质,可能是MSC发挥治疗作用的重要机制之一。本文针对外泌体的生物学来源和近年来MSC-exosomes的标志物与特异性内容物在产生释放、提取鉴定和生物学功能等方面的研究,以及未来的应用前景进行综述,有利于研究者们在该领域开展更深入的研究。     

胚胎干细胞的生物学特性及体外诱导分化

来源于早期胚胎的胚胎干细胞 (ES)和胎儿生殖脊干细胞 (EG)可在未分化状态下长期增殖培养 ,并保持其多向分化潜能 .体外培养ES细胞的条件已趋于稳定 ,国内外建立了来自人和多种动物早期胚胎的ES细胞系 .某些细胞因子和化学物质等可定向诱导ES细胞分化为各种不同类型的组织细胞 .ES细胞在胚胎发育、细胞分化、转基因动物、移植治疗、药物开发等领域具有广阔的应用前景 .     

脐带血来源间充质干细胞体外分离培养条件的优化

脐带血间充质干细胞（umbilical cord blood mesenchymal stem cells,UCB-MSCs）不仅可以作为滋养层细胞支持造血干细胞在体外的大规模扩增,在造血移植过程中还能够降低并发症的发生率以及加速造血重建功能的恢复．但是,目前UCB-MSCs的原代分离培养成功率一般只有30％左右,为进一步提高该成功率,利用正交实验方法对UCB-MSCs体外培养的主要影响因素：细胞的接种密度、细胞因子的组合及用量、是否添加血清和滋养层细胞,进行逐层筛选,并对培养出的间充质干细胞进行了流式细胞分析和向成骨、软骨及脂肪方向的诱导分化检测,以期获得UCB-MSCs培养的最佳方法．实验结果表明,细胞的接种密度是UCB-MSCs培养最显著的影响因素（P〈0．1）,接种密度越大,MSCs越容易生长,能够培养出MSCs的几率就越大,其次为细胞因子,添加细胞因子能有效地刺激MSCs的生长．在高接种密度的基础上,添加细胞因子IL-3（15μg／L）和GM-CSF（5μg/L）,可大大提高UCB-MSCs体外原代培养的成功率,从30％左右提高到90％以上．流式细胞检测结果显示,所分离培养的细胞表达间充质干细胞的抗原（CD13^＋、CD29^＋、CD44^＋、CD105^＋、CD166^＋）,不表达造血细胞的抗原（CD34^-、CD45^-、HLA-DR^-）,并能够向成骨、软骨及脂肪方向分化,这与源于骨髓的间充质干细胞相一致．所建立的培养方法能够为UCB-MSCs的临床应用提供大量优质的种子细胞．