miR-194-5p靶向下调 CD44 抑制胃癌肿瘤干细胞上皮间质转化的机制研究

摘要 目的：探讨miR-194-5p靶向下调 CD44 抑制胃癌肿瘤干细胞（CSCs）上皮间质转化（EMT）的相关分子机制。方法：采用 qRT-PCR检测胃腺癌细胞系（SGC-7901、MGC-803、SPAG-9和MNK-45） 和胃粘膜细胞（GES-1）中 miR-194-5p、CD44、Snail 和膜型基质金属蛋白酶-1（MT1-MMP） 表达量,Western blot检测CD44、Snail 和MT1-MMP蛋白表达量。体外构建miR-194-5p过表达和低表达质粒载体并进行慢病毒转染,实验分为过表达组、对照组和低表达组,qRT-PCR和Western blot检测miR-194-5p、CD44、Snail 和MT1-MMP的变化;CCK8法检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞凋亡率,Transwell实验检测细胞侵袭力,Western blot检测EMT标志物E-cadherin和N-cadherin蛋白表达量。结果：胃腺癌细胞系中miR-194-5p表达显著低于胃粘膜细胞,而CD44、Snail 和MT1-MMP表达量显著升高;SGC-7901和MGC-803与胃粘膜细胞的表达差异最明显（P＜0.05）。与对照组相比,过表达组miR-194-5p表达量明显升高,CD44、Snail 和MT1-MMP表达量显著下降,细胞增殖率和侵袭力下降,凋亡率升高,E-cadherin上调,N-cadherin下调（P＜0.05）。与对照组相比,低表达组miR-194-5p表达量明显下降,CD44、Snail 和MT1-MMP表达量显著增加,细胞增殖率和侵袭力升高,凋亡率下降,E-cadherin下调,N-cadherin上调（P＜0.05）。结论：胃癌中miR-194-5p低表达可能发挥抑癌作用,通过下调CSCs中CD44表达进而抑制EMT的发生。     

下咽癌放疗抵抗细胞放疗抗性与上皮–间质转化的关系

该文探讨了下咽鳞癌放疗抵抗细胞FaduRR发生放疗抵抗与上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的关系及可能的机制。课题组前期成功构建了放疗抵抗细胞株FaduRR。平板克隆形成实验、CCK8实验检测放疗抵抗性,流式细胞术检测细胞凋亡、细胞划痕和Transwell侵袭迁移实验检测迁移侵袭能力,Western blot和qRT-PCR实验检测蛋白和mRNA的表达。与亲本细胞Fadu相比,FaduRR细胞的放疗敏感性明显降低,X线照射后第4天的存活率明显增高、细胞凋亡率降低、细胞形态呈现上皮间质化的改变、细胞迁移侵袭能力增强、E-cadherin的蛋白和mRNA表达水平显著下调,而N-cadherin、Vimentin、p-Akt、p-GSK-3β、Snail的蛋白和mRNA表达水平显著上调,但Akt和GSK-3β的表达无明显变化。以上结果提示,下咽鳞癌放疗抵抗细胞株FaduRR发生了EMT改变,其机制可能与Akt/GSK-3β/Snail信号通路的激活有关。     

稳定干扰ITGB1抑制人乳腺癌BT549细胞迁移和侵袭

在人乳腺癌细胞系BT549中稳定干扰整合素β1(integrinβ1,ITGB1),研究其对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响。构建靶向干扰ITGB1基因的sh RNA慢病毒,感染BT549细胞,通过筛选成功获得稳定干扰ITGB1蛋白的BT-549细胞系,实验设空白对照组(Blank)、病毒感染阴性对照组(shNC)、ITGB1-shRNA慢病毒感染组(shITGB1);Real-time PCR和Western blotting法检测稳定干扰后ITGB1 mRNA和蛋白的表达情况;Western blotting法检测稳定干扰ITGB1后上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关标志蛋白(E-cadherin,Vimentin,N-cadherin,Fibronectin)的表达情况;利用划痕试实验和Transwell侵袭试实验分别检测稳定干扰ITGB1后细胞的迁移及侵袭能力。Real-time PCR和Western blotting结果显示,shITGB1组细胞ITGB1 mRNA和蛋白的表达水平显著低于Blank组和shNC组细胞(p0.01,p0.01)。Western blotting结果显示,稳定干扰ITGB1可部分逆转乳腺癌细胞BT549的EMT化;稳定干扰ITGB1后,上皮标志蛋白E-cadherin表达显著上调(p0.01),间质标志蛋白Vimentin(p0.05)、N-cadherin(p0.01)和Fibronectin(p0.01)的表达显著降低。划痕和Transwell侵袭试验实验结果显示,稳定干扰ITGB1后可显著降低乳腺癌细胞的迁移及侵袭能力(p0.05,p0.05)。在乳腺癌BT549细胞中稳定干扰ITGB1后,通过逆转EMT化抑制细胞迁移和侵袭。     

Snail真核表达载体的构建及功能鉴定

目的:构建Snail的慢病毒真核表达载体,并研究Snail在肿瘤发生和发展过程中对上皮-间质转化(EMT)的影响。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增Snail的全长编码序列,将其克隆到p CDH表达载体上,构建成p CDH-Snail真核表达载体,转染293T细胞,Western印迹检测p CDH载体介导的Snail的表达;与包装质粒共转染293T细胞,包装病毒后感染ZR75-1细胞,经嘌呤霉素筛选2周,得到稳定表达Snail的ZR75-1细胞株,检测ZR75-1细胞对EMT的影响,同时用倒置荧光显微镜观察ZR75-1稳定细胞株中上皮钙粘蛋白分布的变化。结果:Bam HⅠ、XbaⅠ双酶切及测序证实得到p CDH-Snail表达载体,Western印迹表明Snail在293T细胞内得到成功;经嘌呤霉素筛选,获得稳定表达Snail的ZR75-1细胞株;在倒置荧光显微镜下观察,ZR75-1稳定细胞株中的上皮钙粘蛋白绿色荧光明显减弱。结论:构建了p CDH-Snail的慢病毒真核表达载体,建立了稳定表达Snail的ZR75-1细胞,为进一步研究Snail在EMT过程中的机制奠定了基础。     

Chk1反义寡核苷酸联合顺铂抑制卵巢癌侵袭转移的分子机制

目的:探究Chk1反义寡核苷酸(CHK1-ASODN)单独或联合顺铂(DDP)对卵巢癌细胞系SKOV-3侵袭转移能力的影响,并阐明其可能的分子机制。方法:体外培养人卵巢癌细胞系SKOV-3,CHK1-ASODN单独或联合DDP处理48 h后,划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell实验检测细胞侵袭能力;显微镜下观察细胞上皮或间质表型特征;Western blot及实时定量PCR技术分别检测上皮间质转化(EMT)特异性标志物(E-cadherin、N-cadherin)以及EMT关键调控分子ZEB1的蛋白及m RNA的表达水平。结果:与对照组相比较,CHK1-ASODN单独或联合DDP均能显著抑制SKOV-3细胞的迁移及侵袭(P0.05);细胞表现为间质化表型;E-cadherin的表达显著升高(P0.05),而N-cadherin的表达则显著降低(P0.05);ZEB1的表达显著降低(P0.05)。结论:CHK1-ASODN单独或联合DDP下调ZEB1的表达进而逆转EMT可能是其抑制卵巢癌侵袭转移的重要机制之一。     

环状GMP-AMP合成酶高表达对乳腺癌细胞上皮间质转化的影响

目的:探讨环状GMP-AMP合成酶(cGAS)高表达对乳腺癌MCF7细胞发生上皮间质转化(EMT)的影响。方法:构建稳定高表达cGAS的慢病毒载体并转染MCF7细胞;转染后细胞分别培养12 h,24 h,48 h,72 h,每组实验重复三次,采用MTT检测cGAS对MCF7细胞增殖的影响; transwell法检测高表达cGAS对MCF7细胞迁移能力的影响;蛋白免疫印迹(Western blot)法分析EMT相关蛋白E-cadherin和N-cadherin的表达情况。结果:与对照组比较,cGAS上调后MCF7细胞增殖能力显著增强(P<0.05);细胞形态学观察显示cGAS上调后诱导MCF7细胞EMT发生,细胞形态由鹅卵石样变为梭形; transwell实验结果显示,cGAS上调导致MCF7细胞迁移能力增强(P<0.05); Western blot结果表明,cGAS上调后上皮标记蛋白E-cadherin表达下降(P<0.05),间质标记蛋白N-cadherin表达增加(P<0.05)。结论:cGAS上调可增强乳腺癌细胞的增殖和迁移能力,诱导乳腺癌细胞EMT发生...     

miR-145通过下调PLCε抑制膀胱癌EMT和迁移及其机制研究

目的:探讨miR-145调控PLCε对膀胱癌细胞T24上皮间质转化(EMT)和迁移的影响及可能的分子机制。方法:(1)腺病毒感染T24细胞,划痕实验和Transwell检测细胞的迁移能力;RTPCR、Western blot分别检测PLCε及EMT相关分子的表达;为探究其分子机制,Western blot检测GSK-3β磷酸化(Ser9位点)和Snail的表达情况。(2)利用生物信息学技术预测可能调控PLCε的miRNA,结合文献报道的膀胱癌microRNA表达谱结果筛选出miR-145;转染miR-145 mimics至T24,q PCR检测miR-145、PLCε的表达,Western blot检测PLCε的表达。(3)转染miR-145 mimics,Western blot检测EMT相关分子及p-GSK-3β、Snail;划痕实验、Transwell检测过表达miR-145后细胞的迁移能力。结果:(1)干扰PLCε表达能显著抑制细胞的迁移,同时,使T24细胞中E-cadherin表达上调,N-cadherin和Vimentin表达下调;干扰PLCε后,GSK-3β磷酸化(Ser9位点)水平下降,Snail表达降低。(2)转染miR-145 mimics可使T24细胞中miR-145表达增高,且明显抑制T24细胞中PLCε的表达。(3)在T24中过表达miR-145,细胞迁移能力显著下降,EMT标志分子的表达情况与沉默PLCε结果一致。同时,与阴性对照组相比,转染miR-145 mimics组p-GSK-3β和Snail表达显著减少。结论:PLCε通过GSK-3β/Snail信号通路促进膀胱癌细胞T24发生EMT及迁移,miR-145可以逆转PLCε诱导膀胱癌EMT的发生,从而阻止膀胱癌细胞的迁移。     

幽门螺杆菌致炎症微环境促进结肠癌SW620细胞发生EMT

该文探讨了幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, HP)炎症微环境对结肠癌SW620细胞发生上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transformation, EMT)的影响。使用ELISA方法检测HP干预U937细胞后上清中炎症因子MIF、IL-1β等的变化;采用RT-PCR方法检测MIF、IL-1β、NF-κB基因水平的变化;细胞划痕实验检测炎症上清处理SW620细胞后SW620细胞的侵袭迁移能力; CCK-8方法检测HP处理U937细胞后炎症上清对SW620细胞增殖活性的影响;免疫荧光实验检测炎症上清处理SW620细胞后SW620细胞EMT相关蛋白Vimentin的荧光变化; Western blot实验检测脂多糖(LPS)上清干预SW620细胞后EMT相关蛋白Vimentin、E-cadherin和N-cadherin的变化; Western blot实验检测HP干预U937细胞后NF-κB蛋白,炎症上清处理SW620细胞后EMT相关蛋白Vimentin、E-cadherin和N-cadherin的变化。结果显示, HP干预U937细胞后引起巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、白细胞介素-1β(IL-1β)和NF-κB等相关炎症因子及基因表达升高; CCK-8结果表明HP干预U937细胞后, U937细胞毒性增强;划痕实验结果表明在12 h、24 h、36 h时,随着时间点的推移, SW620细胞的侵袭迁移能力有所增强;免疫荧光实验结果显示SW620细胞Vimentin绿色点状聚集显著增加; Western blot结果显示在16 h、24 h时间点U937细胞NF-κB蛋白表达明显升高; LPS上清干预SW620细胞后Vimentin蛋白表达无明显变化,N-cadherin蛋白24 h组表达减少, E-cadherin蛋白增多, HP炎症微环境上清干预SW620细胞后12 h、24 h、36 h时,随着时间点推移SW620细胞Vimentin蛋白表达显著增加, E-cadherin和N-cadherin蛋白表达显著减少。该实验研究结果表明,幽门螺杆菌致炎症微环境可以促进SW620细胞发生EMT。     

五味子乙素联合紫杉醇对非小细胞肺癌细胞上皮-间充质转化的作用

[目的]探讨五味子乙素联合紫杉醇是否通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制非小细胞肺癌细胞上皮-间充质转化。[方法]选择人肺癌A549细胞,设PBS对照组、紫杉醇、五味子乙素、紫杉醇+五味子乙素组、紫杉醇+五味子乙素+PI3K抑制剂LY294002组。采用CCK-8检测细胞增殖;流式细胞术分析细胞凋亡及细胞周期;划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell小室实验检测细胞侵袭能力;免疫荧光染色检测N-cadherin、Vimentin分布;qRT-PCR检测细胞E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、Snail、Slug mRNA表达;Western Blotting检测E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、Snail、Slug、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达。[结果]与PBS对照组比较,紫杉醇+五味子乙素组细胞增殖率明显降低、细胞凋亡率明显增加(P<0.05),E-Cadherin mRNA和蛋白表达量明显增加,N-Cadherin、Vimentin、Snail、Slug mRNA和蛋白表达量明显降低(P&l...     

肝星形细胞分泌的趋化因子CXCL1在肝癌转归中的作用

该文探讨了人肝星形细胞(hepatic stellate cells,HSC)对肝癌细胞(Hep G2、SMMC-7721)的迁移、侵袭能力和上皮–间质转化(epithelial-msenchymal transition,EMT)的影响及其机制。采用条件培养法培养肝癌细胞,利用细胞划痕和Transwell实验分析肝星形细胞对肝癌细胞的迁移和侵袭作用。Western blot分析肝星形细胞自身及其分泌到培养液中趋化因子CXCL1[chemokine(C-X-C motif)ligand 1]和肝癌细胞的CXCL1受体2—CXCR2(CXCL1 receptor 2)的表达量,以及条件培养下肝癌细胞中p-PI3K、p-AKT、p-GSK-3β和Snail的表达变化。激光共聚焦显微术和Western blot检测肝癌细胞上皮标志物E-cadherin、间质标志物N-cadherin和Vimentin的表达变化。结果显示,在HSC中大量表达并分泌趋化因子CXCL1,而肝癌细胞Hep G2、SMMC-7721中高表达CXCR2。肝癌细胞通过条件培养后,细胞形态改变,细胞黏附下降,细胞迁移和侵袭能力增强,上皮标志物E-cadherin蛋白表达下调、间质标志物N-cadherin蛋白和Vimentin蛋白表达上调,PI3K/AKT信号通路中的关键成员PI3K和AKT磷酸化水平上调,p-GSK-3β和转录因子Snail表达上调。在肝癌细胞条件培养下加入CXCR2受体的特异性抑制剂(SB265610)后,肝癌细胞上皮标志物E-cadherin蛋白表达上调、间质标志物N-cadherin蛋白和Vimentin蛋白表达下调,p-PI3K、p-AKT、p-GSK-3β和Snail的表达下调。以上结果说明,肝星形细胞可能通过CXCL1/CXCR2轴活化PI3K/AKT信号通路并最终促进肝癌细胞上皮–间质转化。     

基于CRISPR/Cas9-SAM系统CHD5基因过表达慢病毒载体的构建及对膀胱癌T24细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的:利用CRISPR/Cas9-SAM系统构建CHD5基因过表达慢病毒载体,并分析其对膀胱癌细胞T24增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法:针对CHD5基因设计3个sgRNA (sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-3),将sgRNA连入LV-sgRNA-MS2-P65-HSF1-Neo载体,经293T细胞包装后获得高滴度慢病毒颗粒。病毒以MOI=10感染膀胱癌细胞T24。RT-qPCR和Western blot分别检测感染病毒后T24细胞CHD5 mRNA和蛋白表达水平,CCK8实验、流式分析、划痕实验和Transwell实验检测CHD5过表达对T24细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响。结果:成功构建CHD5过表达慢病毒载体。慢病毒感染T24细胞后,RT-qPCR和Western blot证实,T24细胞CHD5的mRNA和蛋白表达水平显著高于空白组和阴性对照组(P 0. 05),并且sgRNA-3-MS2-P65-HSF1序列的作用最为显著。CCK8及流式分析结果显示,过表达CHD5抑制T24细胞增殖,促进凋亡,与对照组相比,均有统计学意义(P 0. 001)。划痕和Transwell实验结果表明,过表达CHD5可抑制T24细胞迁移和侵袭能力(P 0. 01)。结论:成功构建CHD5过表达慢病毒。过表达CHD5能促进膀胱癌细胞T24凋亡,抑制其增殖、迁移和侵袭能力。     

microRNA-708-5p对骨肉瘤细胞凋亡与迁移的作用及机制

该文主要研究microRNA-708-5p(miR-708-5p)在骨肉瘤细胞中的表达及对细胞凋亡、迁移的影响及机制。该研究利用miRNA基因芯片筛选差异表达miRNA; qRT-PCR(quantitative Realtime PCR)检测miR-708-5p在骨肉瘤细胞株MG63和正常细胞hMSC、HS-5中的表达;通过阳离子脂质体介导法过表达miR-708-5p;分别用Hoechst 33258染色、流式细胞术、划痕实验、Transwell法检测凋亡和迁移;通过qRT-PCR检测miR-708-5p、ZEB1(Zinc?nger E-box binding homeobox 1)的RNA水平; Western blot检测E-cadherin、N-cadherin、ZEB1蛋白表达;利用TargetScan和双荧光素酶报告实验预测并验证miR-708-5p与ZEB1的靶向关系。结果显示, miR-708-5p在MG63中表达下调,恢复miR-708-5p表达水平可诱导MG63细胞凋亡并抑制迁移。Western blot结果显示,过表达miR-708-5p可上调E-cadherin,下调N-cadherin和ZEB1。双荧光素酶报告实验显示, miR-708-5p可直接靶向ZEB1。敲低ZEB1可抑制MG63迁移。该项研究结果表明, miR-708-5p可诱导骨肉瘤细胞凋亡,且通过靶向ZEB1来抑制迁移。     

鸦胆子油乳注射液可能通过调节JAK2/STAT3信号通路抑制胰腺癌AsPC-1细胞上皮–间质转化

该文旨在探讨鸦胆子油乳注射液(简称鸦胆子油乳)调节JAK2/STAT3信号通路对胰腺癌细胞上皮–间质转化(EMT)的影响。将胰腺癌AsPC-1细胞分为对照组、鸦胆子油乳低剂量组、鸦胆子油乳中剂量组、鸦胆子油乳高剂量组、鸦胆子油乳高剂量+Colivelin(JAK2/STAT3激活剂)组。该研究采用细胞划痕实验检测细胞迁移; Transwell实验检测细胞侵袭; MTT、EdU检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡率; qRT-PCR检测细胞JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表达; Western blot检测细胞JAK2/STAT3通路、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平。结果显示,与对照组相比,鸦胆子油乳低、中、高剂量组细胞活力、增殖率、细胞划痕愈合率、侵袭细胞个数、JAK2mRNA、STAT3 mRNA、N-cadherin、Vimentin、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表达水平显著降低,细胞凋亡率和细胞E-cadherin表达水平显著升高(P<0.05)。与鸦胆子油乳高剂量组相比,鸦胆子油乳高剂量+Colive...     

TGF-β1对AGS细胞上皮-间充质转化及体外侵袭的影响

目的观察转化生长因子-β1(TGF-β1)对人胃癌细胞株AGS发生上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)及体外侵袭的影响。方法将体外培养的AGS用TGF-β1干预后,倒置显微镜下观察细胞形态学的变化,MTT比色法检测TGF-β1对AGS增殖的影响,细胞划痕试验和Transwell侵袭试验检测细胞运动和侵袭力的改变;免疫荧光和Western blot检测snail、E-cadherin(上皮钙粘蛋白)、和N-cadherin(神经钙粘蛋白)表达的变化。结果TGF-β1诱导AGS向间充质细胞形态转化,低浓度促进细胞增殖,而高浓度时细胞增殖率逐步降低,且snail和间充质细胞表型N-cadherin表达上调,而上皮细胞表型E-cadherin表达下调,同时细胞运动和侵袭能力大大增强。结论TGF-β1可诱导AGS发生EMT,从而增加其侵袭、转移的能力。     

慢病毒介导雌激素受体β在乳腺癌细胞中的高表达抑制上皮细胞间质转化相关基因的表达

目的：建立稳定高表达雌激素受体β（ERβ）蛋白表达的乳腺癌ZR75-1细胞株,检测其对上皮细胞间质转化（EMT）相关基因的影响。方法：将编码人ERβ的cDNA序列插入慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro,将其与慢病毒包装辅助质粒共转染293T细胞后收集病毒上清,感染乳腺癌ZR75-1细胞,经嘌呤霉素筛选后获得稳定高表达含Myc标签的人ERβ的混合细胞集落,以及作为对照组整合有对照慢病毒载体pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro的混合细胞集落,提取细胞蛋白,用Myc抗体检测Myc-ERβ融合蛋白的表达,同时检测EMT相关基因Snail、E-Cadherin、N-Cadherin的表达水平和GSK-3β的磷酸化水平。结果：建立了稳定高表达Myc-ERβ融合蛋白的乳腺癌细胞株,和对照组相比,Myc-ERβ高表达抑制EMT相关蛋白N-cadherin和Snail的表达,增强E-cadherin分子的表达,抑制GSK-3β磷酸化水平。结论：建立了Myc-ERβ高表达的乳腺癌细胞株,发现ERβ高表达抑制EMT相关分子的表达,为深入研究ERβ分子在乳腺癌中调控EMT的机制奠定了基础。     

慢病毒介导的TPX2沉默对人宫颈癌HeLa细胞凋亡和侵袭的影响及机制

该文的目的是研究慢病毒介导的Xklp2靶蛋白(targeting protein for Xklp2,TPX2)沉默对人宫颈癌He La细胞凋亡、侵袭的影响及机制。构建4种载有TPX2-sh RNA的重组慢病毒及其阴性对照,将5种重组慢病毒分别稳定感染人宫颈癌He La细胞,利用实时荧光定量PCR和Western blot筛选出TPX2沉默效果最佳的一组He La细胞作为干扰组进行后续实验。采用Transwell基底膜侵袭实验测定各组细胞的侵袭能力。采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。Western blot检测TPX2-sh RNA转染前后细胞凋亡及侵袭相关蛋白质Bcl-2、Bax、Caspase-3、MMP9、TIMP-1及nm23-H1水平。结果显示,筛选出的RNA干扰慢病毒载体LV-TPX2-sh RNA-1可有效抑制He La细胞TPX2的表达;与对照组相比,干扰组的He La细胞凋亡率明显增加(P0.01);穿过Transwell小室基底膜细胞明显减少(P0.01)。He La细胞感染LV-TPX2-sh RNA-1能下调凋亡相关蛋白Bcl-2的表达水平,上调Caspase-3及Bax的表达水平(P0.05);上调侵袭相关蛋白质nm23-H1及TIMP-1水平,下调MMP9水平(P0.05)。以上结果表明,沉默TPX2表达能增加宫颈癌细胞的凋亡,可能与其上调Caspase-3及Bax水平,下调Bcl-2水平有关;沉默TPX2表达能抑制宫颈癌细胞侵袭能力,可能与其上调TIMP-1及nm23-H1水平,下调MMP9的水平有关。     

基于CRISPR/Cas9-SAM系统CHD5基因过表达慢病毒载体的构建及对膀胱癌T24细胞增殖,迁移和侵袭能力的影响 *

目的 利用CRISPR/Cas9-SAM系统构建CHD5基因过表达慢病毒载体,并分析其对膀胱癌细胞T24增殖,迁移和侵袭能力的影响.方法: 针对CHD5基因设计3个sgRNA(sgRNA-1,sgRNA-2,sgRNA-3),将sgRNA连入LV-sgRNA-MS2-P65-HSF1-Neo载体,经293T细胞包装后获得高滴度慢病毒颗粒.病毒以MOI=10感染膀胱癌细胞T24.RT-qPCR和Western blot分别检测感染病毒后T24细胞CHD5 mRNA和蛋白表达水平,CCK8实验,流式分析,划痕实验和Transwell实验检测CHD5过表达对T24细胞增殖,凋亡,迁移和侵袭能力的影响.结果: 成功构建CHD5过表达慢病毒载体.慢病毒感染T24细胞后,RT-qPCR和Western blot证实,T24细胞CHD5的mRNA和蛋白表达水平显著高于空白组和阴性对照组(P<0.05),并且sgRNA-3-MS2-P65-HSF1序列的作用最为显著.CCK8及流式分析结果显示,过表达CHD5抑制T24细胞增殖,促进凋亡,与对照组相比,均有统计学意义(P<0.001).划痕和Transwell实验结果表明,过表达CHD5可抑制T24细胞迁移和侵袭能力(P<0.01).结论: 成功构建CHD5过表达慢病毒.过表达CHD5能促进膀胱癌细胞T24凋亡,抑制其增殖,迁移和侵袭能力.     

TGF-β1对乳腺癌细胞系Snail表达的影响

目的通过TGF-β1诱导乳腺癌MCF-7发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)后检测锌指转录因子Snail表达的改变,探讨Snail在EMT及乳腺癌发生发展中的作用。方法常规培养乳腺癌细胞株MCF-7后,用TGF-β1诱导其发生EMT,用Transwell侵袭小室法进行细胞体外侵袭能力检测;用免疫组织化学方法及免疫荧光检测E-cadherin、Vi mentin、Snail的表达;用real ti me PCR检测E-cadherin、Vi mentin、Snail mRNA的表达。结果TGF-β1处理72h后的MCF-7细胞穿透能力明显增强。E-cadherin蛋白及mRNA表达减少,Vi mentin、Snail蛋白及mRNA表达增加。结论E-cadherin、Vi mentin是细胞发生EMT的重要生物学标志,Snail可能在转录水平上调控E-cadherin、Vi mentin蛋白的表达,Snail在EMT和乳腺癌的发生发展中起着重要的作用。