基于ITS2序列的獐牙菜属六种药材的分子鉴定

本文以獐牙菜属的六种药材为研究对象,采用MEGA 6.0软件确定ITS2序列的GC含量,基于K2P模型计算遗传距离,构建NJ树,ITS2 database在线分析二级结构等方法,研究ITS2条形码序列对六种药材的鉴别效果。结果表明,六种药材的ITS2序列长度范围为230~232 bp,平均GC含量为61.2%~64.0%。六种药材的种内变异均较小,其种间平均遗传距离为0.03~0.09。ITS2二级结构的茎环结构和四个臂均不同,NJ树结果显示,六种药材可分别聚为一支,呈现出明显的单系性。因此,ITS2序列可准确、有效地鉴别本研究的獐牙菜属六种药材,为这些药材的后续相关深入研究奠定了基础,也为獐牙菜属其他物种鉴定提供了参考。     

莪术基原植物DNA条形码序列的筛选与鉴定

为寻找适用于中药材莪术基原植物鉴定的DNA条形码序列,探索快速高效的莪术基原植物鉴定的新方法,该文首先利用扩增成功率和测序成功率对中药材莪术三种基原植物,9个样本的7种DNA条形码序列(ITS、ITS2、matK、psbA-trnH、trnL-trnF、rpoB和atpB-rbcL)进行评估,然后利用MEGA6.0软件对获得的高质量的序列通过变异位点分析、遗传距离计算和系统树分析等进一步进行评估,最后将筛选到的DNA条形码序列对未知基原的待测样品进行基原鉴定。结果表明:(1) ITS、ITS2和matK等条形码序列在莪术基原植物中的扩增或测序成功率较低,难以应用于实际鉴定;而psbA-trnH、trnL-trnF和rpoB条形码序列变异位点信息过少,不足于区分莪术的三种不同基原植物;只有atpB-rbcL条形码序列的扩增和测序成功率较高,容易获得高质量的序列,同时序列长度(642～645 bp)理想,变异位点多(11个),可实现莪术的三种不同基原的区分鉴别。(2)待测样品经基于atpB-rbcL序列构建的系统发育树鉴别为温郁金。综上所述,叶绿体atpB-rbcL序列能够准确鉴定莪术不同基原植物,可以作为中药材莪术基原植物鉴定的条形码序列。     

基于条形码ITS2序列的青天葵及其混伪品分子鉴别

通过分析青天葵及其常见混伪品的ITS2序列,建立青天葵新型真伪鉴别方法.采用植物基因组DNA提取试剂盒提取青天葵及其混伪品的叶片DNA,一对通用引物PCR扩增ITS2基因片段并直接双向测序.采用DNAMAN、ClustalX软件拼接比对序列,MEGA4.0软件构建NJ树,Schultz等建立的数据库和网站预测ITS2序列的二级结构.结果显示,获得的12条ITS2序列的长度范围为203-242 bp,GC含量范围为53.1％-71.8％.所有样品ITS2序列比对后的长度为249 bp,其中存在226个变异位点.青天葵种间K2P遗传距离(1.125)远大于种内K2P遗传距离(0.004).基于ITS2的序列的NJ树和二级结构均能直观地区分青天葵及其混伪品.     

云南红豆杉紫杉烷2α-O-苯甲酰转运酶基因的克隆及定性

通过RACE技术,克隆了云南红豆杉紫杉烷2α-O-苯甲酰转运酶基因(TyTBT),该酶催化2-去苯甲酰-7,13-二乙酰巴卡亭Ⅲ生成7,13-二乙酰巴卡亭Ⅲ,是紫杉醇合成途径中的关键酶之一.TyTBT基因cDNA全长1481 bp,含有1 320 bp的开放读码框,编码440个氨基酸的多肽,分子量为50 050 Da,等电点为6.17.氨基酸序列比对表明TyTBT同植物酰化酶家族的其它成员有较高的相似性,超过67%,同东北红豆杉和曼地亚红豆杉的紫杉烷2α-O-苯甲酰转运酶氨基酸序列的一致性和相似性达到最高,分别为95%和96%.广泛地比对分析证明这种较高的相似性在红豆杉属的其它酶家族中具有普遍性,进化树分析表明同东北红豆杉和曼地亚红豆杉的紫杉烷2α-O-苯甲酰转运酶(TBT)的相似性高于紫杉醇合成途径中的其它酰化酶.     

降香黄檀的DNA条形码鉴定研究

DNA条形码技术是利用基因组中一段短的标准序列进行物种的鉴定并探索其亲缘进化关系。本研究对采自海南不同地区降香黄檀五个居群24份样品的psbA-trnH,rbcL,核ITS及ITS2序列进行PCR扩增和测序,比较各序列扩增和测序效率。种间和种内变异,采用BLAST1和邻接 (NJ) 法构建系统聚类树方法评价不同序列的鉴定能力。结果表明ITS2在所研究的材料中具有最高的扩增和测序效率,而ITS扩增效率较低。ITS2完整序列在区分黄檀属不同种间差异具有较大优势。因此可利用ITS2从分子水平区分降香黄檀与其他混伪种。     

4种红豆杉属植物遗传多样性和遗传关系的RAPD分析

采用RAPD标记研究了分属于4种红豆杉属(Taxus Linn.)植物的68个单株的遗传多样性,并采用UPGMA方法分析68个单株的遗传关系.结果表明:12条RAPD引物共扩增出109条带,其中多态性条带108条,多态性条带百分率为99.1％;平均每条引物扩增出9.1条带.南方红豆杉[T.wallichiana var.mairei (Lemée et Lévl)L.K.Fu et Nan Li.]种内的多态性条带百分率和观察等位基因数均最高;欧洲红豆杉(T.baccata Linn.)种内的有效等位基因数、Nei's基因多样度和Shannon's信息指数均最高;须弥红豆杉(T.wallichiana Zucc.)种内的各项遗传多样性指数均最低.供试4种植物的种内遗传多样度、种间遗传多样度、基因流和种间遗传分化系数分别为0.1745、0.358 6、0.401 7和0.554 5,表明55.45％的遗传变异发生在种间.南方红豆杉和须弥红豆杉遗传距离最近;曼地亚红豆杉(Taxus×media Rehd.)和须弥红豆杉的遗传距离最远.通过聚类分析可将68个单株分为3组,欧洲红豆杉的18个单株和曼地亚红豆杉的18个单株分别各自聚为1组;须弥红豆杉的16个单株和南方红豆杉的16个单株聚为1组,其中须弥红豆杉的16个单株和南方红豆杉的16个单株又各自聚为1个亚组,且南方红豆杉的雌、雄单株也分别聚在同一分支上,表明须弥红豆杉和南方红豆杉遗传关系较近,而欧洲红豆杉与其他3种植物的遗传关系较远.     

曼地亚红豆杉植株中GGPP合成酶的克隆与分析

从 5年生曼地亚红豆杉 (Taxusmedia)的当年生新鲜枝叶中提取分离出mRNA ,然后根据已知植物的牛儿基牛儿基焦磷酸合成酶基因 (GGPPS基因 )DNA序列保守区设计特异简并引物。RT PCR获得了一条大小约 60 0bp的扩增谱带 ,回收该特异谱带并进行TA克隆 ,蓝白斑筛选 ,得到若干阳性克隆。经过质粒大小比较和PCR验证后 ,进行序列测定和同源性比较。发现该序列属于GGPP合成酶的片断 ,与Taxuscanadensis (AAD 1 60 1 8 1 )和Abiesgrandis (AAL1 761 4 2 )的GGPP合成酶相应区段的氨基酸序列一致性为 98%和 86%。蛋白质序列分析发现该序列含有一个特征的异戊二烯合成酶保守的结构域。进化树分析表明 ,曼地亚红豆杉GGPPS在进化上位于植物类 ,靠近古细菌类。曼地亚红豆杉GGPPS基因的克隆为研究红豆杉生产紫杉醇的分子机理和转基因植株的构建奠定了良好的基础。     

丹皮药材及其伪品、混淆品核糖体rDNA ITS2的序列分析

分析安徽道地药材丹皮（Paeonia suffruticosa Andr）及其伪品、混淆品核糖体DNA第二内转录间隔区（ITS2）的序列。分析丹皮的分子遗传多样性,为丹皮的真品药材基原鉴定提供分子依据。采用DNA克隆测序技术对从不同市场购得的丹皮样品及其伪品、混淆品的ITS2基因进行测序分析研究。丹皮与其伪品川赤芍、亳州芍药的rDNA-ITs2序列长度均为412bp。排序比较发现不同市场上的丹皮样品rDNA-ITs2序列变异位点丰富。鉴定出与丹皮真品（黄沙与白沙）及伪品的rDNA-ITS2序列完全相同的样品。其他样品的rDNA-ITs2序列与丹皮真品的差异明显。通过丹皮ITS2序列差异比较分析。ITS2序列可以作为鉴别丹皮药材真伪的一种手段。     

基于ITS2序列和HPLC指纹图谱鉴别琴叶榕及其近缘种CSCD

基于ITS2序列和HPLC指纹图谱建立琴叶榕及其近缘种的鉴别方法,为琴叶榕质量控制提供参考。采用MEGA6.0软件分析ITS2序列,计算K2P遗传距离,构建NJ树,ITS2 database在线分析二级结构。采用HPLC建立指纹图谱并测定补骨脂素和佛手柑内酯含量。琴叶榕ITS2序列长度210 bp,平均GC含量62.37%;近缘种的ITS2序列长度范围为218~232 bp,GC含量范围为60.25%~64.03%;琴叶榕种内K2P平均遗传距离小于琴叶榕与近缘种种间的平均K2P遗传距离;NJ树可将琴叶榕及其近缘种区分,且ITS2二级结构的臂数目、臂长度、臂上茎环数目、臂与臂的夹角均有明显差异。不同产地琴叶榕的HPLC指纹图谱相似度为0.902~0.981,确定10个共有峰,8号峰为补骨脂素、9号峰为佛手柑内酯,含量分别为1.01~4.80、0.96~4.88 mg/g;近缘种与琴叶榕对照图谱的相似度均小于0.807,全缘琴叶榕、条叶榕、粗叶榕的补骨脂素含量分别为0.38~0.63、1.08~1.32、2.45~14.73 mg/g,条叶榕、粗叶榕的佛手柑内酯含量分别为0.25~0.34、0.13~0.74 mg/g,全缘琴叶榕未检出佛手柑内酯。结果表明ITS2序列和HPLC指纹图谱可用于鉴定琴叶榕与近缘种,建立的HPLC指纹图谱简便,专属性强,重现性良好,为琴叶榕的质量评价提供了参考。     

山葡萄种质资源DNA条形码通用序列的筛选

对山葡萄(Vitis amurensis)种质资源样品的ITS、ITS2、psb A-trn H、rbc L和mat K序列进行PCR扩增及测序,优化PCR反应的退火温度,比较各序列的扩增效率、测序成功率、品种间和品种内的差异及barcoding gap图,使用BLAST和NJ树法比较不同序列的鉴定能力,最终从5条DNA片段中筛选出可用于山葡萄种质资源鉴定的DNA条形码通用序列。结果表明,在采集的11份33个山葡萄样品中,psb A-trn H和ITS2序列的扩增与测序成功率较高,其品种间、品种内差异及barcoding gap较ITS、rbc L和mat K序列具有明显的优势,且ITS2序列能够鉴别psb A-trn H序列无法鉴别的品种。实验证明,ITS2和psb A-trn H序列是较适合鉴别山葡萄资源的DNA条形码序列组合。DNA条形码弥补了形态学鉴定的不足,可为山葡萄种质资源的准确鉴定提供科学依据。     

Comparative lipidomics analysis of cellular development and apoptosis in two Taxus cell lines

A comparative lipidomics approach was employed to investigate the changes in membrane phospholipids during the procession of cellular development and apoptosis of two plant cell lines, Taxus cuspidata and Taxus chinensis var. mairei. Analysis of lipids by LC/ESI/MS(n) showed more than 90 phospholipid molecular species and indicated significant differences in the abundance throughout a 3-week period. Phosphatidic acid (PA), phosphatidylcholine (PC) and lysophosphatidylcholine (LysoPC) were three important lipid groups that were responsible for the discrimination between the apoptotic T. chinensis var. mairei and living T. cuspidata cells. Continuous increase of phospholipase D (PLD) activity led to PA production in apoptotic T. chinensis var. mairei cells suggesting that the PLD activation and PA formation mediated the apoptosis. Comparison of the profiles of phosphatidylbutanol (PtdBut) with those of PC or phosphatidylethanolamine (PE) indicated that PC rather than PE was the major substrate of PLD in vivo. These results suggest that the alternation of membrane phospholipids may regulate apoptosis, triggering an increase in taxol production of T. chinensis var. mairei cells.     

Morphometric analysis of the Taxus wallichiana complex (Taxaceae) based on herbarium material

We used morphological and geographical data of 128 herbarium specimens of the Taxus wallichiana complex in eastern Asia to investigate their utilization in discriminating and identifying taxa included in the complex. One bud scale and 26 leaf characters were used to separate T. fuana , T. wallichiana var. wallichiana , T. wallichiana var. mairei , T. wallichiana var. chinensis and T. sumatrana by K-means clustering and dendrograms using Ward's distance. Out of the 27 characters examined 21 were found to be well correlated with geographical patterns. T. fuana was morphologically the most distant taxon, while T. sumatrana clustered among the T. wallichiana varieties. After correcting misidentifications of the specimens in T. wallichiana , its varieties occupied discrete geographical ranges, except for some limited sympatry of varieties mairei and chinensis east of the Tanaka–Kaiyong line and the Sichuan Basin, China. Our analysis demonstrates the importance of consistency in character selection and definition in the identification of morphologically difficult taxa and the power of combining morphometric and geographical data in clarifying their spatial distribution.  © 2007 The Linnean Society of London, Botanical Journal of the Linnean Society , 2007, 155 , 307–335.     

美丽镰刀菌培养液对东北红豆杉悬浮细胞防御反应及紫杉醇合成的影响

美丽镰刀(Fusarium mairei)是一分离自南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)的产紫杉醇内生真菌,用B5培养基培养6 d,去菌尘幺后制得美丽镰刀菌培养液,并从中提取其胞外多糖.研究了4%(V/V)美丽镰刀菌培养液及4%(W/V)胞外多糖两种处理,对东北红豆杉(T.cuspidata)悬浮细胞防御反应及紫杉醇合成的影响.结果表明:两种处理均能诱导东北红豆杉细胞的防御反应.但美丽镰刀菌培养液的影响明显大于胞外多特(P<0.05).另外,两种处理均可促进东北红豆杉细胞紫杉醇的合成与释放.美丽镰刀菌培养液处理得到的紫杉醇与其释放率分别是对照的2.5倍8.8倍,而胞外多糖处理得到的紫杉醇与其释放率则分别是对照的1.5倍与3倍.     

山西历山珍稀药用植物AM真菌资源与土壤因子的关系

以山西历山自然保护区暴马丁香、连香树、南方红豆杉和领春木4种珍稀药用植物为材料,研究其根际土壤中丛枝菌根真菌(AMF)的菌根结构类型和种属分布,同时分析土壤因子与其侵染率和孢子密度的关系。结果表明:(1)暴马丁香菌根类型为中间型(I-型),连香树和领春木为重楼型(P-型),南方红豆杉为疆南星型(A-型);4种植物根际共鉴定AMF 27种,分别隶属于球囊霉属(Glomus)、无梗囊霉属(Acaulospora)、盾巨孢囊霉属(Scutellos-pora)、多孢囊霉属(Diversispora)和原囊霉属(Archaeospora)5属,其中Glomus为优势属。(2)pH与暴马丁香和领春木的侵染率和孢子密度呈正相关,但与连香树和南方红豆杉呈负相关;速效磷与暴马丁香、南方红豆杉和领春木的侵染率和孢子密度呈正相关,但与连香树呈负相关;碱解氮、有机质与暴马丁香、连香树和领春木的侵染率和孢子密度呈正相关,但与南方红豆杉呈负相关。(3)4种药用植物的菌根侵染率主要受其根际土壤碱解氮的影响,而根际AMF孢子密度主要受根际土壤pH制约。可见,历山自然保护区内AMF资源丰富,多样性程度也较高;宿主植物不同,土壤因子对其侵染率和孢子密度的影响也不同。     

南方红豆杉盆栽扦插育苗技术研究

南方红豆杉(Taxus chinensis var. mairei)是中国特有的国家一级保护植物。2009-2010年采用2年龄实生苗为采条母株进行室内盆栽扦插试验研究,结果表明:珍珠岩和河沙两种基质相比较,珍珠岩上生根率显著高于河沙,是更佳选择;用市售的"花语牌"快速促根剂配制成5、10、15、2 0mg/mL 4个浓度分别处理插穗基部并以蒸馏水作对照发现,10 mg/mL、15 mg/mL处理有利于生长,15 mg/mL处理后生根率显著高于5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL及对照。再以同一浓度生根粉分别浸泡4 h、8 h、10 h作对比发现,8 h和10 h处理后生长效果较好,10 h的生根率显著高于4 h、8 h。     

南方红豆杉内生真菌的多样性与群落结构

从南方红豆杉480个针叶与枝条组织块中分离到628株内生真菌,根据形态特征和ITS序列鉴定为28属43个分类单元.其中,包括10种丝孢菌、20种腔孢菌、12种子囊菌和1种未知真菌,茎生拟茎点霉为优势种;根据相对频率,链格孢、出芽短梗霉、博宁刺盘孢、盘长孢状刺盘孢、黑附球菌、Fungal sp.、砖红镰孢、围小丛壳、Magnaporthales sp.、稻黑孢、斑点拟盘多毛孢、小孢拟盘多毛孢、Peyronellaea glomerata和Xylaria sp.1等在南方红豆杉中比较常见.南方红豆杉受到内生真菌侵染的程度较高,81%的组织有内生真菌存在,其资源丰富并具有较高的物种多样性;内生真菌分布受组织性质影响,南方红豆杉针叶中内生真菌的定植率、丰富度、多样性明显低于枝条,枝条间内生真菌组成比针叶与枝条间更加相似,表现出组织偏好性或专一性;组织年龄影响内生真菌的群落结构,随着南方红豆杉枝条组织年龄的增长,内生真菌的定植率、丰富度、多样性均表现出逐渐增加的趋势.系统研究南方红豆杉内生真菌的多样性与群落结构,阐明内生真菌在植物组织中的分布规律,可以为南方红豆杉内生真菌的开发利用提供基础资料和科学依据;探讨病原真菌在健康植物组织中的存在情况,对于南方红豆杉的植物资源保护具有积极意义.     

南方红豆杉毛状根诱导体系的建立及毛状根中 紫杉醇的分离纯化研究

目的:研究发根农杆菌对南方红豆杉转化的转化体系和毛状根中紫杉醇的提取纯化工艺;方法:采用发根农杆菌对南方红豆杉不同外植体进行诱导,并对影响毛状根转化的因素进行分析。采用超临界CO2流体萃取法、硅胶柱色谱法以及高效液相法对毛状根中的紫杉醇进行分离提纯;结果:成功构建了南方红豆杉毛状根诱导体系。其中农杆菌的种类、外植体类型、预培养和共培养时间、培养基中激素浓度均影响毛状根的转化率。毛状根经高压纸电泳检测显示表达冠瘿碱。毛状根中紫杉醇经超临界CO2法提取及硅胶柱色谱法分离提纯,采用高效液相法分析显示其纯度可达到98%。结论:发根农杆菌诱导南方红豆杉产生的毛状根中可产生紫杉醇,可作为紫杉醇的主要来源。     

Inoculations with Pseudomonas fluorescens and Bacillus cereus affect the soil enzyme activity,growth and rhizosphere microbial diversity of Taxus chinensis var. mairei

Plant and Soil - Taxus chinensis var. mairei is a rare tree endemic to China. Pseudomonas fluorescens CLW17 and Bacillus cereus CLY07 were isolated from the T. chinensis var. mairei rhizosphere and...     

南方红豆杉无性系种群结构和动态研究

研究了元宝山南方红豆杉克隆种群的结构和动态．结果表明,种群S1～S6级个体均存在,S1、S2级个体占总个体数的64％．从元宝山南方红豆杉种群的大小级结构图看,结构呈较规则的金字塔形;南方红豆杉无性系幼树幼苗的贮备较为丰富,种群的年龄结构呈较规则的金字塔形,存活曲线近于倒J形;种群大小级动态指数Vpi=38．26％,考虑外部干扰时,Vpi′：6．38％>0,表现为稳定型种群．南方红豆杉种群更新的主要途径是无性繁殖,种群的数量动态主要受克隆内部调节机制以及外部环境的影响．生存分析结果表明,种群幼树幼苗的生存状态不稳定,死亡的可能性很大,而成年个体的生存状态则较为稳定．     

一株产紫杉醇的丝状真菌的系统分类鉴定

对一株从南方红豆杉中分离得到的内共生真菌Y1117,通过产物、形态学(包括培养特征、显微形态)和分子生物学(包括18S rDNA、ITS和TB基因)的系统鉴定,确认其为镰刀菌属的一个新种,命名为美丽镰刀菌(Fusarium mairei Cheng L.et Tao WY.)。