一种简单、快速、微量聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳方法

Bio-Rad公司的微量聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳(ModelⅢ Mini IEF Cell),不需要使用电极缓冲液,聚焦电泳时间仅用1.5小时,效果甚佳,但要使用该公司专有的凝胶支持薄膜,难于推广应用,我们经过试验,建立了一种简单、快速的微量凝胶等电聚焦电泳方法,40min完成等电聚焦过程,采用快速染色、脱色和干燥,将电泳图谱制成透明的薄膜,整个过程可以     

几种IgG提纯方法的抗体活性回收率和纯度

<正>缓冲液和一般方法 磷酸盐缓冲液为100mM氯化钠,20mM磷酸钠缓冲液,pH7.7。磷酸盐缓冲液(A)为10mM氯化钠,10mM磷酸钠缓冲液,pH6.8。正常血清缓冲液为磷酸盐缓冲液中含1:6(v/v)正常山羊血清,0.1％聚氧乙烯十二烷基醚(Brij 35)。蛋白质浓度以牛IgG作为标准溶液用计算280nm(E280)的消光值求得。     

小经验介绍——微波在蛋白质电泳染色和脱色中的应用

经过实验摸索和实践,我们发现一种利用微波处理在10 min内可使聚丙烯酰胺凝胶染色及脱色完成的方法.a 将电泳后的凝胶(厚度0 75 mm)取出,置于培养皿中用蒸馏水冲去残留缓冲液.b 加入染色液将凝胶完全浸泡其中,放入微波炉内高火档照射20 s,停留1 min,再照射10 s. c 取出染色液(回收还可再用2次),用蒸馏水冲去凝胶上残留染色液.d 加入脱色液,高火档照射20 s,取出脱色液,然后加入新鲜脱色液再照射20 s,重复 5～6次,直至背景清晰透明.     

回收凝胶中蛋白样品的电泳方法

近年来聚丙烯酰胺凝胶电泳和薄电点聚焦电泳已成为分析和纯化蛋白质的主要手段之一。从凝胶中回收蛋白样品的方法很多,我们参考了其中Otto和Strabfors等人的方法并加以改进,经过了一些摸索,建立了一种从凝胶中回收蛋白样品的电泳方法。此法稳定可靠,简易快速,回收率高,值得推广。材料与方法 1、圆盘电泳玻管(10cm×0.5cm),胶浓度6.2％,电极缓冲液(Tris-Gly,pH8.8),样品     

凝胶等电点聚焦电泳蛋白质的直接固定染色法

聚丙烯酰胺凝胶等电点聚焦电泳是一个分离蛋白质组分很有价值的方法。其优点是分辨率高、重演性好,且分离后的蛋白质区带的等电点亦大致可知,近年来该方法的应用越来越广。但等电点聚焦电泳后凝胶蛋白质区带的染色恰很费时而手续繁。由于两性电介质(Ampboline)也和染料牢固结合呈色,所以要花数天时间先把凝胶中的两性电介质脱净,方可染色。染色后又需进行长时间的背景脱色,才能得到区带清晰的蛋白质带谱。为此,一些研究者摸索了毋须预先脱去两性电介质的直接固定染色法。我们比较了Malik和Reisner的直染法,尤以Malik法效果最好。     

SDS电泳技术的实验考虑及最新进展

水平薄层SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是测定分子量的好方法。本文简述了方法的原理,技术的实验考虑和最新进展。提供了制胶的方法。指出了配制SDS电泳样品的关键。同时介绍了新的银染色方法和不使用缓冲液和滤纸桥,而使用缓冲液凝胶条作电极的最新进展。     

被SDS变性的蛋白质的电泳

LKB医药公司声称,在水平电泳系统中,采用该公司的预制Excel Gel~(TM)SDS(梯度为8～18)和Excel Gel~(TM)SDS缓冲胶条,可以不必做胶、配制缓冲液和切胶,就能在75分钟内高效地分离被SDS变性的分子量为6500～300000的蛋白质。凝胶的大小为110mm×245mm×0.5mm。薄层凝胶和冷却系统可加快分离、染色和脱色等过程,并提高蛋白带的分离度,在一块胶上可以走52个样,也可进行双向电泳。凝胶用塑料板支持,便于操作、分析和保存。Excel Gel SDS产品主要是与LKB医药公司的Multiphor~(TM)和Ultrophor~(TM)系统配合使用,但也可与FBE-3000和其他适当的水     

微波在蛋白质电泳染色和脱色中的应用

经过实验摸索和实践 ,我们发现一种利用微波处理在10ｍｉｎ内可使聚丙烯酰胺凝胶染色及脱色完成的方法 .ａ 将电泳后的凝胶 (厚度 0 75ｍｍ)取出 ,置于培养皿中用蒸馏水冲去残留缓冲液 .ｂ 加入染色液将凝胶完全浸泡其中 ,放入微波炉内高火档照射 2 0ｓ,停留 1ｍｉｎ ,再照射 10ｓ.ｃ 取出染色液 (回收还可再用 2次 ) ,用蒸馏水冲去凝胶上残留染色液 .ｄ 加入脱色液 ,高火档照射 2 0ｓ ,取出脱色液 ,然后加入新鲜脱色液再照射 2 0ｓ,重复5～ 6次 ,直至背景清晰透明 .实践中我们认为应注意以下几点 :ａ 盛试剂的培养皿上面应盖一稍大的培养…     

亲硫吸附层析法分离血清蛋白

人血清蛋白是用二乙烯砜( divinyl sulfone)活化的琼脂糖和β-疏基乙醇反应得到的基质(所谓T-凝胶)进行分离的。在高硫酸铵浓度下,几乎束缚所有的血清蛋白。其洗脱过程是采用逐步降低洗脱缓冲液的盐浓度完成的,洗脱收集的各级分是用熔合火箭免疫电泳法分析的。这种亲硫吸附层析一步法具有分辨力强和蛋白质回收率高的优点。用T-凝胶可快速、简便地从粗兔血清分离出基本纯的免疫球蛋白,其得率至少80％。     

果实蛋白质组学研究的实验方法

双向电泳技术是蛋白质组学研究的基本方法之一。果实由于富含糖、多酚、单宁和有机酸等物质,蛋白质的提取比其它植物组织更加困难。本文主要介绍不同果实蛋白质的提取、等电聚焦系统和凝胶染色技术,并建立了一套适用于桃、樱桃、苹果、芒果和冬枣等多种果实蛋白质组学的研究方法。结果表明,采用匀浆法和酚抽提法提取果实的蛋白质,裂解缓冲液2溶解蛋白质,并用固相pH梯度进行等电聚焦,可以获得背景清晰和分辨率高的凝胶图谱,具有较好的重复性,可用于果实蛋白质组学的研究。我们的研究结果显示,固相干胶条与IEF管胶相比,具有更加明显的优势。而不同的染色方法,对结果影响不大。     

果实蛋白质组学研究的实验方法

双向电泳技术是蛋白质组学研究的基本方法之一。果实由于富含糖、多酚、单宁和有机酸等物质,蛋白质的提取比其它植物组织更加困难。本文主要介绍不同果实蛋白质的提取、等电聚焦系统和凝胶染色技术,并建立了一套适用于桃、樱桃、苹果、芒果和冬枣等多种果实蛋白质组学的研究方法。结果表明,采用匀浆法和酚抽提法提取果实的蛋白质,裂解缓冲液2溶解蛋白质,并用固相pH梯度进行等电聚焦,可以获得背景清晰和分辨率高的凝胶图谱,具有较好的重复性,可用于果实蛋白质组学的研究。我们的研究结果显示,固相干胶条与IEF管胶相比,具有更加明显的优势。而不同的染色方法,对结果影响不大。     

橡胶树死皮病胶乳C-乳清差异表达蛋白质的筛选与鉴定

橡胶树死皮病(Tapping Panel Dryness,TPD)在世界各橡胶种植园普遍发生,给橡胶种植业带来严重的危害。为了更好地了解和阐明死皮病发生、发展的分子机制,本研究应用双向凝胶电泳技术（2-DE）比较橡胶树死皮株与健康株胶乳C-乳清蛋白质组表达的差异。采用固相pH梯度双向凝胶电泳分离橡胶树死皮株与健康株C-乳清的总蛋白质,凝胶经考染显色后,用PDQuest7.40图像分析软件进行比较分析,识别差异表达的蛋白质。这些点经过胶内酶切后进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析获取肽质指纹图谱(PMF),Mascot软件搜索SWISS-PROT和NCBInr数据库鉴定蛋白质。结果：①橡胶树死皮株与健康株C-乳清凝胶的平均蛋白质点数分别为1075±35和1134±27,其平均匹配的点数分别为982±38和1008±22,组内图像匹配率达91.89﹪和88.72﹪。②橡胶树死皮株与健康株C-乳清组间的平均匹配蛋白点数为970±25。利用MALDI-TOF-MS质谱技术对40个差异明显的蛋白点进行分析鉴定,通过查询数据库鉴定了27个蛋白质。本研究建立了分辨率高且重复性较好的橡胶树死皮株与 健康株胶乳C-乳清的双向凝胶电泳图谱,并应用质谱技术鉴定了其中表达差异的蛋白质点,这些差异表达的蛋白质可能参与了死皮发生和发展的过程。     

一种提高固定pH梯度（IPG）凝胶双向电泳的重复性、分辨率和通量的方法

在蛋白质组学研究中 ,双向聚丙烯酰胺凝胶电泳是现行蛋白质分离的最重要的方法之一。实验发展了一种提高固定pH梯度 (IPG)凝胶双向电泳的重复性、分辨率和通量的方法 :在一块SDS 聚丙烯酰胺凝胶上同时进行多块固定pH梯度(IPG)凝胶 (Multi stripsononeSDSgel,MSOG)电泳。用此方法比较了人肝癌细胞、不同生长状态的人肝癌细胞、3T3细胞的蛋白质以及同一个样品在不同大小的第二向凝胶系统 (大型和中型凝胶 )的双向电泳图谱。结果表明 ,同一样品在 13cmIPGStrip双向电泳可分离 2 0 0 0以上蛋白质点且图谱蛋白质点的匹配率可超过 95 %以上。同时又可以最大程度地降低凝胶背景对蛋白质点比较分析的干扰 ,从而提高了双向电泳分离蛋白质的分辨率和通量。这些优点都有助于差异蛋白质组学特别是细胞器差异蛋白质组学研究的自动化。     

改进的凝胶脱色方法

SDS-PAGE已成为分析蛋白质组分的一种常用方法。电泳后的凝胶需先染色显带,再行脱色处理,为促进脱色,常需多次更换脱色液。为了能省去换液步骤和节省试剂,可采取下面改进的脱色方法。 方法 于脱色平皿内较均匀地撒入适量(0.5—1g)的活性炭粉末,上覆盖一层新华滤纸,在倒入70     

适用于生菜叶片蛋白质双向电泳方法的建立及初步应用

以生菜(Lactuca sativa)叶片为研究材料,参考拟南芥和水稻的双向电泳方法,分析了等点聚焦时间和染色方法等影响双向电泳的关键因素,建立适合生菜叶片总蛋白质分离的双向电泳方法:采用三氯乙酸-丙酮沉淀法进行总蛋白质提取,用24cm固相pH梯度等电聚焦8000V×8h结合12%的SDS-PAGE进行双向电泳分离,银染法和考马斯亮蓝染色法染色都获得了较好的结果.应用Image-Master-Elite软件对考马斯亮蓝染色法染色的图谱进行分析表明:每张凝胶上都检测到超过1000个的蛋白质,不同凝胶之间蛋白质的匹配律达到98%,具有较高的分辨率和重复性.初步分析了生菜叶片蛋白质的等电点、分子量的分布情况,发现生菜叶片蛋白质的等电点以5.0～5.5之间最多而分子量主要集中在20～60kD之间.     

SDS电泳半干新技术

在SDS薄层凝胶水平电泳中应用半干技术缩短了电泳时间,提高了分辨率,简化了操作,免除经常大量配制电极缓冲液的麻烦．用滤纸条代替电极缓冲液和纸桥或代替凝胶条的新技术更方便．     

金属螯合亲和层析纯化金属硫蛋白

将二价铜离子螯合在Chelating Sepharose Fast Flow凝胶上制成亲和层析柱,锌诱导兔肝和镉诱导小鼠肝经匀浆、乙醇处理后上柱,用pH4.0的醋酸盐缓冲液平衡,再用pH5.2不同浓度的醋酸盐缓冲液分别洗脱,可得两个金属硫蛋白(MT)洗脱峰,经确定先后为MT-2和MT-1.分离方法比传统的凝胶过滤-离子交换法简单、省时,适于实验室规模分离纯化.     

一种利于蛋白质回收的快速SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色-脱色方法

在实践基础上摸索出一种快速并有利于蛋白质回收的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色-脱色方法：经常用的考马斯亮蓝R-250染色液短暂染色后直接用250 mmol/L KCl溶液脱色.这种方法染色-脱色的清晰程度与常规的染色-脱色方法接近,而且能使蛋白质回收率提高三倍多.     

豌豆球蛋白及其亚基的分离提纯

本文详细地叙述了提取、分离、提纯豌豆球蛋白及其亚基的方法:用硼酸钠缓冲液提取豌豆球蛋白,用85%饱和度硫酸铵沉淀除去其它蛋白质杂质,再用凝胶柱进一步提纯;提纯的豌豆球蛋白通过DE_(52)-纤维素阴离子树脂柱(8M尿素作为变性分离试剂)和S_(200)凝胶柱(70%甲酸作为变性分离试剂)则可分离出豌豆球蛋白的各个亚基;试验结果还表明:在pH8.5时,33,000的亚基携带少量负电荷;而12,000的亚基携带大量负电荷。     

聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质快速染色的改良法

聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的染色常采用考马斯亮蓝R250为染料进行染色,此法不仅操作繁琐、费时,而且由于需要脱色,很容易将一些染色较弱的蛋白区带颜色褪去,使之不能观察,灵敏度只能达到0.25μg。Reisner等人报道了以考马斯亮蓝G250为染料的快速简便染色方法,它能迅速地观察到凝胶中