肠毒素大肠杆菌定居因子CFA／I和CS6在减毒福氏志贺氏菌中的共表达

定居因子CFA／I和CS6是肠毒素大肠杆菌(ETEC)中重要的两种优势抗原,是ETEC疫苗研制的首选组分。采用基因重组技术将二者构建在asd基因为选择标记的重组质粒上,与asd基因缺失突变型减毒福氏志贺氏菌FWL01构成宿主．载体平衡致死系统,实验结果表明,重组疫苗候选株能够稳定表达CFA／I和CS6抗原,并可在菌体表面形成相应菌毛。重组菌口服免疫BALB／c小鼠后,可诱生相应的抗CFA／I和CS6的特异性血清抗体IsG和分泌型抗体sIgA．说明以志贺氏菌为载体．可以构建同时表达多个定居因子抗原的ETEC多价菌苗。     

肠毒素大肠杆菌CS3定居因子抗原和融合肠毒素基因在减毒痢疾杆菌中的共表达

肠毒素和定居因子抗原 (CFAs)是肠毒素大肠杆菌 (ETEC)两种主要的致病因素。有效的ETEC疫苗应包括这两种成分。采用基因重组技术 ,将定居因子CFA/II的共有抗原成分CS3菌毛抗原和LT B/ST融合肠毒素基因克隆至以asd基因为选择标记的重组质粒上 ,与asd基因剔除的弗氏志贺氏菌Fwl0 1构成了宿主 载体平衡致死系统。结果表明 ,在无抗生素条件选择的情况下 ,该重组菌可稳定表达CS3菌毛抗原和LT B/ST融合肠毒素抗原。通过口服和鼻饲方式免疫小鼠 ,可诱生相应的血清IgG抗体 ,同时能够检测到分泌型IgA的产生 ,表明该重组菌可以有效的诱导产生粘膜免疫。     

肠毒素大肠杆菌定居因子CS3和肠毒素融合抗原基因在减毒鼠伤寒沙门氏菌中的共表达

不耐热肠毒素（LT）和耐热肠毒素（ST）是产肠毒素大肠杆菌的主要致病因素,CS3为该菌的优势定居因子,是定居因子CFA/Ⅱ菌毛抗原的共有抗原组分。采用基因操作技术将编码CS3和融合肠毒素蛋白基因转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗侯选株X4072中进行表达。用重组菌株口服免疫小鼠后,免疫动物能产生抗CS3、LT和ST的血清抗体。特别有意义的是,所产生的抗ST抗体能中和天然ST的生物活性。这一结果为研究载体疫苗防治肠毒素大肠杆菌腹泻疾病奠定了基础。     

肠毒素大肠杆菌定居因子CS6蛋白的纯化和抗体制备

将大肠杆菌E519／66A在CFA固体培养基上培养,收菌后经热水浴脱蛋白、硫酸铵分级盐析、超速离心及S-200柱纯化,获得了相对分子量约14600的高纯度CS6蛋白。用其免疫家兔,然后颈动脉采血。ELSIA法检测血清,测得效价为1：32000。Westem印迹证实CS6抗原蛋白可特异性结合抗CS6多克隆抗血清。本研究建立了分离纯化肠毒素大肠杆菌定居因子CS6抗原蛋白的有效方法;获得了高纯度的野生型定居因子抗原CS6蛋白及相应的多克隆抗血清。对于进一步研究肠毒素大肠杆菌腹泻疫苗具有重要意义。     

肠毒素大肠杆菌定居因子CS6抗原基因在痢疾杆菌中的表达

通过体外重组的方法,将asd基因插入重组表达质粒,使抗生素抗性失活,并与弗氏志贺氏菌FWL01构成宿主-载体平衡致死系统. 通过蛋白质印迹结果表明,在没有抗生素条件选择的情况下,可稳定表达肠毒素大肠杆菌定居因子抗原CS6. 重组菌通过口服和鼻饲免疫小鼠后,可以诱生CS6血清IgG抗体;同时可以检测到分泌型IgA产生,表明重组菌可以诱导相应的黏膜免疫反应.     

肠毒素大肠杆菌定居因子抗原基因CFA—1在痢疾杆菌中的表达

通过体外重组的方法,构建了包含asd基因的重组表达质粒pZHY21,与福氏志贺氏菌Fwl101构成了宿主－载体平衡致死系统,Westem印迹结果表明,在没有抗生素条件选择的情况下,稳定表达肠毒素大肠杆菌定居因子抗原CFA－I。电镜结果显示,在重组菌株的菌体表面,表达产物能够装配成菌毛。重组菌通过口服和鼻饲免疫小鼠后,可以诱生CFA－I的抗体;同时可以检测到分泌型IgA产生,表明重组菌可以诱导相应的粘膜免疫反应。     

肠毒素源性定居因子CS6在减毒伤寒沙门氏菌中表达及免疫原性的研究

将编码肠毒素源性大肠杆菌定居因子抗原CS6基因克隆至pXL670,转化asd基因突变的E.coli X6097,获得重组质粒pSS64,再将后者转化至减毒的△aroA、△aroC、△asd伤寒沙门氏菌,构建了无药物抗性且稳定的大肠杆菌和伤寒双价菌苗候选株。小鼠腹腔免疫和攻击实验表明,该菌株对伤寒沙门氏菌毒株的攻击具有良好的保护作用。家兔免疫实验证明,该菌株能产生抗CS6和伤寒菌Vi抗原的血清抗体。     

肠毒素性大肠杆菌CS3纤毛抗原在痢疾菌中的表达及其免疫效果研究

首先通过体内外重组的方法,构建了福氏2a痢疾菌T32asd基因缺陷的突变体FaD,作为抗原载体菌;同时,构建包含asd基因的表达质粒pYX102,与FaD一起,构成宿主-载体平衡致死系统,用于在没有抗生素条件选择的情况下,稳定表达克隆在表达质粒上的外源抗原基因.将肠毒素性大肠杆菌的CS3菌毛抗原基因克隆至pYX102,构建成重组表达质粒pYX103,ELISA检测结果证实CS3在痢疾菌中可以很好地表达.免疫小鼠后可诱生相应的抗体,虽然口服免疫和注射免疫产生的CS3抗体效价有一定差别,但对痢疾菌的毒株攻击均可提供较好保护.该结果为细菌性腹泻疫苗的研制提供了候选株.     

肠毒素性大肠杆菌CS6菌毛抗原与霍乱毒素B亚基在痢疾菌中的表达及其免疫学效果

构建了携带asd、霍乱毒素B亚基(CTB)基因的表达质粒pYX201,与福氏2a痢疾菌T32的△asd突变株FaD构成宿主质粒平衡致死系统,用于在没有抗生素选择压力的情况下,稳定表达CTB抗原基因。以此为基础,构建了单独表达肠毒素性大肠杆菌CS26菌毛抗原基因的重组质粒pYX202,以及同时表达CS6和CTB的共表达质粒pYX203。Western blotting和ELISA检测结果证实CS6及CTB在痢疾菌FaD中可以有效表达。重组菌免疫家兔后可诱生相应的血清抗体,特别是CTB的抗体效价较高,并持续较长时间。本研究为细菌性腹泻疫苗的研究提供了候选株。     

肠毒素大肠杆菌定居因子抗原基因CFA-I在痢疾杆菌中的表达

通过体外重组的方法 ,构建了包含asd基因的重组表达质粒 pZHY2 1,与福氏志贺氏菌Fwl0 1构成了宿主 载体平衡致死系统 ,Western印迹结果表明 ,在没有抗生素条件选择的情况下 ,稳定表达肠毒素大肠杆菌定居因子抗原CFA I。电镜结果显示 ,在重组菌株的菌体表面 ,表达产物能够装配成菌毛。重组菌通过口服和鼻饲免疫小鼠后 ,可以诱生CFA I的抗体 ;同时可以检测到分泌型IgA产生 ,表明重组菌可以诱导相应的粘膜免疫反应     

Epitope Specificity of a Monoclonal Antibody Generated against the Dissociated CFA/I Fimbriae of Enterotoxigenic Escherichia coli

A monoclonal antibody (MAb 84) raised against the dissociated CFA/I fimbriae of enterotoxigenic Escherichia coli was characterized with regard to antigen binding and epitope specificity. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) showed that MAb 84 had higher affinity to CFA/I subunits than to intact CFA/I fimbriae and recognized a Salmonella flagellin carrying an insert corresponding to amino acids 32 to 45 of the CFA/I subunit. Fine epitope mapping based on the Pepscan technique showed that the peptide ³⁹TFESY⁴³, derived from the sequence of the mature CFA/I subunit, was specifically recognized by MAb 84. The ³⁹TFESY⁴³ sequence is probably not accessible on the surface of the native CFA/I fimbriae since MAb 84 did not bind to intact fimbriae as evaluated in inhibition ELISA tests. Moreover, MAb 84 did not agglutinate fimbriated ETEC cells nor inhibit CFA/I-mediated hemagglutination or the adhesion to Caco-2 cells.     

A Chimeric protein of CFA/I,CS6 subunits and LTB/STa toxoid protects immunized mice against enterotoxigenic Escherichia coli

Enterotoxigenic Escherichia Coli (ETEC) strains are the commonest bacteria causing diarrhea in children in developing countries and travelers to these areas. Colonization factors (CFs) and enterotoxins are the main virulence determinants in ETEC pathogenesis. Heterogeneity of CFs is commonly considered the bottleneck to developing an effective vaccine. It is believed that broad spectrum protection against ETEC would be achieved by induced anti‐CF and anti‐enterotoxin immunity simultaneously. Here, a fusion antigen strategy was used to construct a quadrivalent recombinant protein called 3CL and composed of CfaB, a structural subunit of CFA/I, and CS6 structural subunits, LTB and STa toxoid of ETEC. Its anti‐CF and antitoxin immunogenicity was then assessed. To achieve high‐level expression, the 3CL gene was synthesized using E. coli codon bias. Female BALB/C mice were immunized with purified recombinant 3CL. Immunized mice developed antibodies that were capable of detecting each recombinant subunit in addition to native CS6 protein and also protected the mice against ETEC challenge. Moreover, sera from immunized mice also neutralized STa toxin in a suckling mouse assay. These results indicate that 3CL can induce anti‐CF and neutralizing antitoxin antibodies along with introducing CFA/I as a platform for epitope insertion.

     

Identification of a putative pathogenicity island in Shigella flexneri using subtractive hybridisation of the S. flexneri and Escherichia coli genomes

The genetic differences between the human pathogen, Shigella flexneri, and the non-pathogenic Escherichia coli were investigated in an attempt to identify pathogenicity islands (PAIs) in the S. flexneri genome. Genomic subtraction identified a large unique region of DNA which was present in S. flexneri serotype 2a but absent from E. coli K-12. This 42-kb DNA segment was localised to the S. flexneri chromosome and was found to contain a number of elements often associated with PAIs including: insertion sequence elements, bacteriophage genes, and a previously identified Shigella virulence gene (criR). These findings indicate that this region may form a new PAI in the S. flexneri genome.     

弗氏志贺菌5a 型 M90T 株 ClpB 蛋白在大肠杆菌中的融合表达和纯化

目的：构建弗氏志贺菌cZp8基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达后,纯化带T7标签的ClpB蛋白。方法与结果：PCR扩增得到线性化表达载体pET24a与2574bp的c加曰基因片段,利用不依赖连接反应的克隆法（LIC）进行克隆,得到重组质粒pET-ClpB,转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达,通过一系列条件优化,确定可溶性表达条件为在30℃下、用1mmol／LIPTG诱导2h;利用抗T7单克隆抗体琼脂糖珠进行亲和纯化,得到了纯度很高的相对分子质量为95×10^3的ClpB-T7融合蛋白。结论：实现了ClpB-T7在大肠杆菌中的可溶性表达,并纯化获得了高纯度的融合蛋白。     

弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白的融合表达和纯化

目的：原核表达重组弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白,为其功能研究奠定基础。方法：用PCR方法从弗氏2a志贺氏菌2457T株染色体中扩增YciD蛋白编码序列,经过纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,构建重组载体pET32a-yciD,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得工程菌株,对其表达和纯化条件进行优化;利用Western Blot检测融合蛋白的表达。结果：构建了YciD蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;经Ni-NTA亲和层析柱纯化获得了高纯度的YciD蛋白;Western Blot表明,此蛋白可与His标签抗体反应,表明获得了目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达、纯化弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白,为进一步对其进行功能研究奠定了基础。