gTME构建共发酵木糖和葡萄糖的重组酿酒酵母

利用全转录工程（gTME）方法将全局转录因子spt15随机突变并克隆表达, 构建突变库。将突变基因连接到表达载体 pYX212上, 醋酸锂法转化入不利用木糖的酿酒酵母YPH499中, 经特定的培养基初筛获得高效利用木糖并共发酵木糖和葡萄糖的酿酒酵母重组菌株。对获得的重组菌株进行了初步研究, 该菌株能够很好的利用木糖并共发酵木糖和葡萄糖。在30oC, 200 r/min, 发酵96 h时, 50 g/L木糖和葡萄糖的利用率为94.0%和98.9%, 乙醇产率为32.4%和31.6%, 原始菌株乙醇产率为44.3%; 当木糖和葡萄糖以质量比1:1混合发酵时, 木糖和葡萄糖利用率分别为91.7%和85.9%, 乙醇产率为26%。木糖醇的含量极低。     

代谢木糖和葡萄糖的重组酿酒酵母的构建

为使酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）YS58代谢木糖产乙醇,采用PCR方法克隆得到树干毕赤酵母（Pichia stipitis）木糖醇脱氢酶基因xy12,并将该基因和克隆得到的休哈塔假丝酵母（Candida shehatae）缺终止子的木糖还原酶基因xyl1一起连接到酵母表达载体pYES2的强启动子GAL下,得到融合表达载体pYES2-P12。通过醋酸锂转化的方法将pY-ES2-P12转入S.cerevisiae YS58中,得到S.cerevisiae YS58-12。利用所构建的重组酿酒酵母进行术糖发酵实验,结果表明该重组酵母能发酵木糖,使木糖利用率得到进一步提高,最高达到81．3％,而且能代谢木糖产生乙醇。     

利用不同启动子控制木糖代谢关键酶基因构建可共代谢葡萄糖木糖重组酿酒酵母

利用不同强度的启动子调控木糖代谢关键酶活性,构建稳定代谢葡萄糖和木糖产乙醇的重组酿酒酵母。以本实验室专利菌株Saccharomyces cerevisiae Y5为宿主菌,将树干毕赤酵母Pichia stipitis CBS6054的木糖还原酶基因XYL1和木糖醇脱氢酶基因XYL2置于磷酸甘油酸激酶基因启动子(PGKp)控制下,酿酒酵母Y5内源的木酮糖激酶基因XKS1分别由己糖激酶基因启动子(HXK2p)及其内源启动子(XKS1p)控制。这3个基因连同各自表达元件导入宿主细胞中,打通其木糖上游代谢途径。酶活测定结果显示,HXK2p对木酮糖激酶表现出更强的启动效率。重组菌Y5-X3-1中木糖还原酶/木糖醇脱氢酶/木酮糖激酶(XR/XDH/XK)的酶活比值为1∶5∶4,其木糖消耗量是宿主菌的5倍,最高乙醇产量为24.35 g/L,达到理论值的73%。结果表明,通过调节XYL1、XYL2及XKS1启动子的强度,调控其表达水平,进而改变3种酶的活性水平,对于提高重组酿酒酵母利用木糖发酵产乙醇有明显效果。     

代谢木糖和葡萄糖的重组酿酒酵母的构建*

为使酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS58代谢木糖产乙醇,采用PCR方法克隆得到树干毕赤酵母(Pichia stipitis)木糖醇脱氢酶基因xyl2,并将该基因和克隆得到的休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)缺终止子的木糖还原酶基因xyt1一起连接到酵母表达载体pYES2的强启动子GAL下,得到融合表达载体pYES2-P12。通过醋酸锂转化的方法将pY- ES2-P12转入S．Cerevisiae YS5     

一株葡萄糖和木糖共发酵高效产乙醇重组运动发酵单胞菌的性能评价

木糖是木质纤维素原料水解液中的第二大组分,木糖和葡萄糖的充分利用是有经济性地生产纤维素乙醇的关键。通过基因克隆手段构建了一株可以高效利用木糖产乙醇的重组运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis TSH01,并进行了利用单糖溶液、混合糖溶液及玉米秸秆水解液发酵产乙醇效率的研究。结果表明,利用单一葡萄糖或单一木糖溶液发酵时,当糖浓度为8%、发酵72 h后,糖利用率分别为100%和98.9%,乙醇代谢收率分别为87.8%和78.3%;利用8%葡萄糖和8%木糖的混合溶液发酵时,72 h后,葡萄糖和木糖的利用率分别为98.5%和97.4%,乙醇代谢收率为94.9%。利用含3.2%葡萄糖和3.5%木糖的玉米秸秆水解液发酵72 h后,葡萄糖和木糖的利用率分别为100%和92.3%,乙醇代谢收率为91.5%。此外,磷酸二氢钾对发酵过程中木糖利用率以及乙醇收率的提高有明显促进作用。     

木糖发酵重组菌研究进展

木糖发酵是植物纤维原料生物转化制取乙醇商业化生产的基础和关键 ,但自然界存在的微生物菌株不能满足商业化生产的需要。利用基因工程技术对细菌和酵母进行改造 ,以提高它们在厌氧条件下的木糖发酵能力成为目前研究和开发的重点。通过转基因和基因删除技术 ,主要对Escherichiacoli、Zymomonasmobilis、Pichiastipitis和Saccharomycescerevisiae等典型的乙醇发酵菌株实施基因改造 ,构建出一系列不同类型的木糖发酵重组菌株。与野生型菌株相比 ,重组菌株在厌氧条件下的木糖发酵能力得到了不同程度的改善 ,但是它们仍然未能投入于商业化生产。微生物的木糖代谢工程和木糖发酵重组菌株的构建有待于进一步的深入研究 。     

宿主遗传背景对重组酿酒酵母木糖共发酵影响的研究进展

木糖是纤维素原料水解液中最主要的五碳糖成分,由于野生的酿酒酵母缺乏有效的木糖利用途径,将外源木糖代谢途径整合至酿酒酵母中使其具有发酵木糖生产乙醇的能力是构建纤维素乙醇发酵菌株的关键。国内外学者的研究表明,同一木糖代谢途径导入不同酿酒酵母菌株中,所得到的重组菌发酵性能存在明显差异,表明宿主的遗传背景对菌株利用木糖能力和发酵性能具有重要的影响。就酿酒酵母宿主对重组菌株的木糖发酵性能的影响进行了综述,分析了产生宿主差异的内在机理,为进一步选育高效木糖共发酵菌种提供借鉴。     

带有木糖还原酶基因和木糖醇酶基因的重组酿酒酵母的构建

采用双载体系统,将携带有瑞氏木霉木糖醇脱氢酶基因的表达质粒ｐＡＪ４０１－ｘｄｈ１转化已带有树干毕赤氏酵母木糖还原酶基因的重组酿酒酵母Ｈ４７５,构建了同时带有毕赤氏酵母木糖还原酶基因和瑞氏木霉木产基因的重组酿酒酵母ＨＸ１,研究了重组酿酒酵母ＨＸ１对木听转化利用情况。     

带有木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因的重组酿酒酵母的构建

采用双载体系统,将携带有瑞氏木霉木糖醇脱氢酶基因的表达质粒pAJ401－Xdh1转化已带有树干毕赤氏酵母木糖还原酶基因的重组酿酒酵母H475,构建了同时带有毕赤氏酵母木糖还原酶基因和瑞氏木霉木糖醇脱氢酶基因的重组酿酒酵母HX1。研究了重组酿酒酵母HX1对木糖的转化利用情况。     

Draft Genome Assembly and Annotation for Cutaneotrichosporon dermatis NICC30027, an Oleaginous Yeast Capable of Simultaneous Glucose and Xylose Assimilation

The identification of oleaginous yeast species capable of simultaneously utilizing xylose and glucose as substrates to generate value-added biological products is an area of key economic interest. We have previously demonstrated that the Cutaneotrichosporon dermatis NICC30027 yeast strain is capable of simultaneously assimilating both xylose and glucose, resulting in considerable lipid accumulation. However, as no high-quality genome sequencing data or associated annotations for this strain are available at present, it remains challenging to study the metabolic mechanisms underlying this phenotype. Herein, we report a 39,305,439 bp draft genome assembly for C. dermatis NICC30027 comprised of 37 scaffolds, with 60.15% GC content. Within this genome, we identified 524 tRNAs, 142 sRNAs, 53 miRNAs, 28 snRNAs, and eight rRNA clusters. Moreover, repeat sequences totaling 1,032,129 bp in length were identified (2.63% of the genome), as were 14,238 unigenes that were 1,789.35 bp in length on average (64.82% of the genome). The NCBI non-redundant protein sequences (NR) database was employed to successfully annotate 11,795 of these unigenes, while 3,621 and 11,902 were annotated with the Swiss-Prot and TrEMBL databases, respectively. Unigenes were additionally subjected to pathway enrichment analyses using the Gene Ontology (GO), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), Cluster of Orthologous Groups of proteins (COG), Clusters of orthologous groups for eukaryotic complete genomes (KOG), and Non-supervised Orthologous Groups (eggNOG) databases. Together, these results provide a foundation for future studies aimed at clarifying the mechanistic basis for the ability of C. dermatis NICC30027 to simultaneously utilize glucose and xylose to synthesize lipids.     

酿酒酵母木糖发酵酒精途径工程的研究进展

途径工程(Pathway engineering),被称为第三代基因工程,改变代谢流向,开辟新的代谢途径是途径工程的主要目的。利用途径工程理念,对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）代谢途径进行理性设计,以拓展这一传统酒精生产菌的底物范围,使其充分利用可再生纤维质水解物中的各种糖分,是酿酒酵母酒精途径工程的研究热点之一。这里介绍了近年来酿酒酵母以木糖为底物的酒精途径工程的研究进展。     

代谢工程改善野生酵母利用木糖产乙醇的性能

从256个自然样品中筛选得到1株可高效转化D-木糖的酵母。通过生理生化和分子生物学方法鉴定, 证实该菌株是属于Candida tropicalis。以该酵母为研究对象, 增加木糖醇脱氢酶表达量, 通过改变代谢流以达到提高酒精产率的目的。以pXY212-XYL2质粒为基础载体, 构建了含有潮霉素抗性的pYX212-XYL2-Hygro, 电击转化进入野生型C. tropicalis, 潮霉素抗性筛选, 得到含高拷贝木糖醇脱氢酶基因的重组菌株C. tropicalis XYL2-7。重组菌的比酶活达到0.5 u/mg protein, 比原始菌株提高了3倍。实验表明, 重组菌木糖醇得率比原始菌株降低了3倍, 酒精得率提高了5倍。首次通过实验验证了热带假丝酵母利用木糖产乙醇的可行性, 这对研究酵母利用秸秆、麦糠、谷壳等纤维质农业废弃物生产燃料乙醇具有重要启示。     

代谢工程改善野生酵母利用木糖产乙醇的性能

从256个自然样品中筛选得到1株可高效转化D-木糖的酵母。通过生理生化和分子生物学方法鉴定, 证实该菌株是属于Candida tropicalis。以该酵母为研究对象, 增加木糖醇脱氢酶表达量, 通过改变代谢流以达到提高酒精产率的目的。以pXY212-XYL2质粒为基础载体, 构建了含有潮霉素抗性的pYX212-XYL2-Hygro, 电击转化进入野生型C. tropicalis, 潮霉素抗性筛选, 得到含高拷贝木糖醇脱氢酶基因的重组菌株C. tropicalis XYL2-7。重组菌的比酶活达到0.5 u/mg protein, 比原始菌株提高了3倍。实验表明, 重组菌木糖醇得率比原始菌株降低了3倍, 酒精得率提高了5倍。首次通过实验验证了热带假丝酵母利用木糖产乙醇的可行性, 这对研究酵母利用秸秆、麦糠、谷壳等纤维质农业废弃物生产燃料乙醇具有重要启示。     

Xylose isomerase improves growth and ethanol production rates from biomass sugars for both Saccharomyces pastorianus and Saccharomyces cerevisiae

The demand for biofuel ethanol made from clean, renewable nonfood sources is growing. Cellulosic biomass, such as switch grass (Panicum virgatum L.), is an alternative feedstock for ethanol production; however, cellulosic feedstock hydrolysates contain high levels of xylose, which needs to be converted to ethanol to meet economic feasibility. In this study, the effects of xylose isomerase on cell growth and ethanol production from biomass sugars representative of switch grass were investigated using low cell density cultures. The lager yeast species Saccharomyces pastorianus was grown with immobilized xylose isomerase in the fermentation step to determine the impact of the glucose and xylose concentrations on the ethanol production rates. Ethanol production rates were improved due to xylose isomerase; however, the positive effect was not due solely to the conversion of xylose to xylulose. Xylose isomerase also has glucose isomerase activity, so to better understand the impact of the xylose isomerase on S. pastorianus, growth and ethanol production were examined in cultures provided fructose as the sole carbon. It was observed that growth and ethanol production rates were higher for the fructose cultures with xylose isomerase even in the absence of xylose. To determine whether the positive effects of xylose isomerase extended to other yeast species, a side-by-side comparison of S. pastorianus and Saccharomyces cerevisiae was conducted. These comparisons demonstrated that the xylose isomerase increased ethanol productivity for both the yeast species by increasing the glucose consumption rate. These results suggest that xylose isomerase can contribute to improved ethanol productivity, even without significant xylose conversion.     

一种基因工程改造的NADH高亲和力木糖还原酶突变基因可促进酿酒酵母发酵木糖生成乙醇

在导入表达毕赤酵母(Pichia stipitis)木糖还原酶(xylose reductase,XR)和木糖醇脱氢酶(xylitol dehydrogenase,XDH)基因的重组酿酒酵母中,木糖还原酶活性主要依赖辅酶NADPH,木糖醇脱氢酶活性依赖辅酶 NAD+,两者的辅助因子不同导致细胞内电子氧化还原的不平衡,是造成木糖醇积累,影响木糖代谢和乙醇产量的主要原因之一.将经过基因工程改造获得的NADH高亲和力的木糖还原酶突变基因m1,与毕赤酵母木糖醇脱氢酶(PsXDH)基因xyl2共转染酿酒酵母AH109,以转染毕赤酵母木糖还原酶(PsXR)基因xyl1和xyl2重组质粒的酵母细胞为对照菌株,在SC/-Leu/-Trp营养缺陷型培养基中进行筛选,获得的阳性转化子分别命名为AH-M-XDH和AH-XR-XDH.重组酵母在限制氧通气条件下对木糖和葡萄糖进行共发酵摇瓶培养,HPLC检测发酵底物的消耗和代谢产物的产出情况.结果显示,与对照菌株AH-XR-XDH相比,AH-M-XDH的木糖利用率明显提高,乙醇得率增加了16%,木糖醇产生下降了41.4%.结果证实,通过基因工程改造的木糖代谢关键酶,可用于酿酒酵母发酵木糖生产乙醇,其能通过改善酿酒酵母细胞内氧化还原失衡的问题,提高木糖利用率和乙醇产率.     

筛选G-box结合蛋白的酵母单杂交文库的构建

目的：筛选花青素合成中的关键基因查尔酮合成酶基因CHS启动子中G-box的结合蛋白,从而找到调节CHS表达的转录因子。方法：采用Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System,将CHS启动子G-box序列串联后整合入酵母染色体,构建诱饵菌株;采用SMART技术合成芜菁幼苗下胚轴cDNA,将该cDNA与pGADT7-Rec表达载体共同转化诱饵菌株,通过同源重组在酵母细胞内同步进行cDNA文库的构建和筛选;用酵母菌落PCR法获得阳性克隆中的cDNA插入片段,测序后在NCBI网站进行Blast分析。结果：共筛选了2.52×106个酵母克隆,得到94个阳性克隆,菌落PCR获得了长度为0.4~2.0 kb的cDNA插入片段,并通过Blast推测了其编码蛋白。结论：实验结果证明酵母单杂交文库构建成功,初步筛选获得了G-box结合蛋白的候选蛋白,为研究CHS的表达调控奠定了基础。