猪卵泡液样品制备方法对双向电泳图谱的影响

比较不同的蛋白制备方法,寻找适合猪卵泡液的双向电泳样品制备方法,提高2-DE图谱的分辨率和重复性。利用ProteoExtract Albumin/IgG Remove Kit去除卵泡液中的高峰度蛋白;然后分别用丙酮沉淀法、TCA/丙酮沉淀法和超滤法进行样品浓缩,比较分析对2-DE图谱的影响。结果表明,TCA/丙酮沉淀法制备的蛋白样品获得的电泳图谱质量较好,蛋白斑点数目较多,斑点较清晰、圆滑,分辨率较高,重复性较好。TCA-丙酮沉淀法更适合于制备猪卵泡液的双向电泳蛋白样品,为进一步对猪卵泡液2-DE图谱进行分析、鉴定及寻找生物标记物提供了保证。     

珍珠黄杨叶片的蛋白质提取方法探讨

蛋白质样品制备是双向电泳的核心.为了找到一种适合提取珍珠黄杨叶片蛋白质的方法,本文以该树种扦插苗的叶片为材料,用TCA-丙酮沉淀法、Tris-饱和酚法和2-D Clean-up Kit提取蛋白质,并进行双向凝胶电泳,采用银染法进行检测.结果表明,TCA-丙酮沉淀法得到的样品图谱背景模糊、拖尾;Tris-饱和酚法得到的样品图谱清晰,蛋白点饱满,无纵向或横向拖尾,但有蛋白点丢失;2-D Clean-Up Kit提取的蛋白质样品得到了较好双向电泳图谱.     

桔小实蝇幼虫总蛋白双向电泳技术体系的建立和优化

【目的】建立和优化桔小实蝇幼虫Bactrocera dorsalis(Hendel)总蛋白的双向电泳条件。【方法】使用BPP法和3种TCA-丙酮法(TCA-丙酮-A法:直接加入裂解液磨样;TCA-丙酮-B法:样品提取液中加入40 mmol/L DTT;TCA-丙酮-C法:样品提取液中加入0.07%β-巯基乙醇)提取桔小实蝇幼虫总蛋白;使用13 cm和24 cm p H 4~7的IPG胶条分离桔小实蝇幼虫总蛋白;使用考马斯亮蓝法及硝酸银染色法对双向电泳凝胶进行染色;使用5800 MALDI-TOF-TOF MS/MS质谱分析仪对BPP法获得的特异蛋白进行质谱鉴定,并将检索数据库物种分别设为Metazoa(Animals)与Drosophila(Fruit flies)进行数据库检索。【结果】TCA-丙酮法中,TCA-丙酮-C法提取效果最好,BPP法优于所有TCA-丙酮法;使用考马斯亮蓝染色与硝酸银染色效果相当;使用24 cm胶条的蛋白分辨率明显高于13 cm胶条;检索数据库物种设为Metazoa(Animals)可获得比Drosophila(Fruit flies)更加全面的信息。【结论】使用24 cm p H 4~7的IPG胶条对BPP法提取的桔小实蝇幼虫总蛋白进行双向电泳,采用考马斯亮蓝法对双向电泳凝胶进行染色,可得到更好的双向电泳图谱,检索数据库时检索物种可优先设为Metazoa(Animals)。     

适用于黄麻根部蛋白质组学分析的双向电泳技术

以黄麻品种'9511'幼苗为试验材料,研究其根部蛋白提取方法的得率及不同的蛋白样品溶解方法、电泳上样量和IPG胶条pH范围对双向电泳图谱的影响.结果表明:采用三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法提取黄麻根部蛋白质,蛋白得率为80 mg/g;蛋白粉末溶解采用两次水化法,裂解液中含有7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4% CHAPS、65 mmol/L DTT、0.2%载体两性电解质和1 mmol/L PMSF,能够较充分地溶解蛋白质,且制备的样品浓度能够满足双向电泳上样要求;上样量为400 μg时得到的图谱分辨率高、蛋白斑点分布均匀、清晰;等电聚焦(Isoelectrofocusing,IEF)采用pH 4～7、17 cm的IPG胶条时所得图谱质量最佳.研究表明,样品的制备及IEF有效除盐对获得理想的2-DE图谱非常关键;取材、染色等细节对2-DE的重复性影响很大.     

箭毒木种子蛋白质样品制备及双向电泳改良方法

建立箭毒木（Antiaris toxicaria）种子总蛋白的提取方法,以及可以对其蛋白质组进行分析的双向电泳条件。通过各种条件的优化与组合,建立了以TCA-丙酮为基础的Tris—HCl提取法提取总蛋白,第1向电泳为固相pH梯度等电聚焦,第2向电泳为垂直平板SDS-PAGE的双向电泳体系。通过对样品制备、样品溶解、等电聚焦电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳以及染色方法等关键步骤进行分析,获得了满意的双向电泳图谱。在探索适合箭毒木种子蛋白质组学研究双向电泳方法中,比较了三氯乙酸-丙酮沉淀法、和Tris—HCl法,以及对双向电泳过程中的关键步骤的改良,认为Tris—HCl法为最适方法,所得图谱背景清晰,蛋白质信息量最大,为箭毒木属植物的差异蛋白质组学的后续研究打下了坚实的基础。     

山黧豆叶片蛋白质双向电泳技术的建立

以山黧豆叶片为材料,比较分析了蛋白质的不同提取方法,在此基础上着重于样品制备。对IPG胶条的选择,第一向等电聚焦和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的电泳程序及参数、染色方法等相关技术进行了比较和条件优化。结果显示：采用TCA-丙酮沉淀法提取蛋白质,裂解液中加入Tris-base作为蛋白酶抑制剂,等电聚焦电泳时延长低电压的电泳时间（30V、12h,500V、1h,1000V、2h）以促进盐离子泳出的方法对山黧豆叶片蛋白质进行双向电泳,并用考马斯亮蓝和银染复合染色法进行凝胶染色,能够获得蛋白点清晰的双向电泳图谱,说明用优化后的方法建立起的山黧豆叶片蛋白质双向电泳技术,蛋白质样品制备质量好,电泳分辨率高,完全适合于进一步的蛋白质组学研究。     

小菜蛾蛋白质提取方法的比较

建立适用于小菜蛾蛋白质组学研究的样品前处理方法。应用SDS-PAGE电泳比较分析了TCA-丙酮沉淀,Tris-饱和酚抽提,RIPA Lysis Buffer和I-PER Reagent直接裂解4种方法对小菜蛾幼虫总蛋白的抽提质量。结果显示:4种方法对小菜蛾全蛋白的提取率差异比较显著,其中RIPA Lysis Buffer和I-PER Reagent两种直接裂解法蛋白提取率最高,分别为52.06 mg/g和46.16 mg/g;TCA-丙酮沉淀法提取率适中,为34.58 mg/g;Tris-饱和酚抽提法提取率最低,为27.39 mg/g。SDS-PAGE电泳分析表明,Tris-饱和酚抽提法蛋白谱条带分辨率最高,蛋白条带最多,为32条,在17.0 k Da-245 k Da的范围内分布均匀;TCA-丙酮沉淀法蛋白谱带数目为30条,条带清晰,分辨率较高,但缺失部分蛋白;RIPA Lysis Buffer和I-PER Reagent两种直接裂解法蛋白谱条带数目较少,小分子蛋白条带丢失或不明显。根据蛋白提取率和条带的数量综合分析,TCA-丙酮沉淀法适用于小菜蛾蛋白质组学的样品前处理。     

适于小麦叶片蛋白质组分析的样品提取方法研究

以‘铭贤169'小麦苗期叶片为材料,分别采用传统的TCA/丙酮沉淀法、酚提取-甲醇/醋酸铵沉淀法以及改进的TCA/丙酮沉淀-酚/SDS联合抽提法提取叶片总蛋白,进行双向电泳分离和胶体考染,以建立适用于小麦蛋白质组分析的样品制备方法.结果表明:TCA/丙酮沉淀法较酚提取-甲醇/醋酸铵沉淀法获得的蛋白杂质较少,在二维电泳图谱中的蛋白点较酚抽提-甲醇/醋酸铵沉淀法提取的蛋白点清晰且多.相比于以上2种提取蛋白样品方法,改进的TCA/丙酮沉淀-酚/SDS联合抽提法提取的小麦叶片蛋白杂质少、二维电泳图谱上的点明显增多、分辨率较高.所选小麦的代表性蛋白点能获得成功鉴定.该方法可推广应用于水稻叶片蛋白质组分析的样品提取.     

橡胶树胶乳C-乳清双向电泳样品制备技术的建立及优化

在TCA/丙酮沉淀法的基础上,用乙醇和乙醚洗涤（称双乙法）沉淀获得橡胶树胶乳C-乳清蛋白样品,并在样品溶解时通过超声助溶进一步提高样品的溶解度。结果显示,利用改良后的样品制备方法（TCA/丙酮+双乙法+超声处理）所获得的C-乳清蛋白样品的溶解性大幅增加,蛋白得率高达8.47 mg/mL C-乳清,为传统TCA/丙酮法的1.6倍;同时降低了盐离子浓度,等电聚焦时升压顺利、聚焦完全,双向电泳的图谱质量明显改善,在银染2D胶上可获得1 206个蛋白点,为传统TCA/丙酮法的2.7倍。本文对胶乳C-乳清蛋白样品制备方法进行深入优化,获得了重现性较好的高质量双向电泳蛋白图谱,促进了橡胶树蛋白质组学研究。     

苹果属植物树皮组织总蛋白提取及分离方法的建立

为了建立适于苹果属植物树皮组织总蛋白提取的技术方法, 以8年生华月苹果(Malus domestica)树枝条为试材, 通过比较不同提取方法(TCA-丙酮沉淀法(A)、甲醇/醋酸铵沉淀法(B)和改良的Tris-酚抽提方法(C))并优化提取条件, 确立了最适提取及分离方法为改良的Tris-酚抽提方法。在2-DE分离时, 该方法所获得的样品图谱中蛋白点总数为993个, 明显多于TCA-丙酮沉淀(418个)和甲醇醋酸铵沉淀(674个)方法, 并且与其它两种方法相比, 该方法获得的图谱背景更清晰, 蛋白点聚焦效果更好。此外, 经过3个梯度上样量的图谱分离效果比较, 确定了800 μg为本研究中2-DE分析的理想上样量。另外, 为了验证该提取及分离方法的可行性, 进一步对蛋白质表达谱中的部分蛋白点进行了质谱分析, 且这些蛋白点均得到了成功鉴定。该研究通过优化总蛋白提取方法及样品上样量等条件, 获得了理想的双向电泳分离图谱, 为苹果属植物树皮组织材料的蛋白质组学研究奠定了基础。     

不同提取方法及上样量对牡丹试管苗茎基部蛋白双向电泳的影响

为建立一套适合于牡丹试管苗茎基部蛋白的双向电泳技术,以便更好地利用蛋白质组技术研究牡丹试管苗不定根的发生机理,本研究比较了三种不同蛋白质提取方法对双向电泳结果的影响,并在蛋白质上样量方面进行了比较。结果表明,乙酸铵/甲醇酚提取法所得2-DE图谱的蛋白点很少,仅检测到45个,且较模糊,有明显的拖尾现象,分辨率很低;乙醇/乙醚丙酮法所得的蛋白点也较少(101个),较模糊,且横竖纹干扰较大;三氯乙酸/丙酮法所得蛋白点数较多,可检测到434个清晰的蛋白点,且形状规则,重复性好,适合后续分析,操作也较为简便。用三氯乙酸/丙酮法提取蛋白,采用800μg、1000μg和1200μg三个不同的上样量进行双向电泳,在上样量为1200μg时(IPGpH3～10,24cm),蛋白质在12%SDS-PAGE胶上得到了较好的分离,在2-DE图谱上可分辨出562个蛋白点。因此,三氯乙酸/丙酮法是较适合于牡丹试管苗茎基部蛋白质提取的方法,1200μg是较为合适的上样量。     

西花蓟马蛋白的提取及双向电泳体系的建立

【目的】蛋白样品的制备是获得良好双向凝胶电泳(2-DE)图谱的前提,建立合理的西花蓟马蛋白的双向电泳体系,获得分辨率较高、重复性较好的图谱,能够为后续的研究提供有力支撑。【方法】实验以西花蓟马成虫为实验材料,对比了饱和酚法、TCA/丙酮法和直接裂解法3种蛋白提取方法,从中选出最适宜双向电泳分析的一种蛋白提取方法。【结果】3种方法蛋白提取率差异显著,直接裂解法蛋白提取率最高,饱和酚法的蛋白提取率最低;3种方法的SDS-PAGE条带数差异不明显;TCA/丙酮法的双向凝胶图谱效果最好,蛋白点最多。【结论】TCA/丙酮法能够有效去除西花蓟马蛋白中的干扰物质,是最适合西花蓟马双向凝胶电泳的蛋白提取方法,为后续西花蓟马在蛋白组学方面的研究奠定了基础。     

适用于盐生植物的双向电泳样品制备方法

比较了三氯乙酸,丙酮沉淀法（TCA）、三氯乙酸沉淀法（E-TCA）和酚抽法（Phe）3种方法对盐生植物盐角草（Salicornia europaea L．）总蛋白的提取效果。3种方法分别得到579、343和535个蛋白点;TCA和E-TCA法所得图谱均存在严重的横向纹理,Phe法所得图谱则背景干净,基本上没有纹理。说明Phe法不仅能很好地提取盐角草蛋白,而且能有效去除样品中的盐分。对Phe法的提取液进行了改进,所得图谱背景更加清晰,蛋白点数增加。为其他盐生植物以及嗜盐微生物蛋白质的提取提供了重要参考。     

An Optimized Trichloroacetic Acid/Acetone Precipitation Method for Two-Dimensional Gel Electrophoresis Analysis of Qinchuan Cattle Longissimus Dorsi Muscle Containing High Proportion of Marbling

Longissimus dorsi muscle (LD) proteomics provides a novel opportunity to reveal the molecular mechanism behind intramuscular fat deposition. Unfortunately, the vast amounts of lipids and nucleic acids in this tissue hampered LD proteomics analysis. Trichloroacetic acid (TCA)/acetone precipitation is a widely used method to remove contaminants from protein samples. However, the high speed centrifugation employed in this method produces hard precipitates, which restrict contaminant elimination and protein re-dissolution. To address the problem, the centrifugation precipitates were first grinded with a glass tissue grinder and then washed with 90% acetone (TCA/acetone-G-W) in the present study. According to our result, the treatment for solid precipitate facilitated non-protein contaminant removal and protein re-dissolution, ultimately improving two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) analysis. Additionally, we also evaluated the effect of sample drying on 2-DE profile as well as protein yield. It was found that 30 min air-drying did not result in significant protein loss, but reduced horizontal streaking and smearing on 2-DE gel compared to 10 min. In summary, we developed an optimized TCA/acetone precipitation method for protein extraction of LD, in which the modifications improved the effectiveness of TCA/acetone method.     

Polyethylene glycol fractionation improved detection of low-abundant proteins by two-dimensional electrophoresis analysis of plant proteome

Poor detection of low-abundant proteins is a common problem in two-dimensional electrophoresis (2-DE) for separation of proteins in a proteome analysis. This is attributed partially, at least, to the existence of high-abundant proteins, e.g. ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco) in plants. They engage a large proportion of the whole-cell proteins and thus prevent low-abundant proteins from being up-taken by immobilized pH gradient (IPG) strip, consequently making the latter poorly detectable by 2-DE. In this work, we report a straightforward protocol for preparation of whole-cell proteins through differential polyethylene glycol (PEG) precipitation aiming at elimination of Rubisco from plant protein samples. In comparison with 2-DE analysis of protein samples prepared using a conventional TCA/acetone method, a relatively high reproducibility of proteins was achieved using a PEG fractionation protocol in terms of protein yield and protein species. As expected, the large subunit of Rubisco was precipitated predominantly in the 16% PEG fraction. This allowed proteins of the Rubisco-containing fraction to be analyzed separately from those of other PEG fractions. After taking into account the overlapping protein spots among 2-DE gels of all fractions through image and statistical analyses, we detected with this protocol a total 5077 protein spots, among which ca. 80% are proteins undetectable with the TCA/acetone method, while the rest of proteins exhibited a significant increase in their abundance. This protocol was developed using Arabidopsis as a source of protein and thus may also be applicable to protein preparations of other plants.     

用于双向凝胶电泳分析的奶牛乳清蛋白样品制备方法的比较

为建立适用于双向凝胶电泳分析的奶牛乳清蛋白的制备方法,分别比较了直接裂解法、三氯乙酸-丙酮法,Trizol法和2-D clean up kit法对奶牛乳清蛋白提取效率和双向凝胶电泳图谱的影响.用2-D Quant Kit试剂盒测定蛋白浓度,分别用十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳和双向凝胶电泳进行奶牛乳清蛋白的分离.蛋白定量结果表明,2-D clean up kit法产率最高,直接裂解法、三氯乙酸-丙酮法次之,trizol法产率最低;十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,2- D clean up kit法提取的蛋白质量最高;双向电泳图谱分析表明,2-D clean up kit法得到的蛋白图谱与另外3种方法相比,检测到的蛋白点最多,图谱背景清晰,分辨率最高.结果提示,2-D clean-up法相对最适合于双向凝胶电泳分析奶牛乳清蛋白样品的制备,尤其对一些低丰度高分子量蛋白的分离效果较为明显.     

莲种子蛋白质提取方法比较与双向电泳分析

莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)不仅是重要的水生蔬菜作物之一,而且是进行基础研究的好材料。本文采用4种蛋白质提取方法(新型TCA/丙酮法、传统TCA/丙酮法、改良的Tris-HCl法、Tris-饱和酚法)并结合双向电泳技术,对莲子蛋白质提取方法进行筛选与优化。双向电泳实验结果显示,所得蛋白质图谱与莲种子蛋白质组成分布特点一致。通过PDQuest软件分析表明,新型TCA/丙酮法适用于莲子叶和胚芽组织的双向电泳蛋白质提取,而传统TCA/丙酮法则适用于莲胚轴组织双向电泳的蛋白质提取。研究结果为进一步利用质谱进行莲子蛋白质组研究奠定了基础。     

灵芝子实体原基双向电泳和总蛋白质提取方法的建立

比较了Tris-饱和酚法和三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法对灵芝子实体原基总蛋白质的提取效果。用Image Master 2D Platinum6.0软件分析两种方法所提蛋白质的双向电泳图谱,分别得到565和273个蛋白质点;(TCA)/丙酮沉淀法在碱性端低分子量区域有些蛋白质斑点存在拖尾现象,Tris-饱和酚法能有效去除样品中的盐分,使蛋白质的聚焦效果更好,蛋白点数增加。Tris-饱和酚法可做为灵芝子实体原基总蛋白质的提取方法并为其他药用真菌总蛋白质的提取提供参考,同时为本实验室后续研究灵芝双向性固体发酵雷公藤的蛋白差异表达奠定了基础。     

A Standard Operating Procedure (SOP) for the preparation of intra- and extracellular proteins of Clostridium acetobutylicum for proteome analysis

We report on the development of a Standard Operating Procedure (SOP) for extraction and handling of intra- and extracellular protein fractions of Clostridium acetobutylicum ATCC 824 for reproducible high quality two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) analyses. Standardized cells from a phosphate-limited chemostat were used to evaluate different protein preparation methods. For the preparation of the secretome, a dialysis/ultrafiltration procedure resulted in higher protein yields and proved to be more reliable compared to different precipitation methods using TCA, DOC-TCA, acetone, and PEG 6000. Sonication was found to be the most efficient method among different tested techniques of cell disruption for the analysis of the intracellular proteome. Furthermore, the effect of protease inhibitors and sample storage conditions were tested for both intra- and extracellular protein samples. Significant changes in the protein pattern were observed depending on the addition of protease inhibitors. 2-DE gels with a pH gradient from 4 to 7 prepared according to the developed SOP contained at least 736 intracellular and 324 extracellular protein spots.