腐败梭菌α毒素基因的克隆表达及其类毒素的免疫原性研究

根据GenBank公布的腐败梭菌α毒素基因序列,设计了一对引物,并以腐败梭菌基因组为模板,经PCR特异性扩增出腐败梭菌菌株HeB01的α毒素基因。序列分析表明,该基因产物大小为1323bp,与GenBank报道的4个腐败梭菌参考菌株α毒素基因序列同源性高于99·5%。将扩增的α毒素基因定向克隆到原核表达载体pQE30中,得到重组质粒pQE30-α,将重组质粒转化大肠杆菌M15中,得到重组菌株M15(pQE30-α),经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析可见表达的48kD特异条带;Westernblot和ELISA检测实验表明:表达的α毒素与抗天然α毒素抗体发生特异性反应,说明α毒素蛋白具有较好的免疫原性。将表达的α毒素蛋白制成类毒素疫苗,免疫小鼠后,具有一定的保护能力,表明该重组菌株有望作为腐败梭菌基因工程类毒素疫苗的候选生产菌株。     

无菌大白鼠肠道中破伤风梭菌的生长和毒素的产生

<正>梭菌是在全世界范围内广泛分布的厌气性芽胞菌。肉毒梭菌和破伤风梭菌能产生较强的神经毒素,分别引起典型的肉毒中毒和破伤风疾病。肉毒中毒大都和吃污染肉毒毒素的食物有关。过去一直认为肉毒梭菌在肠道中不能生长和产生毒素;但是,近来的研究表明,肉毒梭菌能在新生小鼠和新近给了广谱抗菌素治疗的成鼠肠道中生长并产生毒素。最近认识到,新生儿肉毒中毒乃是婴儿猝死症的原因之一。因为肉毒梭菌芽胞能在     

酶联免疫吸附试验检测艰难梭菌A毒素

实验用兔单特异抗艰难梭菌Ａ毒素ＩｇＧ包被酶标板,以羊抗艰难梭菌Ａ毒素ＩｇＧ标记辣根过氧化物酶作为第二抗体,采用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法检测艰难梭菌Ａ毒素,可检测出０．９４ｎｇ的精制Ａ毒素,对６１株菌的培养液及６５份健康人粪便标本检测发现此法具有较高的特异性。用平行线定量法对几份典型产毒培养物进行了定量测定,结果表明,在一定剂量范围内线性及平行性好,结果准确、可靠。可用于临床粪便标本中艰难梭菌Ａ毒素的筛查及定量检测。     

C型肉毒梭菌毒素杀灭高原鼢鼠的初步研究

C型肉毒梭菌毒素是从肉毒梭菌中培养分离出的一种外毒素。国内外学者对毒素在食品卫生和医疗卫生方面已有较多的研究。作为杀鼠剂,《兽类学报》1987年第2期,曾报道过沈世英首次采用杀灭高原鼠兔(Ochotona curzoniae)取得成功。为了扩大毒素杀灭害鼠的范围,作者于1987年5月在青海省海北州门源县皇城乡岗什卡口地区冬春草场上,对青藏高原上的另一种主要害鼠--高原鼢鼠(Myospalax baileyi),进行了杀灭试验。现报道于下。     

产气荚膜梭菌毒素的研究进展

本文简要介绍产气荚膜梭菌（ＣＰ）α,τ,ε,λ,θ毒素及肠毒素的基本结构,生物学活性和致病机制的研究进展。     

太空试验将产生更强的Bt毒素

近期的太空飞行已不限于载人。数百万的苏云金芽孢杆菌(Bt)孢子将被带入太空。在2月3日的飞行中,除携带价值数百万美元的高技术设备外,还携带了少量的Bt。这是因为Novo Nordisk A/S和宾夕法尼亚州立大学的研究人员希望了解在失重条件下,Bt是否更具有更强的杀虫效力。 这一设想并非异想天开。根据宾州研究人员的观察,溶液中生长的蛋白晶体在太空中比地球上长得更大。Bt的有毒蛋白晶体化。当各种害虫(如马铃薯甲虫)摄入这些晶体后,即被杀死。晶体越大,杀伤力越强。     

产气荚膜梭菌α毒素研究进展

产气荚膜梭菌是引起各种动物坏死性肠炎,肠毒血症,人类的食物中毒和战创伤性气性坏疽的主要病原菌之一,该菌分为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ６型,其致病因子是菌体产生的外毒素。到目前为止,已发现的外毒素有１２种之多,但各型产气荚膜梭菌均产生α毒素（ＣＰＡ）,故以α毒素最为重要。近年来,国外学者对α毒素的组成,结构,作用机制及分子遗传学等方面都作了较为深入的研究,现将有关情况介绍如下。     

肉毒梭菌培养条件的初步比较试验小结

为了配合肉毒梭菌检验工作的开展,我们用实验室保存的各型(A～F)肉毒梭菌菌种对培养基的类型、培养温度及培养时间等条件进行了生长与产毒的初步比较试验。权衡各个因素,我们认为采用明胶琼脂半固体培养基和30℃的培养温度这个统一条件较好;培养3至5天,对于所有各型的生长或产毒,均可获得符合检验要求的结果。     

难辨梭菌毒素的免疫电镜观察

本文用兔抗难辨梭菌毒素A标记在难辨梭菌48小时培养物中产生的毒素上,再用葡萄球菌A蛋白(Staphylococcus protein A,SPA)胶体金(PAG)标记,即可在电镜下观察到清晰可见的毒素颗粒。     

瑞香狼毒素对蚜虫防治的初步试验

以从瑞香狼毒（Stellera chamaejasme L.）中提取获得天然活性物质1,5-二苯基-1-戊酮、1,5-二苯基-2-烯-1-戊酮为主体成分,研制成生物灭蚜剂（LX-1）,对农业上几类重要蚜虫进行了防治应用的初步试验.结果表明,室内对棉蚜和烟蚜的触杀作用24 h 的LC50分别为81.73 mg/L和83.32 mg/L;并利用该制剂对棉蚜、烟蚜和麦蚜进行了田间防治试验,施药后3～5天防效达到峰值,2400倍稀释度下,防效达93%～99%,显示了较好的应用前景.     

产气荚膜梭菌a毒素分子生物学研究进展

a毒素是产气英膜梭菌主要的毒力因子,具有磷脂酶C和鞘磷脂酶等2种酶的活性,能同时水解细胞膜上的磷脂酰胆碱和鞘磷脂,导致细胞裂解,因而具有细胞毒性、溶血活性、致死性和血小板聚集等特性。我们对产气荚膜梭菌a毒素的生物学特性、基因克隆与转录调控、基因表达与基因融合、基因定点突变与结构分析、N端和C端的结构与功能等方面的研究进展进行简要综述。     

艰难拟梭菌毒素致病机制及毒素基因调控的研究进展

艰难拟梭菌(Clostridioides difficile)是一种产芽孢的革兰氏阳性专性厌氧杆菌,是引起抗生素相关性腹泻的主要致病菌。艰难拟梭菌产生的毒素A和毒素B在其致病过程中发挥关键作用。毒素发挥毒性作用依赖其4个功能结构域：葡萄糖基转移酶结合域、半胱氨酸蛋白酶结合域、易位域和受体结合域。毒素的受体结合域识别并结合细胞表面受体,介导毒素内吞并形成内体。经过自体催化切割,毒素将真正的毒性片段——葡萄糖基转移酶结合域释放到胞浆中,葡萄糖基转移酶能够失活宿主肠上皮细胞内的GTP酶导致细胞骨架解聚和坏死,进而引起腹泻和伪膜性结肠炎等临床症状。艰难拟梭菌毒素产生受致病基因座内及基因座外许多调控因子的调节。tcdR和tcdC基因位于致病基因座内,对毒素基因的表达分别起促进和抑制作用,而基因座外如spo0A、codY等基因则通过抑制tcdR的表达从而间接影响毒素蛋白产生。本文将重点介绍艰难拟梭菌毒素的致病过程和影响毒素基因表达的分子调控机制,以期为开发针对毒素的治疗手段提供新思路。     

艰难拟梭菌毒素致病机制及毒素基因调控的研究进展

艰难拟梭菌(Clostridioides difficile)是一种产芽孢的革兰氏阳性专性厌氧杆菌,是引起抗生素相关性腹泻的主要致病菌。艰难拟梭菌产生的毒素A和毒素B在其致病过程中发挥关键作用。毒素发挥毒性作用依赖其4个功能结构域:葡萄糖基转移酶结合域、半胱氨酸蛋白酶结合域、易位域和受体结合域。毒素的受体结合域识别并结合细胞表面受体,介导毒素内吞并形成内体。经过自体催化切割,毒素将真正的毒性片段——葡萄糖基转移酶结合域释放到胞浆中,葡萄糖基转移酶能够失活宿主肠上皮细胞内的GTP酶导致细胞骨架解聚和坏死,进而引起腹泻和伪膜性结肠炎等临床症状。艰难拟梭菌毒素产生受致病基因座内及基因座外许多调控因子的调节。tcdR和tcdC基因位于致病基因座内,对毒素基因的表达分别起促进和抑制作用,而基因座外如spo0A、codY等基因则通过抑制tcdR的表达从而间接影响毒素蛋白产生。本文将重点介绍艰难拟梭菌毒素的致病过程和影响毒素基因表达的分子调控机制,以期为开发针对毒素的治疗手段提供新思路。     

A型产气荚膜梭菌α毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究

利用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌标准株染色体DNA中扩增出α毒素基因,构建了含α毒素基因的重组菌株BL21(DE3)(pXETA02)。经酶切鉴定和序列测定证实,构建的表达质粒pXETA02含有α毒素基因序列。经SDS-PAGE、Western blot分析和ELISA检测,重组菌株表达的α毒素蛋白能够被α毒素单抗识别。表达优化结果表明,以IPTG为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH 7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时α毒素蛋白表达量为34.83%。以乳糖为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH7.5、培养温度37℃,乳糖浓度0.1g/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入乳糖,诱导时间5h,α毒素蛋白表达量为23.82%。动物实验结果表明,用重组菌株α毒素蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD的A型产气荚膜梭菌标准株C57-1毒素攻击。     

艰难梭菌A毒素的细胞致死活性研究

本文报道艰难梭菌Ａ毒素对４种培养细胞的细胞致死活性的探讨。４种培养细胞为Ｖｅｒｏ（非洲绿猴肾细胞）细胞、ＴＰＣ─１（人甲状腺肿瘤细胞）细胞、ＮＩＨ３Ｔ３细胞（小鼠成纤维细胞）及将ｒａｓ癌基因转基因于ＮＩＨ３Ｔ３细胞的ＮＩＨ３Ｔ３ｒａｓ细胞。应用台酚蓝排除能试验、噻唑蓝（ＭＴＳ）比色、细胞膜损害测定试验、荧光显微术观察细胞核的形态变化等测定Ａ毒素细胞致死活性。实验表明：４种培养细胞系对Ａ毒素细胞圆缩化作用的敏感性依次为ＮＩＨ３Ｔ３ｒａｓ,ＴＰＣ─１,Ｖｅｒｏ,ＮＩＨ３Ｔ３细胞。而对Ａ毒素细胞致死活性的敏感性依次为ＴＰＣ─１,ＮＩＨ３Ｔ３,Ｖｅｒｏ,ＮＩＨ３Ｔ３ｒａｓ细胞。从而得知Ａ毒素的细胞致死活性不但依细胞种类不同而不同,而且也不一定与Ａ毒素的细胞圆缩化作用有关。肿瘤细胞ＴＰＣ─１细胞对Ａ毒素致死活性有特殊敏感性。以上结果对探索抗癌新药的研制具有重要意义。     

C型肉毒梭菌毒素的稳定性研究

报道了保存肉毒毒素经常会遇到的某些因素对Ｃ型肉毒梭菌Ｃ６５１４培养滤液稳定性的影响观察结果。结果表明,提高环境温度及介质酸碱度、日光照射、激烈震荡都能使毒素的毒力下降。甘油或明胶磷酸盐缓冲剂对于保存Ｃ型肉毒毒素都是较好的活性稳定剂。含甘油或明胶磷酸盐缓冲剂的毒素在４℃下保存１２个月后,毒力的变动甚微。此二法都不需要特殊设备,材料易得,操作简便,比较实用。     

C型产气荚膜梭菌β1毒素基因表达

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体DNA中扩增出β1毒素基因,然后用限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI对其进行双酶切处理,回收0．95kb的β1毒素基因片段,最后将其定向克隆在事先经同样内切酶处理的载体pET-28c中相应位点上,转化至受体菌B121(DE3)qh。经BamHI和Eco RI双酶切鉴定和核苷酸序列测定证实,构建的重组质粒pETXBl含有B毒素基因,并且具有正确的基因序列和阅读框架。重组菌株BI21(DE3)(pETXB1)经IPIG诱导后,其表达产物经ELISA检测和SDS-PAGE分析,结果表明重组菌株可以高效表达β1毒素蛋白,该蛋白占菌体总蛋白相对含量的12．24％。