呼吸道合胞病毒B亚型分离株的G蛋白基因分析

对一株长春地区B亚型分离株(CC169)的G蛋白基因进行了 序列分析,结果表明：我国呼吸道合胞病毒(RSV)分离株CC169同RSV B亚型原型株CH18537的 核苷酸同源性为94%,核苷酸的有义突变率达65%。由核苷酸推导出氨基酸序列的同源性为894%,氨基酸的变异全部发生在胞外区,并主要集中在一个高度保守区的两端,胞内区和跨 膜区保守不变。氨基酸的变异导致了分离株既有糖基化位点的改变,又有蛋白长度的变异。 此外还初步探讨了我国RSV B 亚型分离株CC169的G蛋白基因同原型株之间的变异与疫苗研制 中的意义。     

北京等四地区呼吸道合胞病毒分离株G蛋白基因的比较分析

为了解我国不同地区呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）感染特征是否与基因变异有关,对北京、广州、长春和河北四个地区不同流行特征中分离的ＲＳＶ毒株的Ｇ蛋白基因进行了序列分析。结果表明,该Ｇ蛋白基因同国外Ａ型亚原型株（Ａ２株）间存在显著差异,Ａ２株同分离株间的核苷酸同源性为９２．７－９３．６％,氨基酸同源性只有８８．３－８９．９％。分离株间的核苷酸同湃性为９６．０－９８．９％,氨基酸同源性９２．６－９７．７％。氨     

呼吸道合胞病毒在北京地区分离株G蛋白的基因分析

从经单克隆抗体证实为Ａ亚型的北京地区呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）分离株Ｂ７９中,用ＲＴ－ＰＣＲＴ扩增出编码Ｇ蛋白的基因片段,克隆至载体ｐＴＺ１８Ｒ中,经核苷酸序列测定证明,我国北京地区分离的Ａ亚型株Ｂ７９与ＲＳＶＡ亚型原型株（Ａ２株）Ｇ蛋白基因的核苷酸同源性为９３．８％,核苷酸的有义突变率为６５％,由核苷酸推导出氨基酸序列的同源性为８９．６％,氨基酸的变异主要集中在胞外区一个高度保守区的两端,而胞内区     

北京地区呼吸道合胞病毒分离株G蛋白基因遗传变异特性研究

为了解北京地区人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus,HRSV）的遗传变异和分子流行病学特征,首次对北京地区2003～2004年63株HRSV分离株进行了G基因3’末端的第2个高度变异区的序列测定,并进行了基因分型和遗传变异的分析。使用不同的型特异性引物对GPA—F1和GPB-F1分别扩增A、B血清型HRSVG基因3’末端核苷酸序列,特异性扩增产物和随后的序列测定结果均显示,北京地区2003～2004年63株HRSV毒株中,96．8％（61／63）为A血清型,3．2％（2／63）为B血清型,说明北京地区在2003～2004年间存在HRSVA、B血清型共循环,但以A血清型病毒为主。分别对北京流行的A和B血清型病毒进行了基因亲缘性关系分析,结果提示,61株北京A血清型分离株全部为GA2基因型;2株B血清型分离株为GB3基因型。由此看来,GA2基因型是北京地区2003～2004年的优势流行基因型。北京61株GA2分离株之问核苷酸和氨基酸同源性分别在87．8％～100％和77．9％～100％之间;2株B血清型分离株之间核苷酸和氨基酸同源性分别为94．7％和88．1％。这说明在2003年和2004年有很多个不同的GA2基因型HRSV毒株在北京地区共循环,北京地区的HRSV流行存在着许多由不同病毒株引起的传播链。B血清型分离株Beijing04-11于G基因3’末端含有一个60个碱基的重复序列,这是HRSV多聚酶易于重复复制限定序列的一个极端的例子,有可能是HRSV逃逸免疫压力而不断进化的一种方式。该研究首次对北京地区2003年和2004年流行的HRSV进行了基因分型和遗传变异的研究,对于了解北京HRSV流行株的基因特征具有重要意义,可以为北京乃至中国疫苗株的选择提供参考依据,从而指导HRSV的免疫预防控制。     

呼吸道合胞病毒G蛋白的相关研究

呼吸道合胞病毒G蛋白介导病毒附着在宿主细胞表面,且具有亚型间抗原结构变异大的特点,其抗原变异推测是呼吸道合胞病毒逃避已存在免疫监视,引起反复感染的原因,了解G蛋白与免疫反应的关系对研制呼吸道合胞病毒亚单位疫苗,有效地防治该病毒感染具有重要意义。     

呼吸道合胞病毒F蛋白研究进展

人类呼吸道合胞病毒(RSV)融合蛋白(F蛋白)为病毒表面结构蛋白,可以刺激机体产生保护性抗体。因此对F蛋白的深入研究将有助于了解病毒感染的机理,从而为诊断试剂和亚单位疫苗的研制提供帮助。本文就F蛋白结构及结构与功能关系的研究进展进行简要综述。     

呼吸道合胞病毒保护性抗原的研究进展

对呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）保护性免疫机理更为详尽的了解将有助于研制安全有效的疫苗。本文介绍ＲＳＶ的蛋白组成以及单一蛋白诱生保护性免疫的能力,研究结果显示,Ｆ和Ｇ蛋白为体液免疫保护性抗原,Ｍ２、Ｆ和Ｎ为细胞免疫保护性抗原。综合诱生保护性体液和细胞免疫的能力,ＲＳＶ蛋白在保护性免疫中的重要性为：Ｆ〉Ｇ〉Ｍ２〉Ｎ。     

呼吸道合胞病毒疫苗研究进展

呼吸道合胞病毒(RSV)是引起严重下呼吸道感染的重要病原体,尽管经历了半个多世纪的努力,至今仍未有安全有效的RSV疫苗上市。近年来在RSV F蛋白结构生物学方面的研究进展为新一代RSV疫苗的开发提供了新方向,同时更多的采用不同技术、或针对不同人群的RSV侯选疫苗也在迅速发展,尤其是针对婴幼儿及老年人的RSV侯选苗已有60多种在研究中,大部分已处于临床前研究阶段,18种侯选苗已进入临床试验。我们简要介绍RSV疫苗的最新研究进展。     

北京地区人呼吸道合胞病毒核蛋白基因的序列分析及原核表达

为了解北京地区流行的人呼吸道合胞病毒(HRSV)N蛋白基因的特征,并用大肠杆菌表达获得N蛋白,从2006年1月至3月收集的首都儿科研究所附属儿童医院急性呼吸道感染患儿标本中分离到7株HRSV毒株(3株A亚型,4株B亚型),分别经RT-PCR扩增得到HRSV N蛋白全基因,克隆至pUCm-T载体中并进行测序和分析;从重组质粒pUCm-N9968中经PCR扩增获得N基因,亚克隆入原核表达载体pET30a( )中,得到重组表达质粒pET30a-N9968,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导培养;SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达和抗原性。经扩增并测序,7株HRSV N蛋白基因全长均为1 176 bp,编码一个含391个氨基酸的蛋白;北京地区7株RSV分离株的N蛋白基因之间的核苷酸和推导的氨基酸同源性分别在85.4%~99.7%之间和95.4%~100%之间,进一步证明N蛋白基因的高度保守性。经诱导培养产生大量带6个组氨酸标记的重组N蛋白,主要以包涵体形式存在。N蛋白粗提物经Ni2 亲和层析获得较理想纯化。Western blot结果显示,所表达的蛋白能与特异性单克隆抗体和人血清反应。说明本研究构建的重组pET30a-N9968原核表达质粒使N蛋白获得了高效表达,并且具有特异的抗原活性,为今后进一步研究奠定了基础。     

免疫A型呼吸道合胞病毒G75-225蛋白的小鼠对病毒感染的抗性

目的:评价A型呼吸道合胞病毒(RSV)G75-225蛋白(G151)与二硫键异构酶(DsbA)的重组蛋白抗原DsbA-G151的免疫活性。方法:采用PCR方法从A型RSVG蛋白扩增G151基因片段,插入表达载体pET-DsbA,经E.coli表达、亲和层析纯化制备DsbA-G151蛋白;将其免疫BALB/c小鼠后获得相应的抗血清,利用ELISA方法、保护性实验检测蛋白免疫活性。结果:构建了表达载体pET-DsbA-G151,表达、纯化获得了重组蛋白DsbA-G151。ELISA检测表明,DsbA-G151能在小鼠体内产生高滴度的特异性IgG;保护性实验显示该蛋白能有效保护BALB/c小鼠不被RSV感染。结论:经ELISA检测、保护性实验,表明DsbA-G151具有良好的免疫原性。     

重组呼吸道合胞病毒G蛋白疫苗的免疫安全性研究

将呼吸道合胞病毒(respiratory syncytical virus,RSV)G蛋白与CpG佐剂共同免疫小鼠,分析RSV G蛋白免疫原性及安全性。前期纯化的G_(CX3C)和G_(CTL)两种蛋白分别与CpG佐剂混合,在0、2、4周以肌肉注射方式免疫昆明小鼠,免疫结束后检测小鼠肺部匀浆液中的IFN-γ、IL-4及Ig E等指标。同时末次免疫结束后,小鼠用滴度105pfu的RSV进行攻毒,解剖分离小鼠肺部,制备病理切片进行观察。G_(CTL)蛋白免疫组肺部匀浆液中的IL-4以及IgE低于G_(CX3C)蛋白免疫组。CpG组及GCTL+CpG组肺组织匀浆液中的INF-γ含量以及INF-γ/IL-4比值显著高于其他组(P0.05),且ELISPOT实验表明CpG佐剂能够促使分泌INF-γ的脾淋巴细胞数量增多。攻毒后,通过肺部组织切片观察,发现PBS和CpG免疫组肺部病变极为严重,G_(CTL)+CpG组的病变程度比G_(CX3C)+CpG组严重,而G_(CX3C)组的病变情况比G_(CTL)组严重。这些结果表明,重组G_(CTL)蛋白能够降低动物免疫应答的Th2型极化,具有良好的安全性。     

人呼吸道合胞病毒G蛋白在大肠杆菌中的表达及联合不同新型佐剂免疫效果的研究

人呼吸道合胞病毒（Human respiratory syncytial virus, hRSV）是导致5岁以下儿童和老人住院和死亡的主要原因。hRSV囊膜表面的融合蛋白F(Fusion protein, F)和吸附蛋白G(Attachment protein, G)均能诱导产生保护性中和抗体,但目前临床研究主要集中于F蛋白的亚单位疫苗及保护性单抗的研发,对G蛋白的研究较少。虽然G蛋白的高度糖基化导致其免疫原性较差,但使用佐剂能改善G蛋白的免疫效果。本研究利用大肠杆菌成功表达了hRSVA-Long株G蛋白膜外区67～298氨基酸（命名为REG）,并探索了REG与四种不同组合形式的新型佐剂联合免疫BALB/c小鼠的免疫效果：BFA03佐剂、B型CpG OND混合磷酸铝佐剂组合、C型CpG OND混合磷酸铝佐剂组合、BALB/c小鼠CD4+T细胞表位肽混合C型CpG OND和磷酸铝佐剂组合。对每只小鼠大腿肌肉多点注射100μL免疫原,初次免疫后第28天进行加强免疫。实验结果表明,接种REG联合新型BFA03佐剂的小鼠体内诱导产生结合抗体的能力最强,且其与接种REG蛋白联合B型CpG OND...     

浙江地区呼吸道合胞病毒G基因分子特征分析

收集2004年冬季浙江省儿童医院呼吸道感染患儿的鼻咽吸引物,进行呼吸道合胞病毒(RSV)分离,对分离株用特异性RT-PCR鉴定;对鉴定阳性的RSV毒株进行G蛋白全基因序列测定,并与RSV国际标准株及各地参考株的G蛋白基因序列进行同源性比较并构建基因进化树。结果表明,在4株RSV浙江分离株中,3株G蛋白基因ORF全长897bp,另1株为894bp;各分离株之间的核苷酸与氨基酸同源性分别为98.05%、97.06%;与A型RSV标准株的核酸同源性为95.69%,与B型RSV标准株的同源性为78.79%;其3’端基因高变区核苷酸序列与RSVGA2亚型的同源性最高。提示2004年冬季浙江省RSV流行株属于RSVGA2亚型。     

浙江地区呼吸道合胞病毒G基因分子特征分析

收集2004年冬季浙江省儿童医院呼吸道感染患儿的鼻咽吸引物,进行呼吸道合胞病毒(RSV)分离,对分离株用特异性RT-PCR鉴定;对鉴定阳性的RSV毒株进行G蛋白全基因序列测定,并与RSV国际标准株及各地参考株的G蛋白基因序列进行同源性比较并构建基因进化树.结果表明,在4株RSV浙江分离株中,3株G蛋白基因ORF全长897bp,另1株为894bp;各分离株之间的核苷酸与氨基酸同源性分别为98.05%、97.06%;与A型RSV标准株的核酸同源性为95.69%,与B型RSV标准株的同源性为78.79%;其3'端基因高变区核苷酸序列与RSV GA2亚型的同源性最高.提示2004年冬季浙江省RSV流行株属于RSV GA2亚型.     

牛呼吸道合胞体病毒G蛋白的截短表达与鉴定

经生物学软件DNA Star分析,将牛呼吸道合胞体病毒G基因截短成2个片段G1和G2。然后用人工合成的牛呼吸道合胞体病毒G基因为模板,用PCR分别扩增G1和G2基因片段,其大小分别为570 bp和308 bp。将目的片段定向克隆到pET30a表达载体中,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导后G1和G2基因片段都获得了表达,且都为可溶性表达。用Ni柱亲和层析法在非变性条件下纯化重组蛋白,经免疫印迹试验鉴定证明纯化的重组蛋白G1具有良好的抗原性和特异性,而重组蛋白G2无反应性。应用纯化的重组蛋白G1进行的间接ELISA与免疫印迹试验在国内牛血清中检测到了BRSV血清抗体。本研究所表达的重组蛋白G1为基于牛呼吸道合胞体病毒G蛋白的血清学诊断方法的建立与牛呼吸道合胞体病毒G蛋白生物学功能的研究奠定了基础。     

呼吸道合胞病毒F蛋白抗体的研究进展

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染,是造成婴幼儿、学龄前儿童、免疫缺陷患者、老年人等高危群体住院治疗及死亡的重要病因。目前,多个预防RSV感染的候选疫苗正处于研发中,尚无安全、有效的疫苗面世。对RSV感染的处理仍以治疗为主,使用帕利珠单抗(Palivizumab)是当前仅有的预防药物。在过去数年间出现的新型抗体药物,如多克隆抗体、单克隆抗体、纳米抗体等有些已进入了临床前或I、II、III期临床试验阶段。融合蛋白(fusion protein,F蛋白)在RSV感染过程中是不可或缺的,它介导病毒包膜与宿主细胞膜的融合。在感染过程中,F蛋白从亚稳态的融合前构象状态(prefusion fusion protein,pre F)转变为热力学稳定的融合后状态(postfusion fusionprotein,post F)。近年来,研究人员通过不断筛选,获得了多株针对pre F的抗体。与结合post F的抗体相比,这些抗体具有更强的RSV中和活性。一些更新的抗体药物候选品,在实验中显示出了效力强、药代动力学特征明显、半衰期长等特点,并能以其他途径给药,而且能降低其制备成本。现就抗RSV pre F的抗体研究进展作一概述。     

呼吸道合胞病毒与哮喘

据流行病学资料统计,呼吸道合胞病毒感染与哮喘的发生和发展密切相关。大部分ＲＳＶ感染病儿数年后出现哮喘症状,且ＲＳＶ感染可存在于哮喘的各种不同时期中,故可能是哮喘的诱发和加重因素。其致病机制可能与ＲＳＶ特异性ＩｇＥ诱导的Ｉ型变态反庆,组胺释放因子和嗜酸性粒细胞正性蛋白等细胞因子,组胺等炎性介质的释放以及ＲＳＶ对上皮的直接毒性等有关。     

呼吸道合胞病毒细胞免疫的研究进展

本文通过介绍单核吞噬细胞、T辅助细胞、细胞毒性T细胞、NK细胞和K细胞在呼吸道合胞病毒感染免疫中的作用,对呼吸道合胞病毒的细胞免疫机制作一概述。     

呼吸道合胞病毒自然温度敏感株的研究Ⅰ．呼吸道合胞病毒自然温度敏感株的筛选及其特

本文利用离心蚀斑法从武汉地区１９７８－１９８３年及１９８７－１９９２年的７３株呼吸道合胞病毒流行毒株中直接筛选出１７株自然温度敏感株,并以３３°／３９．５°Ｃ的ＩｇＰＦＵ相差≥３作为确定自然温度敏感株的标准。每年筛选出自然温度敏感株的比例平均为１５－ｌ７％;根据毒株温敏性状的差异,将呼吸道合胞病毒流行株分为ｔｓ￣＋,ｔｓ￣±与ｔｓ毒株;并初步发现Ｂ亚型毒株所含的自然温敏株的比例明显高于Ａ型毒株（Ｐ＜０,０５）。初步测定２株该自然温敏株的遗传稳定性,结果显示具有较稳定的特性。本文结果提示,呼吸道合胞病毒在自然界不仅存在Ａ,Ｂ两亚型变异,也存在温敏性状的变异,可能存在毒力的变异。