医药上的应用

确定了固定化的和游离悬浮的天蓝色链霉菌A3(2)的活性,并检验了复合培养基。用网状的聚氨     

固定化乳酸乳球菌连续生产Nisin的研究

以海藻酸钙为材料 ,固定乳酸乳球菌 (Lactococcuslactissubsp .lactis)SM5 2 6 ,研究不同条件对Nisin合成的影响。结果表明 ,利用 2 %海藻酸钠在 1 0mmol LCaCl2 条件下 ,得到的固定化细胞颗粒稳定性较好 ,可维持 90h无破裂 ;在发酵过程中SYS3培养基中的无机盐成分尤其磷酸盐对固定化颗粒有破坏作用 ;用mSYS3培养基代替SYS3 ,通过 72h三批次循环的半连续培养 ,Nisin活性为 85 0IU mL ,无明显的细胞渗漏现象。连续化生产 70h ,Nisin活性达 1 1 5 0IU mL ,相当于游离细胞的发酵水平。     

氧化修饰与丙二醛修饰的低密度脂蛋白对巨噬细胞高密度脂蛋白结合量及胆固醇酯聚集的影响

本文用Cu~(2+)(引发氧化修饰)和脂质过氧化降解产物丙二醛(MDA)对低密度脂蛋白(LDL)进行修饰,观察了两种修饰的LDL对巨噬细胞高密度脂蛋白_3(HDL_3)结合量及细胞内胆固醇酯聚集的影响。结果说明:1.Cu~(2+)和MDA修饰的LDL都可使巨噬细胞HDL_3结合量下降,细胞内脂质过氧化物(LPO)含量升高,但当处理细胞在含10％无脂血清(LPDS)培养液中继续培养时,由MDA修饰的LDL(MDA-LDL)导致的HDL_3结合量降低又有一定的恢复,细胞内LPO含量不再升高,而Cu~(2+)修饰的LDL(Cu~(2+)-LDL)处理的细胞继续培养时,HDL_3结合量则继续下降,细胞LPO含量则继续升高。2.由Cu~(2+)-LDL导致的巨噬细胞HDL_3结合量下降与细胞LPO含量升高之间呈负相关(r=-0.81,P<0.01)。3.MDA-LDL和Cu~(2+)-LDL都可造成巨噬细胞胆固醇酯聚集,但MDA-LDL造成的胆固醇酯可被HDL_3大量清除而Cu~(2+)-LDL造成的胆固醇酯聚集则不能。     

固定化细胞拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的研究

【目的】筛选鉴定一株产酯酶用于选择性拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的菌株,利用该菌株固定化细胞催化拆分外消旋底物。【方法】通过富集培养、罗丹明B平板初筛及复筛培养获得一株选择性拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的菌株,通过对其形态、生理生化特征及16S r DNA序列分析,确立该菌株系统发育地位。优化了利用硅藻土-戊二醛吸附交联法对该菌体细胞固定化的条件,研究固定化细胞催化性质及操作稳定性。【结果】该菌为革兰氏阴性菌,鉴定其为甲基球状菌属(Methylopila)。固定化体系最优条件:聚乙烯亚胺0.15%(V/V),戊二醛0.2%(V/V),硅藻土6 g/L,菌体质量浓度100 g/L。与游离细胞相比,固定化细胞最适p H由8.0变为8.5,最适温度由35°C变为40°C,p H稳定性和温度稳定性都有所提高。Cu~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)能促进酶活,Zn~(2+)、Fe~(2+)抑制酶活。固定化细胞的有机溶剂耐受性较游离细胞有所提高。动力学分析细胞固定化后Km值变大,底物亲和力降低。利用固定化细胞水解(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯,底物浓度200 g/L,反应20 h,保留构型为S型,得率47.8%,对映体过量值ees为99.4%,重复使用12次后仍保留初始酶活的80%以上。【结论】开发了利用Methylopila sp.cxzy-L013固定化细胞择性拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的工艺,该工艺具有良好的工业应用前景。     

重组菌BL21/pET22b-argE固定化条件研究

研究了基因工程菌BL21/pET22b-argE固定化条件。最适包埋材料为海藻酸钙,优化后的包埋条件为海藻酸钠20g.L-1(含有12 g.L-1菌液)滴至2%CaCl2溶液中,固定化16 h。固定化细胞酶拆分蛋氨酸的速率比游离细胞酶慢,但其终极拆分能力与游离细胞酶相当。固定化细胞酶反复利用8批时酶活仍保持在95%以上,具有很好的工业应用优势。     

壳聚糖酶产生菌的筛选及固定化细胞产酶

旨在筛选得到一株壳聚糖酶产生菌,并研究固定化细胞产酶的条件。在培养基中以壳聚糖为唯一碳源,对土壤样品进行筛选,获得一株无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria CH-0203),该菌可被壳聚糖诱导产生壳聚糖酶。固定化细胞产酶的研究结果表明,多孔玻璃可以有效吸附CH—0203菌细胞。在最适发酵条件下(pH6．5,培养基与载体的总体积48ml,载体与培养基的比例为1．5g/4．0ml,吸附时间是20h-26h),发酵液酶活达到4．5U／ml,比游离细胞发酵提高了16％。采用半连续发酵的方式,固定化的细胞可以稳定发酵产酶120h左右。固定化细胞产酶的效率大大高于游离细胞。     

食品上的应用

<正>在东方国家,红曲霉用于制造红色米酒、绍兴酒、红色腐乳以及红曲米。在游离细胞发酵实验中,红曲NRRL1993用工业葡萄糖和新胨(neopeptone)为培养基,在28℃和摇瓶通气条件下培养。固定化细胞发酵是在藻朊酸中接种48小时的原培养物进行     

固定化原生质体产谷氨酸脱氢酶的研究

本文报道了用海藻酸钙凝胶包埋法制备固定化谷氨酸捧杆菌T6—13原生质体及其用于生产谷氨酸脱氢酶(GDH,E．C．1．4．1．4)的研究。在一定条件下游离细胞和固定化细胞胞内可积累谷氨酸脱氢酶,但并不分泌到胞外。对数生长前期的细胞经蛋清溶菌酶处理14h后分离得到原生质体,游离原生质体和固定化原生质体可产胞外GDH。用3％海藻酸钙凝胶包埋10%的原生质体制备的固定化原生质体具有较高的产酶性,分批培养72h后发酵液中GDH活力可达到1．64×10^-2u／ml,为游离细胞胞内产酶的205％。固定化原生质体可用溶菌酶处理固定化细胞而制得,与直接固定化原生质体制备的固定化原生质体具有同样的产酶能力,且制备方便。固定化原生质体可重复使用6批次(约18天),且具有良好的贮藏稳定性。     

利用基因工程菌HC01固定化细胞转化生产D-对羟基苯甘氨酸

对一菌两酶工程菌HC01转化底物DL-对羟基苯海因(DL-HPH)的最适条件及其细胞固定化进行了研究,HC01游离细胞转化DL-HPH的最适条件为40°C、pH7.5。通过对固定化细胞酶活力测定,确定细胞固定化的最优条件为海藻酸钠浓度2.5%、细胞浓度0.029g/mL、钙离子浓度3%。固定化HC01的热稳定性比游离细胞高5°C,二价金属离子Mn2+、Mg2+、Cu2+、Co2+和Ni2+在浓度为0.1mmol/L时对固定化细胞中D-海因酶(HYD)和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶(CAB)两酶的活力无显著影响,Mn2+和Mg2+可分别使游离细胞中CAB活力提高至原来的2.1和2.7倍。在氮气保护下,当初始pH为9.0、转化温度为40°C、转速为80r/min,利用固定化HC01转化30g/L的DL-HPH时,36h后转化率可达97%左右,产物D-HPG经纯化后光学纯度达到99.7%,得率可达85%。     

抗重金属土壤微藻F1对Cu~(2+)胁迫的耐受生理机制研究

以从新疆富蕴县金属矿区土壤筛选出的抗重金属微藻F1为材料,测定在不同浓度(0、0.5、1.0、1.5和2.0mmol/L)Cu~(2+)胁迫下F1微藻叶绿素a、可溶性蛋白、MDA和谷胱甘肽(GSH)含量,以及谷胱甘肽硫转移酶(GST)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX)和谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCL)的活性,同时用红外光谱仪检测细胞壁上参与重金属螯合的官能团,用扫描电镜分析细胞壁上的离子交换情况,探讨F1土壤微藻对Cu~(2+)胁迫的耐受生理机制,为利用微藻生态修复技术去除污染区土壤重金属奠定基础。结果显示:(1)F1土壤微藻对Cu~(2+)具有较强的耐抗性。(2)F1土壤微藻细胞中参与吸附Cu~(2+)的基团分别为-OH、-CH2、-RCONH2和C-OH等。(3)F1土壤微藻在吸附Cu~(2+)的过程中,Cu~(2+)与细胞壁上的Al~(3+)、Fe~(2+)、Mg~(2+)、Ca~(2+)、K~+、Na~+和Zn~(2+)发生了交换。(4)藻细胞中的GSH和GSH-PX在F1土壤微藻耐受Cu~(2+)胁迫时起主要作用。研究认为,F1微藻种对Cu~(2+)的耐受性首先与其细胞壁外表细微结构及其离子交换特性有关,并且细胞壁上-OH、-CH_2、-RCONH_2和C-OH等化学基团起着重要作用,其次细胞内的谷胱甘肽以及谷胱甘肽相关酶类能够有效清除活性氧的过量积累,最终保护细胞免受重金属胁迫损伤。     

应用数学统计法优化副干酪乳杆菌HDl.7固定化细胞制备和产细菌素发酵

[目的]应用数学统计法对副干酪乳杆菌HD1.7的固定细胞制备和发酵条件进行优化,以提高细菌素产量.[方法]用2(6-2)部分因子分析法筛选对细菌素产量影响显著的因子,发现海藻酸钠浓度、接种量和发酵时间对细菌素的产生影响显著.利用最陡爬坡法逼近最大响应区域.用Box-Behnken设计确定最佳海藻酸钠浓度、接种量和发酵时间,并进行分批重复发酵.[结果]固定化生产细菌素的最佳条件是海藻酸钠浓度2.8%、CaC2,浓度5%、固定化时间4 h、菌体包埋量1/20、发酵时间63 h和固定化细胞的接种量8.2%,在此基础上用固定化细胞进行分批重复发酵,每批细菌素的发酵周期为24 h.[结论]通过对固定化细胞制备和发酵条件的优化,固定化细胞在327 h的分批重复发酵中细菌素的总体产量比游离细胞提高了19%,发酵液中无明显细胞渗漏现象且实现了细胞的重复利用,为细菌素的进一步研究和最终提取奠定了基础.     

TUNEL法检测Cu~(2+)胁迫诱导的中国树花共生藻细胞的死亡

为了探讨铜离子胁迫对中国树花共生藻细胞毒害作用的机制及细胞死亡的原因,通过徒手切片,采用两种TUNEL检测法(Promega和Roche试剂盒)对2mmol/L和4mmol/L Cu~(2+)胁迫24h的中国树花地衣体共生藻细胞凋亡情况进行观察。结果表明:(1)伊文思蓝染色法检测结果显示,中国树花共生藻细胞活力在2和4mmol/L Cu~(2+)胁迫下显著降低,其细胞的死亡率随着Cu~(2+)浓度的提高和处理时间的延长而明显增加;(2)在2和4mmol/L Cu~(2+)胁迫条件下,中国树花共生藻细胞的TUNEL阳性细胞率在Promega试剂盒中检测结果分别为50.30%和31.21%,而在Roche试剂盒中共生藻细胞TUNEL阳性标记核分别为53.17%和36.88%,两种TUNEL检测法结果类似。(3)与伊文思蓝染色法检测的Cu~(2+)胁迫中国树花共生藻细胞活力相比,发现较低浓度的Cu~(2+)(2mmol/L)胁迫对地衣共生藻细胞的毒害作用可诱导启动细胞凋亡程序,而较高浓度的Cu~(2+)(4mmol/L)胁迫对地衣共生藻产生较严重的毒害则导致大部分细胞的坏死,只有极少数细胞出现细胞凋亡。(4)两种试剂盒均可用于较低浓度Cu~(2+)胁迫引起的地衣体共生藻细胞凋亡的检测;直接将徒手切片材料用于TUNEL细胞凋亡原位检测中也得到了较理想的结果,避免了制备石蜡切片的繁琐步骤,缩短实验时间,简化了实验流程。     

纱布固定丛粒藻细胞产烃的研究

用纱布作固相载体,研究了富含烃的群生绿藻——丛粒藻(Botryococcus braunii Kutz.)细胞的直接吸附。结果表明,纱布是固定化这类细胞维持生长(生物量)和光合话性(释放O2)的良好的新载体。固定在纱布上的B. braunii 细胞产烃速度比得上游离细胞。它们产生榴同的烃类,主要是c广c,．的奇碳数的二烯同系物。在气升式培养条件下,主要施外烃的分布不受固定化的影响。在光照摇床上培养H天,固定在纱布上的B. braunii 的O2释放量、生物量和产烃量分别为1．84μmol／min／L、1.44g／L和0.82g／L,与游离细胞的相似。扫描电镜的观察指出,固定化的丛粒藻细胞附着在纱稚的表面;在观察期间,其形态与游离细胞的相似。     

玉米芯-海藻酸钠共固定化重组大肠杆菌生产NAD

对重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)p ET30α(+)-Nmnat共固定化生产NAD的固定化条件进行研究。比较不同载体和不同固定化方法,确定玉米芯—海藻酸钠共固定化为最佳方法。优化共固定化条件,得到的最适条件为:固定化过程中吸附和混合时间分别为0.5 h、1 h,海藻酸钠质量分数为3%,玉米芯-全细胞质量比为5∶4,CaCl_2质量分数为2%,转速为140 r/min。与游离细胞相比,共固定化细胞具有更高的产率和更好的操作稳定性。玉米芯-海藻酸钠共固定化适宜用于重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)p ET30α(+)-Nmnat生产NAD。     

抗Cu2+嗜酸氧化亚铁硫杆菌的驯化及诱变育种

从我国三大铜矿的酸性矿坑水中富集分离出9个具有较强活性的嗜酸氧化亚铁硫杆菌菌株,经过Cu~(2 )的系列浓度梯度的培养,选出其中天然抗铜能力最强的菌株26~#,在Cu~(2 )浓度为0．20mol/L的9K培养基中能在72h内完全氧化培养基中的Fe~(2 ),在含0．22mol/L Cu2~(2 )的9K培养基中能在192h内完全氧化培养基中的Fe~(2 )。以CuSO_4·5H_2O为单变量驯化介质驯化该26~#抗铜菌株,26~#驯化菌株的Fe~(2 )氧化能力明显增强:在含0．25mol/LCu~(2 )的9K培养基中能在84h内完全氧化其中的Fe~(2 )。为了提高驯化菌的稳定性,将驯化后的26~#菌株用紫外线进行诱变。研究结果表明:驯化诱变对菌种的改良有重要的作用,诱变后菌株的生长性能稳定,氧化活性进一步提高,26~#驯化诱变菌在0．25mol/LCu~(2 )存在的条件下完全氧化9K培养基中Fe~(2 )的时间约为60h,对Fe~(2 )氧化能力明显强于驯化菌及野生菌。     

Cu2+对喜树愈伤细胞中喜树碱合成的影响

喜树碱是一种从木本植物喜树(Camptothecaacuminata)中分离得到的抗癌活性物质,通过细胞培养合成喜树碱是喜树碱生产的一条重要途径。研究Cu~(2 )对喜树愈伤细胞培养中喜树碱积累的影响,结果表明,在B5培养基中添加0.008mg/mLCuCl2时,对喜树愈伤细胞的生长没有明显影响,但是对喜树愈伤细胞合成喜树碱的促进作用最强,喜树碱含量比未诱导前增加了约30倍。Cu~(2 )阻止培养细胞后期过氧化物酶活力的下降,并抑制花青素的生成。与黑暗培养相比,光照条件下添加Cu~(2 )更利于喜树愈伤细胞诱导合成喜树碱。     

聚乙烯亚胺/戊二醛交联法固定化重组酯酶大肠杆菌细胞

利用聚乙烯亚胺/戊二醛交联法对重组酯酶大肠杆菌E.coli BL21细胞进行固定化研究,并对交联工艺条件进行优化。结果表明:在大肠杆菌细胞质量浓度200 g/L、硅藻土质量浓度2 g/L、聚乙烯亚胺(PEI)体积分数3%、交联时间1.5 h、戊二醛(GA)体积分数0.5%以及交联时间0.5 h时,固定化细胞的酯酶活力最高。固定化细胞的最适反应温度和pH分别为45℃和8.0,且温度稳定性和pH稳定性均高于游离细胞。当底物浓度为300mmol/L时,固定化细胞重复使用15批次后,其相对酶活仍能保留在80%以上。因此,该固定化细胞具有良好的操作稳定性。     

应用数学统计法优化副干酪乳杆菌HD1.7固定化细胞制备和产细菌素发酵

摘要：【目的】应用数学统计法对副干酪乳杆菌HD1.7的固定细胞制备和发酵条件进行优化,以提高细菌素产量。【方法】用26?2部分因子分析法筛选对细菌素产量影响显著的因子,发现海藻酸钠浓度、接种量和发酵时间对细菌素的产生影响显著。利用最陡爬坡法逼近最大响应区域。用Box-Behnken设计确定最佳海藻酸钠浓度、接种量和发酵时间,并进行分批重复发酵。【结果】固定化生产细菌素的最佳条件是海藻酸钠浓度2.8%、CaCl2浓度5%、固定化时间4 h、菌体包埋量1/20、发酵时间63 h和固定化细胞的接种量8.2%,在此基础上用固定化细胞进行分批重复发酵,每批细菌素的发酵周期为24 h,产量为游离发酵的70%,比游离细胞发酵周期缩短1/2。【结论】通过对固定化细胞制备和发酵条件的优化,固定化细胞在327 h的分批重复发酵中细菌素的总体产量比游离细胞提高了19%,发酵液中无明显细胞渗漏现象且实现了细胞的重复利用,为细菌素的进一步研究和最终提取奠定了基础。     

海因酶产生菌SHNU01的包埋固定化研究

对从土壤中筛选得到的高选择性产D-海因酶菌株SHNU01的性质进行了研究并探讨了用PVA-硼酸法进行包埋固定的效果。研究结果显示:固定化后的细胞与游离细胞相比,最适反应温度由游离细胞的37℃上升为47℃,在此温度下固定化细胞的酶活可达到游离细胞的3倍;连续反应7批后,固定化细胞活力为初始活力的80%。固定化细胞在操作稳定性、贮存稳定性等方面较游离细胞也有较大提高。     

固定化细胞拆分DL-泛解酸内酯的初步研究

用卡拉胶包埋串珠镰孢霉菌Fusarium moniliforme SW-902菌丝体,得到D－泛解酸内酯水解酶活力较高的固定化细胞。与游离细胞相比较,固定化细胞酶活随pH变化的范围以及对温度适应的范围大致与游离细胞相仿。用固定化细胞进行反复分批酶水解30批,每天一批,酶活稳定,平均水解率28．0％。固定化细胞冰箱（4℃）贮存8周,酶活未见下降。