拟南芥MLH1基因启动子甲基化作为镉胁迫生物标记物潜力评估

应用重亚硫酸盐测序技术,研究了镉(Cd)胁迫21 d后拟南芥幼苗错配修复基因Mut L-homologue1(MLH1)启动子甲基化的变化趋势。结果显示,拟南芥MLH1启动子区域为-346~+42(391 bp),含有71个胞嘧啶:16个Cp G、6个CHG(H为C、A或T)和49个CHH位点。对照植株Cp G、CHH和CHG位点的甲基化率分别为44.8%、40.5%和52.0%。随Cd胁迫浓度的增加,MLH1启动子区胞嘧啶位点发生超甲基化和去甲基化的位点数逐渐增加;这些位点的甲基化率均呈上升趋势,且均高于对照组(除CHG位点外)。MLH1启动子区域71个胞嘧啶中,Cp G6、Cp G9、CHH44和CHG4位点的甲基化多态性对Cd胁迫更敏感,且具有剂量-效应关系;其中0.25 mg·L-1Cd胁迫下,Cp G9位点为超甲基化,其甲基化变化率为20.0%,其他3个位点为去甲基化,其甲基化变化率分别为12.0%、20.0%和20.0%。相对于幼苗的其他生物学性状(叶片数、生物量及叶绿素含量),Cd胁迫下MLH1启动子甲基化变化更显著且敏感,上述4个胞嘧啶热点的甲基化多态性可作为检测Cd胁迫对植物遗传毒性效应潜在的、有效的生物标记物。     

Cu胁迫对拟南芥幼苗错配修复基因表达的影响

采用半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,以18S rRNA为内参基因,研究了Cu胁迫对拟南芥(Arabidopsis thaliana)幼苗错配修复相关基因(MLH1、MSH2、MSH3、MSH6、MSH7)表达的影响,并结合幼苗的形态和生理指标,选取Cu胁迫敏感的生物标记物.结果表明,Cu处理10 d后,对拟南芥种子发芽率、地上部鲜重及叶绿素含量的影响不大;根的长度明显受到抑制;拟南芥幼苗地上部可溶性蛋白质含量随着Cu浓度增加明显降低;5个错配修复相关基因的表达均受到不同程度的抑制,Cu浓度与拟南芥幼苗上述指标之间存在明显的剂量-效应关系.以上结果表明,地上部可溶性蛋白含量变化与上述错配修复相关基因表达量的改变趋势一致,且均对Cu胁迫较敏感,可以作为检测Cu污染对植物遗传毒性效应的生物标记物.     

菖蒲幼苗对Cd胁迫的响应及其Cd富集能力分析

研究了菖蒲（Acorus calamus L．）幼苗对不同浓度Cd胁迫的响应及其Cd富集能力。结果表明,随Cd浓度的提高（0～25mg·L^-1）,菖蒲幼苗的株高、根长、干质量、叶绿素含量和对Cd的耐性指数均逐渐下降,脯氨酸含量逐渐升高;各处理组的SOD和POD活性均高于对照,且以15mg·L^-1Cd处理组最高。随胁迫时间延长（1—10d）,叶绿素含量持续下降,而SOD和POD活性及脯氨酸含量则先升高后下降。菖蒲幼苗体内Cd含量随Cd浓度的提高而增加,根系对Cd的富集能力高于地上部分。在Cd胁迫条件下,菖蒲幼苗对Cd的转移系数小于1,根系对Cd的滞留率为89．5％-93．9％,表明菖蒲幼苗根系对Cd有较强的滞留作用和富集能力。     

镉胁迫对拟南芥幼苗错配修复基因表达的影响

采用半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术研究了Cd胁迫对拟南芥(Ara-bidopsis thaliana)幼苗错配修复和增殖细胞核抗原基因表达的影响,并结合幼苗的形态和生理指标,选取Cd胁迫敏感的生物标记物.结果表明:不同浓度(0.25、0.5、1.0 mg·L1)Cd处理对拟南芥幼苗叶片数、地上部鲜质量影响不大;Cd浓度为0.25 mg·L-1时,地上部分可溶性蛋白质含量明显升高(P<0.05),Cd浓度为0.5和1.0 mg·L-1时,可溶性蛋白质含量明显降低(P<0.05);叶绿素含量随着Cd浓度的增加而微弱增加(P>0.05).Cd浓度为0.25 mg·L-1时,以18S rRNA为内参照,PCNA1、PCNA2、MSH2、MSH3、MSH6、MSH7 6个基因均出现了诱导表达,当Cd浓度增加到1.0 mg·L-1时,除了MSH6持续表达诱导及MSH3基因与对照相比表达抑制外,其他基因的表达依然出现诱导,但都低于0.5 mg·L-1Cd处理下的基因表达水平.以上结果表明,基因表达的改变可作为检测Cd污染对植物遗传毒性效应潜在有用的生物标记物.     

镉胁迫对矮牵牛种子萌发、幼苗生长及抗氧化酶活性的影响

采用营养液培养的方法研究了不同浓度镉Cd（0、1、2和4 mmol·L^-1）处理对矮牵牛（Petunia hybrida）种子萌发、幼苗生长及生理特性的影响。结果发现：与对照相比,较低浓度（1 mmol·L^-1）Cd处理下矮牵牛种子萌发和幼苗生长均显著被抑制,当Cd浓度增至4 mmol·L^-1时完全抑制了矮牵牛种子的萌发。Cd胁迫在低浓度时激活矮牵牛幼苗叶片过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性,而高浓度产生抑制效应;抗坏血酸过氧化物酶（APX）和超氧化物歧化酶（SOD）活性与对照相比均显著升高,丙二醛（MDA）含量无显著变化。不同浓度的乙二胺四乙酸(EDTA)的加入使4 mmol·L^-1 Cd胁迫下矮牵牛幼苗叶片POD和APX活性增加,但不影响SOD和CAT活性;此外,6 mmol·L^-1 EDTA使Cd胁迫下矮牵牛幼苗叶片中MDA含量增加。结果表明,Cd胁迫抑制矮牵牛种子萌发和幼苗生长,却使幼苗叶片POD、CAT和APX活性增加,EDTA的加入能够进一步提高Cd胁迫幼苗POD和APX活性。因此,矮牵牛幼苗在Cd胁迫下具有较强的抗氧化损伤的能力。     

褪黑素对水稻镉积累及其化学结合形态的影响

研究了添加外源褪黑素对水稻幼苗中Cd积累以及水稻体内Cd化学形态分布的影响.结果表明: Cd胁迫显著降低水稻幼苗地上部和根部的生物量,并且显著降低水稻叶片的叶绿素含量.适宜的外源褪黑素添加能明显提高Cd胁迫下水稻的地上部和根部生物量,降低水稻地上部和根部Cd含量.当Cd胁迫浓度为5 μmol·L^-1时,添加20 μmol·L^-1褪黑素使水稻地上部和根部Cd含量分别比对照处理降低48.4%和16.9%,添加100 μmol·L^-1褪黑素水稻地上部和根部Cd含量分别降低67.5%和47.9%.添加外源褪黑素也显著降低了水稻体内Cd的转运效率.当Cd胁迫浓度为20 μmol·L^-1时,添加20 和100 μmol·L^-1褪黑素使水稻Cd的转运效率分别比对照降低24.4%和46.8%.通过逐步提取法对水稻幼苗Cd的化学结合形态进行分析发现,添加外源褪黑素使水稻体内氯化钠提取态Cd的比例提高,而水溶态Cd、乙醇提取态Cd的比例明显降低,说明添加褪黑素可促进水稻体内移动性较强的Cd形态向移动性较弱的Cd形态转移,从而降低水稻对Cd的吸收和转运.     

Cd胁迫下黄菖蒲幼苗根系生长与Cd积累的研究

采用水培法研究了Cd胁迫对黄菖蒲（Iris pseudacorus L．）幼苗根系生长和Cd含量的影响,用透射电镜观察了Cd胁迫对根尖细胞亚显微结构的影响并确定了Cd沉积部位。结果表明,10mg·L^-1 Cd处理对黄菖蒲幼苗根系的生长有一定促进作用,根毛数量及不定根上侧根的数量、密度和长度均高于对照;Cd浓度高于25mg·L^-1时,根系的生长发育受到抑制,上述指标均显著低于对照。用10～40mg·L^-1 Cd处理后,黄菖蒲幼苗不定根上侧根中的Cd含量均显著高于未长侧根的不定根和去掉侧根的不定根（P〈0．05）,说明不定根上的侧根对Cd沉积有重要作用。100mg·L^-1 Cd处理能导致根尖细胞质浓缩、质壁分离和液泡变大,且大量Cd颗粒沉积在细胞壁上和细胞间隙中,表明细胞壁和细胞间隙对Cd的沉积作用可能是黄菖蒲幼苗耐Cd胁迫的重要机理之一。     

镉胁迫下玉米幼苗生理生态的变化

用不同浓度Cd2 + 处理玉米种子 ,在室内常规培养 ,研究了种子萌发和幼苗生理生态的变化。结果表明 ,镉影响玉米种子的萌发和幼苗的生长。当Cd2 + 浓度高于 5 0mg·L-1时 ,显著抑制种子的发芽率 ;随Cd2 + 浓度的增加 ,根系长度和侧根数减小 ;在Cd2 + 浓度小于 5mg·L-1时 ,镉刺激苗高和根系及地上部干物质量增加 ,当Cd2 + 浓度超过相应浓度时 ,苗高和根系及地上部的生长量随Cd2 + 浓度提高而降低。镉胁迫下幼苗根系活力和叶绿素含量明显降低 ,根内丙二醛含量增加。镉影响玉米幼苗对矿质元素的吸收。根系和茎叶中Ca、Mg、Fe、Cu的吸收量随Cd2 + 浓度提高而增加 ,K、Zn的吸收量随Cd2 + 浓度提高而减少。     

巢式甲基化特异性PCR检测肺癌病人WIF-1基因启动子区异常甲基化

为了检测肺癌患者血浆中WIF-I基因启动子区的甲基化状态,收集肺癌患者及健康对照者的血浆标本,采用巢式甲基化特异性PCR（nMSP）法检测WIF-I基因启动子区甲基化状态,并与普通甲基化特异性PCR（MSP）法进行了比较,结果在58例肺癌患者血浆样品中经nMSP法发现20例WIF-I基因启动子的过甲基化,用MSP法只检出10例,有吸烟史组WIF-1基因的甲基化率高于无吸烟史组（P〈0．05）．而20例正常对照血浆中都未检测到形胆J基因启动子的过甲基化;表明利用巢式MSP（nMSP）法检测外周血血浆中WIF-1基因启动子的甲基化,可为非损伤性筛选和早期诊断肺癌提供有价值的信息．     

镉胁迫对拟南芥幼苗基因组DNA多态性的影响

应用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术,检测了镉(Cd)胁迫对拟南芥幼苗叶片DNA多态性的影响,并结合其形态和生理指标,选取Cd污染敏感的生物标记物.结果表明:0.125～3.0 mg·L-1Cd处理21 d后,拟南芥幼苗叶片的可溶性蛋白质含量随Cd浓度的增加呈倒U字型曲线变化,但其鲜重和叶绿素含量变化均不明显;12条寡核苷酸引物中,有5条引物扩增出稳定、特异的PCR产物;拟南芥幼苗叶片基因组的RAPD图谱中,对照组RAPD图谱中分辨出44条清晰的条带;Cd胁迫使拟南芥幼苗叶片基因组的RAPD图谱发生了改变,包括条带的增加、缺失和条带荧光强度的改变,且与Cd剂量相关.实验证明,Cd影响基因组模板的稳定性,即DNA多态性对Cd污染敏感,可以作为检测Cd污染及其相关生物学效应的潜在生物标记物.     

Ca~(2+)和K~+对拟南芥幼苗镉毒害的缓解作用

该文探讨了外源钙(Ca)或钾(K)处理对不同程度的镉(Cd)胁迫(0–80μmol·L–1)下拟南芥(Arabidopsis thaliana)幼苗的生长和生理特性的影响。综合Ca和K对不同浓度Cd胁迫下拟南芥幼苗生长、根长以及生物量的影响情况,表明各浓度Cd胁迫下外源Ca2+的最适缓解浓度均为10 mmol·L–1;而K+的最适缓解浓度在低浓度(20和40μmol·L–1)和高浓度(60和80μmol·L–1)Cd胁迫下分别为10 mmol·L–1和20 mmol·L–1。在低浓度Cd胁迫下,添加适宜浓度的Ca2+或K+后幼苗可溶性蛋白和丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)活性相比未添加Ca和K的对照组无显著变化,而过氧化物酶(POD)活性和总酚、类黄酮、花色素苷,酸溶性硫醇化合物、谷胱甘肽(GSH)、植物螯合肽(PCs)的含量均下降;高浓度Cd处理下,添加适宜浓度的Ca2+或K+后幼苗的SOD活性升高,POD活性降低,可溶性蛋白、MDA、总酚、类黄酮、花色素苷、酸溶性硫醇化合物、GSH以及PCs的含量也均低于对照组。在各浓度Cd胁迫下,添加外源Ca或K均使拟南芥幼苗根部细胞DNA损伤减弱,表现为TT嘧啶二聚体的累积量显著减少(P0.05)。以上结果表明,在Cd胁迫(尤其是高浓度Cd胁迫)下,外源Ca或K通过调节酚类、金属螯合物质的代谢水平以及提高拟南芥的抗氧化能力来缓解Cd对拟南芥幼苗的毒害效应,缓解细胞DNA损伤。该研究结果不仅能够为深入探讨Ca和K对缓解重金属毒害的分子机理提供实验依据,而且为Ca和K应用于重金属污染的防治提供参考。     

桔梗水浸提液对小麦幼苗的化感作用

采用培养皿滤纸法研究了不同浓度桔梗水浸提液对小麦的幼苗生长及生理生化指标的影响,探讨桔梗植株水浸提液对小麦的化感作用,推测其可能的生理机制。结果表明：桔梗植株水浸提液对小麦幼苗的地上部生长表现为低浓度（≤1mg／mL）促进、高浓度（5—20mg／mL）抑制作用;对根部生长为抑制作用,且抑制强度大于地上部。随处理浓度的升高,小麦幼苗体内POD活性、脯氨酸含量、MDA含量逐渐升高;CAT活性、根系活力、光合色素含量先升高后降低;可溶性蛋白含量和伤害率先降低后升高。桔梗植株水浸提液对小麦总体的化感效应表现为低促高抑,小麦可作为桔梗的轮作作物种植。     

外源脱落酸对小麦幼苗抗镉胁迫能力的影响

以小麦(Triticum aestivum L.)为试材,采用水培法研究了100mg/L镉(Cd2+)胁迫条件下施用外源脱落酸(ABA)对小麦幼苗生长及某些生理生化指标的影响。结果表明:(1)100mg/L Cd2+胁迫下,小麦叶片膜脂过氧化产物丙二醛(MDA)含量显著提高,植株生长受到抑制;(2)外源ABA能够明显提高Cd2+胁迫小麦幼苗的根系活力,增加其叶片SOD、CAT和POD活性,促进其脯氨酸积累,降低MDA的含量,并以5.0μmol/L ABA的效果最明显;(3)1.0～5.0μmol/L外源ABA不同程度地缓解Cd2+胁迫对小麦幼苗生长的抑制作用,且5.0μmol/L时效果最明显,其株高、根长、总干重分别比单一Cd2+胁迫处理显著提高6.73%、149%和10.52%,而10.0μmol/LABA反而加重了Cd2+对小麦幼苗生长的伤害。因此,适宜浓度的外源ABA能够通过增加体内保护酶活性和脯氨酸含量来缓解Cd2+胁迫对小麦幼苗生长的抑制作用,增强小麦幼苗的抗Cd2+胁迫能力,并以5.0μmol/L ABA处理效果最好。     

盐胁迫下镧对水稻幼苗生长的保护效应

通过液培实验,研究水稻幼苗在盐胁迫下,镧对水稻幼苗的保护作用。结果表明：水稻幼苗植株在≤1．5％的盐浓度的盐胁迫下,10mg·L^-1镧能提高幼苗植株超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性;降低幼苗植株脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的含量和脯氨酸（Pro）的含量;减小质膜透性;提高叶片叶绿素含量和叶绿素a／b的比值;增强根系的活力,进而促进水稻幼苗的生长。10mg·L^-1镧对盐胁迫的缓解作用与盐浓度有关,随着盐浓度增大,镧的缓解作用将逐渐消失。分析表明,在≤1．0％和≥0．5％的盐浓度胁迫下,镧对水稻幼苗的生长存在更有效的防御机制,能够促进水稻幼苗的生长代谢。     

茉莉酸对小麦幼苗UV-B抗性的生理学效应研究

以小麦品种‘西农88’(Triticum aestivum L.,cv.Xinong 88)为材料,研究了外源施加不同浓度茉莉酸(1、2.5、5、10 mmol/L)对UV-B辐射(1.5 kJ·m-2·d-1)下小麦幼苗光合色素、抗氧化酶、丙二醛、游离脯氨酸、紫外吸收物、花青素、根系活力等生理指标以及对其生长的影响,探讨了茉莉酸在UV-B辐射胁迫中的可能作用及其作用机制.研究结果表明,外源茉莉酸对小麦幼苗生理指标产生显著影响,并且表现出浓度效应,其中较低浓度的茉莉酸(1 mmol/L和2.5 mmol/L)能明显提高小麦幼苗的UV-B抗性.表现为低浓度茉莉酸显著提高UV-B辐射下小麦幼苗叶片中的总叶绿素含量、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性.并且外源施加的茉莉酸还能够增加小麦幼苗的游离脯氨酸含量,降低脂质过氧化水平,提高花青素含量,增强根系活力.可见,茉莉酸通过提高小麦幼苗的抗氧化酶活性,增加渗透调节物含量以及保护性色素含量,从而缓解膜脂过氧化程度和提高防御物质含量,进而增强植物抵抗UV-B辐射胁迫的能力,保证小麦幼苗正常生长.     

外源脯氨酸对盐胁迫下甜瓜幼苗根系抗坏血酸-谷胱甘肽循环的影响

以2个不同耐盐强度的甜瓜品种‘玉皇’（耐盐性强）和‘雪美’（耐盐性弱）为材料,采用营养液栽培方法,研究外源脯氨酸对盐胁迫下甜瓜幼苗根系抗坏血酸-谷胱甘肽循环的影响。结果显示：（1）盐胁迫下,2个甜瓜品种根系内的还原型抗坏血酸（ASA）、还原型谷胱甘肽（GSH）含量降低,氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量升高,且‘雪美’变化幅度大于‘玉皇’;（2）盐胁迫下,施用外源脯氨酸提高了2个甜瓜品种根系中ASA和GSH的含量,降低了GSSG含量,同时也提高了GSH/GSSG的比值,且对‘雪美’的作用大于‘玉皇’;（3）盐胁迫处理3 d时,2个甜瓜品种根系的抗坏血酸过氧化物酶（APX）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）、谷胱甘肽还原酶（GR）活性均下降,且‘雪美’下降的幅度较大;随着胁迫时间的延长（5 d时）,‘玉皇’幼苗根系内APX、DHAR、GR活性有所上升,‘雪美’根系中这3种酶活性则进一步降低;（4）盐胁迫下,施用外源脯氨酸提高了2个甜瓜品种根系内的APX、DHAR和GR的酶活性,且对‘雪美’的作用大于‘玉皇’。本研究结果表明,外源脯氨酸可以通过增加非酶促抗氧化物质ASA、GSH的含量和抗氧化酶活性,提高抗坏血酸-谷胱甘肽循环清除活性氧的能力,从而缓解盐胁迫对甜瓜植株的伤害。     

Intra-tumor heterogeneity of MLH1 promoter methylation revealed by deep single molecule bisulfite sequencing

A single tumor may contain cells with different somatic mutations. By characterizing this genetic heterogeneity within tumors, advances have been made in the prognosis, treatment and understanding of tumorigenesis. In contrast, the extent of epigenetic intra-tumor heterogeneity and how it influences tumor biology is under-explored. We have characterized epigenetic heterogeneity within individual tumors using next-generation sequencing. We used deep single molecule bisulfite sequencing and sample-specific DNA barcodes to determine the spectrum of MLH1 promoter methylation across an average of 1000 molecules in each of 33 individual samples in parallel, including endometrial cancer, matched blood and normal endometrium. This first glimpse, deep into each tumor, revealed unexpectedly heterogeneous patterns of methylation at the MLH1 promoter within a subset of endometrial tumors. This high-resolution analysis allowed us to measure the clonality of methylation in individual tumors and gain insight into the accumulation of aberrant promoter methylation on both alleles during tumorigenesis.     

镧对镉胁迫下大蒜幼苗生长及镉积累的影响

采用土培实验研究了镧(La²⁺)对镉(Cd)胁迫下大蒜幼苗生长及Cd积累的影响。结果表明：低浓度Cd（＜5 mg·kg^-1）对大蒜生长有微弱的促进作用而高浓度Cd对其有明显抑制作用。外施系列浓度La²⁺对高浓度Cd胁迫下大蒜幼苗生长具有明显的缓解效应,单株鲜重、干重、根长及地上部分高度均具有明显或不同程度的增加。测定结果表明,Cd主要积累在大蒜根部而向地上部分转运的较少,外施系列浓度La²⁺对高浓度Cd胁迫下大蒜幼苗根系对Cd积累具有显著的抑制效应,同时也抑制Cd向地上部分转运。从外施La²⁺对高浓度Cd胁迫下大蒜幼苗生长及大蒜对Cd积累情况来看,La²⁺的适宜缓解效应浓度是在Cd浓度为20 mg·kg^-1时,La²⁺浓度为10～15 mg·kg^-1;在Cd浓度为40 mg·kg^-1,La²⁺浓度为5 mg·kg^-1。     

中国莲（Nelumbo nucifera）幼苗抗氧化系统对砷胁迫的响应

为了研究中国莲（Nelumbo nucifera）抗氧化系统对砷胁迫的响应,研究比较了两种不同价态无机砷As（Ⅲ）和砷As（V）对中国莲幼苗可溶性蛋白含量、丙二醛（MDA）含量以及抗氧化系统的影响。结果表明,中国莲幼苗中MDA和可溶性蛋白质含量随砷浓度的增加呈现先升高后降低的趋势。中国莲幼苗的MDA和蛋白质含量受As（V）的影响不如As（11]）敏感。抗氧化系统酶中,超氧化物歧化酶（SOD）对砷处理最敏感,当As（11I）浓度在2．5pmol／L和As（V）浓度在100μmol／L时,SOD酶活性显著高于对照组。过氧化物酶（POD）在As（Ⅲ）处理浓度为10umol／L时就出现显著上升,相对而言,过氧化氢酶（CAT）对As（V）比较敏感。实验结果表明,随着浓度的增加,砷对幼苗产生的氧化胁迫导致SOD、CAT和POD三种酶活性有所增加,以配合清除细胞内的活性氧自由基（ROS）,维持细胞代谢的稳定。本研究为进一步研究砷胁迫下莲的生理和生长变化、以及莲的培育和移植提供了部分基础数据。