二色补血草LbDREB基因在酵母中的抗逆性分析

利用酵母表达系统研究了二色补血草的DREB基因（LbDREB）对不同胁迫的抗性。将LbDREB构建到酵母表达载体pYES2中,转化到酿酒酵母INVSc1菌株中,并以转空pYES2质粒的酵母INVSc1（pYES2）作为对照,通过比较两种酵母在不同胁迫下的存活率来研究LbDREB基因对NaCl、KH_2PO_4、Na_2CO_3、NaHCO_3、低温、干旱、CuSO_4和CdCl_2胁迫的抗性。结果表明,LbDREB转化的酵母在各种胁迫下的存活率均明显高于转空pYES2的对照酵母,说明LbDREB基因除了具有传统认为的抗旱、耐盐、抗寒的作用外,还具有抗KH_2PO_4、Na_2CO_3、NaHCO_3、CuSO_4和CdCl_2等胁迫的能力。     

二色补血草液泡膜H^＋-ATP酶C亚基（LbVHA-C）基因克隆和表达分析

从二色补血草cDNA文库中分离出一个V-H^＋-ATP酶C亚基（LbVHA-C）基因全长cDNA序列。该基因全长为729bp。其中,开放读码框（ORF）为498bp,编码165个氨基酸,预测编码蛋白的分子量为16.6kDa,理论等电点为8.62。用实时定量RT-PCR方法进一步研究二色补血草在NaCl、NaHCO3和NaCO3胁迫下的不同时间内该基因表达模式的结果表明,NaCl强烈诱导二色补血草叶组织中LbVHA-C基因的表达,但其根部的表达变化不明显。NaHCO3胁迫下LbVHA-C基因在根部组织的表达受抑制。Na2CO3胁迫24h时的LbVHA-C基因在根和叶部组织中的表达都强烈受抑制,随后在根和叶组织的表达量逐步升高。     

二色补血草硫氧还蛋白(Trx)的克隆和表达分析

从二色补血草cDNA文库中分离出1个硫氧还蛋白基因全长cDNA序列。基因全长1138bp,其中,5’非翻译（UTR）区128bp,3＇非翻译区212bp,开放阅读框（ORF）全长798bp,编码265个氨基酸,编码蛋白的分子量为28．58kDa,理论等电点（pI）为9．68。BlastP分析表明二色补血草Trx与拟南芥Trx序列同源性为52％,与葡萄7h序列同源性为76％,从11个物种的氨基酸多序列比对可以看出Trx氨基酸序列保守性较高。实时定量RT-PCR方法检测低温、NaCl和PEG胁迫不同时间后的基因在二色补血草中表达模式的结果表明,NaCl能诱导Trx基因在二色补血草叶中表达,胁迫24h后达到高峰,而聚乙二醇和低温处理则抑制Trx在二色补血草根和叶的表达。     

二色补血草OEE2基因的克隆和表达

从二色补血草中分离出一条含有完整开放读码框（ORF）序列的OEE2基因。该基因全长994bp,其中5’非翻译区27bp,3’非翻译区160bp,ORF全长807bp,共编码264个氨基酸,编码蛋白的分子量为28．2kDa,理论上的等电点为7．66。BlastP分析表叽二色补血草OEE2与马铃薯OEE2序列同源性最高,与喇叭水仙OEE2序列同源性最低,从9个物种的氨基酸多序列比对中可以看出,OEE2的氨基酸序列保守性较高。实时定量RT．PCR方法检测该基因对低温、NaCl和聚乙二醇（PEG）胁迫的基因表达模式的结果表明,PEG和低温能诱导OEE2基因在二色补血草叶中表达,这两种处理的OEE2基因表达量于胁迫48h后都达到高峰,而在NaCl胁迫下OEE2在二色补血草根和叶中表达都受抑制。     

向日葵转录因子HB-12的定位分析及过表达验证

向日葵转录因子HB-12属于HD-Zip I类转录因子家族,在植物逆境胁迫应答中发挥着极其重要的作用。该研究构建HB-12基因瞬时表达载体并进行亚细胞定位分析,表明HB-12基因定位于细胞核。构建HB-12基因植物超表达载体转化野生型烟草获得了转基因植株。进行了Na Cl胁迫对转基因烟草耐盐性检测、生理生化指标测定和胁迫相关基因的表达分析。结果表明,Na Cl胁迫条件下,转基因烟草叶色失绿程度较野生型的轻,分化情况较野生型的好,生长速度和生根率均较野生型的高;转基因烟草叶绿素和脯氨酸含量及POD和SOD活性均高于野生型烟草;与野生型烟草相比,转基因烟草P5CS、POD、Mn SOD和Gu Zn SOD相对表达水平显著提高。这说明,向日葵HB-12在转基因烟草中的过量表达可抑制叶绿素降解酶的活性,降低叶绿素的分解,还可诱导脯氨酸合成酶基因P5CS及抗氧化相关基因POD、Mn SOD和Gu Zn SOD的上调表达,促进脯氨酸的生物合成,增强POD和SOD的活性,提高烟草抵抗盐害的能力。该研究结果将为进一步探讨植物的耐盐机理及改良作物的耐盐性状奠定基础。     

不同阴离子对二色补血草盐腺Na＋分泌速率的影响

本文以二色补血草（Limonium bicolor）为实验材料,用Hoagland营养液和200mmol·L—NaCl、NaBr、NaNO3溶液分别处理12h,测定二色补血草盐腺的Na＋分泌速率、叶片Na＋含量和MDA（丙二醛）含量以及质膜透性,并利用非损伤微测技术探索可能与盐腺相关的转运蛋白,以探讨不同阴离子对二色补血草盐腺分泌Na＋的作用及其可能原因。结果表明：在NaCl处理12h时二色补血草叶片Na＋分泌速率达到最大,然后逐渐下降;不同钠盐处理下叶片Na＋分泌速率为NaCl〉NaBr=NaNO3〉Hoagland,而叶片Na＋含量NaBr〉NaCl〉NaNO3〉Hoagland;不同盐处理下叶片质膜透性和MDA含量无显著性差异;利用Na—K—C1共转运体专一性抑制剂bumetanide处理发现Na＋分泌速率显著降低。这些结果表明Na—K—Cl共转运体可能参与盐腺分泌Na＋。     

过量表达星星革PtSOS1提高拟南芥的耐盐性

将星星草中分离的质膜型Na^＋／H^＋逆向转运蛋白基因PtSOSJ（GenBank登录号EF440291）构建到pGWB2植物表达载体上,转化拟南芥,获得抗卡那霉素的抗性植株。PCR和Northem检测表明,PtSOS1已整合到拟南芥基因组中并过量表达。耐盐性实验表明,PtSOS1过量表达提高了拟南芥植株的耐盐性。盐分测定表明,盐胁迫下PtSOS1转基因植株中Na^＋积累低于野生型的,K^＋含量则高于野生型的,转基因植株中K^＋／Na^＋比值高于野生型。     

异源表达AtCYSa基因烟草的耐盐和抗虫特性分析

植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂在植物防御生物与非生物胁迫过程中发挥着重要的作用。拟南芥中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂AtCYSa基因的表达能够受到多种胁迫的诱导,且在拟南芥中过量表达AtCYSa基因可以增强转基因拟南芥抵御盐、干旱和氧化等非生物胁迫的能力。为了进一步探究AtCYSa基因的功能以及在烟草中的应用,构建了植物表达载体pCAMBIA 1302-AtCYSa。通过PCR以及RT-PCR验证共获得4株阳性转基因烟草,选择其中3株转基因烟草进行盐胁迫处理和抗虫活性实验。在盐胁迫处理中,100mmol/L NaCl和200mmol/L NaCl处理组的丙二醛含量显著低于野生型对照组。伊文思蓝染色和细胞相对活性结果表明,转基因烟草的细胞活性比野生型烟草明显偏高。这说明在盐胁迫处理下,AtCYSa基因的表达能够起到保护转基因烟草的作用。抗虫活性研究发现,实验组的幼虫总重均呈明显的下降趋势,且幼虫死亡率显著高于对照组。这些结果表明,AtCYSa基因在烟草中的过量表达能够增强转基因烟草的耐盐以及抗虫的能力。     

二色补血草的耐盐性研究

通过NaCl胁迫发芽试验、盆栽浇灌NaCl盐水试验、不同含盐量土壤的种植试验,研究二色补血草（Limoniumbicolor）3个时期的耐盐能力。结果表明：高浓度NaCl对二色补血草种子的萌发有明显的抑制作用,种子的发芽率与盐浓度之间呈显著的负相关,种子萌发时盐胁迫的适宜值、临界值、极限值分别是0.49%、1.30%、2.11%;盆栽试验结果表明,二色补血草在2.0%以下的NaCl盐水胁迫下没有表现明显的盐害症状,只表现高浓度NaCl胁迫下,生长量低于低浓度处理的,当处理浓度达到2.4%时,多数植株濒临死亡;不同含盐量土壤的种植试验结果表明,在自然条件下,二色补血草成株耐盐临界值为1.7%～1.8%。试验结果说明二色补血草具有较强的耐盐能力,适合在滩涂盐碱地推广种植。     

红梨PybHLH基因过表达提高烟草NaCl抗性的研究

为探究过表达云南红梨bHLH转录因子对烟草抗盐性的影响,从红梨红色果皮中分离了bHLH转录因子基因PybHLH.亚细胞定位表明PybHLH蛋白定位于细胞核.以转基因PybHLH烟草和野生型烟草为材料,进行了NaCl胁迫对转基因PybHLH烟草生理生化影响研究及其相关酶基因的表达分析.表明PybHLH转基因烟草具有一定的耐盐性,一方面表现为随着盐胁迫时间延长,PybHLH转基因烟草中总可溶性糖、可溶性总蛋白和游离脯氨酸含量的增加,H2O2含量降低;另一方面表现为脯氨酸生物合成关键酶基因P5CS、抗氧化相关基因MnSOD、CuZn-SOD和POD、胁迫相关基因HSP和HSP cherpron和ABA抗盐信号途径基因NAC等均呈上调表达趋势.PybHLH的过表达提高了烟草的耐盐性,这将为进一步研究植物的耐盐机制及耐盐植物新品种的开发奠定基础.     

Arabidopsis mutants deregulated in RCI2A expression reveal new signaling pathways in abiotic stress responses

To uncover new pathways involved in low-temperature signal transduction, we screened for mutants altered in cold-induced expression of RCI2A, an Arabidopsis gene that is not a member of the CBF/DREB1 regulon and is induced not only by low temperature but also by abscisic acid (ABA), dehydration (DH) and NaCl. This was accomplished by generating a line of Arabidopsis carrying a transgene consisting of the RCI2A promoter fused to the firefly luciferase coding sequence. A number of mutants showing low or high RCI2A expression in response to low temperature were identified. These mutants also displayed deregulated RCI2A expression in response to ABA, DH or NaCl. Interestingly, however, they were not altered in stress-induced expression of RD29A, a CBF/DREB1-target gene, suggesting that the mutations affect signaling intermediates of CBF/DREB1-independent regulatory pathways. Several mutants showed alterations in their tolerance to freezing, DH or salt stress, as well as in their ABA sensitivity, which indicates that the signaling intermediates defined by the corresponding mutations play an important role in Arabidopsis tolerance to abiotic stresses. Based on the mutants identified, we discuss the involvement of CBF/DREB1-independent pathways in modulating stress signaling.     

Heterologous expression of the AtDREB1A gene in chrysanthemum increases drought and salt stress tolerance

DNA cassette containing an AtDREB1A cDNA and a nos terminator, driven by a cauliflower mosaic 35S promoter, or a stress-inducible rd29A promoter, was transformed into the ground cover chrysanthemum (Dendranthema grandiflorum) ‘Fall Color’ genome. Compared with wild type plants, severe growth retardation was observed in 35S:DREB1A plants, but not in rd29A:DREB1A plants. RT-PCR analysis revealed that, under stress conditions, the DREB1A gene was over-expressed constitutively in 35S:DREB1A plants, but was over-expressed inductively in rd29A:DREB1A plants. The transgenic plants exhibited tolerance to drought and salt stress, and the tolerance was significantly stronger in rd29A:DREB1A plants than in 35S:DREB1A plants. Proline content and SOD activity were increased inductively in rd29A:DREB1A plants than in 35S:DREB1A plants under stress conditions. These results indicate that heterologous AtDREB1A can confer drought and salt tolerance in transgenic chrysanthemum, and improvement of the stress tolerance may be related to enhancement of proline content and SOD activity.