电转移中蛋白质的透膜现象及其对蛋白质印迹结果的影响

探讨了电转移中蛋白质的透膜现象及其对蛋白质印迹结果的影响.采用抗凋亡抑制蛋白-Survivin的抗体,对细胞裂解液进行蛋白质印迹.与常规操作方法不同之处是：在电转移的凝胶“三明治”中,重叠放置两张硝酸纤维素膜.电转移后,对两张膜同时进行免疫印迹.在特定的转移条件下,两张膜的免疫印迹都出现了Survivin蛋白的特异印迹带,证实了电转移中存在着蛋白质的透膜现象.转移时间、电流强度和蛋白质的分子质量,都是影响蛋白质透膜的相关因素.电转移中蛋白质的透膜,可以产生“印迹复制失真”的效应,从而最终影响蛋白质印迹定性和定量的结果.所得实验结果和结论,揭示了蛋白质印迹技术方法学中一个需要加以充分关注的问题,对于科学掌握和应用该技术具有积极作用.     

转移缓冲液对蛋白质印迹的影响

利用三种转移缓冲液,分别以半干和湿转法,检测癌基因产物Bcl-2, 并获得不同强度的印迹结果.不含SDS的转移缓冲液转移效果明显优于含SDS的转移缓冲液,且SDS含量越高印迹带越弱;此外,半干转移与湿转相比,可大大缩短转移时间,但转移效果不及湿转理想且稳定性较差.     

Western blot免疫印迹法检测磷酸化蛋白表达条件优化研究

目的:探讨Western blot免疫印迹法不同转膜方法和不同抗原抗体比例对磷酸化蛋白表达的检测效果。方法:选择肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)及其磷酸化蛋白作为研究对象,比较半干转印法、湿转法和1:3000、1:5000、1:10000等抗体稀释比例对磷酸化蛋白检测效果的影响。结果:半干转印法(恒压16V,30 min)观察到蛋白信号断续;而同样样品利用湿转法(恒压130 V,1h)检测发现信号连续且强度明显增高;对于磷酸化蛋白,半干转印法无法观察到磷酸化蛋白信号;而同样样品湿转法检测出现连续信号。统一利用湿转方法进行后续蛋白磷酸化检测,当抗体稀释比为1:3000时,结果出现非特异性条带;降低抗体稀释比为1:5000时无非特异性条带,且蛋白信号效果较好;抗体稀释比为1:10000时条带图像出现弥散且背景较高。结论:选择合适的转膜方式和抗原抗体比例有助于磷酸化蛋白表达检测。     

用于免疫印迹法的生物素化标准分子量蛋白质的制备

免疫印迹技术目前已被广泛应用。确定抗原分子量通常使用标准分子量蛋白平行电泳并转移至NC膜,切下相应条带用氨基黑等染料染色,不但费时,敏感性低,而且在染色和脱色时易引起NC膜的皱缩。1986年Della-Penna等报告用生物素化蛋白作为蛋白质印迹(Western blots)的分子量标准品。目前国外已有商品出售,但价格较贵。本文利用国产低分子量标准蛋白质和自制N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯制备生物素化蛋白取得满意结果。     

Western印迹中蛋白质定量分析的替代方法

Western印迹广泛采用显像密度计法对特异性蛋白质表达进行定量,但是仍然存在敏感性的问题尚未解决。同时,昂贵的试剂与复杂的设备限制了其应用。建立了一种改良定量检测法,使用碱性磷酸酶标记的第二抗体,以萘酚磷酸盐和快红作反应底物。吸附膜上的终末显色用有机溶剂洗脱,通过测定光吸收值定量。结果显示该法更简便、快速、经济而不失其敏感性。     

蛋白质复性的条件及影响因素

蛋白质复性是一个过程,存在中间阶段,此阶段的各种相互作用力决定了蛋白质能否复性。蛋白质复性要求有一定的条件,如pH、温度、离子强度、蛋白质浓度等。另外多种添加剂能促进蛋白质复性,其中包括表面活性剂、低浓度变性剂、分子伴侣蛋白和各种氧化还原对,但对于不同蛋白质,因其结构及理化特性不同,采取不同复性方法,可以使其达到最佳复性效果。     

高灵敏的蛋白质免疫印迹新方法用于β-淀粉样蛋白检测

目的:对抗体进行改进,降低传统蛋白质免疫印迹方法的检出限。方法:在传统蛋白质免疫印迹方法的基础上,将一抗和二抗分别与纳米金和氧化石墨烯结合,以提高其对痕量样本的检测灵敏度,降低检测限。结果:优化后的方法对β-淀粉样蛋白的检测限从原来的432 pg/mL降低至16 pg/mL,为原来的1/27。结论:改进后的蛋白质免疫印迹新方法性能稳定,重复性好,可用于生物样本中痕量被检测物的测定。     

低浓度多聚甲醛固定对蛋白免疫印迹技术的改良

蛋白质免疫印迹（protein immunoblot,或Western blot）是一种广泛应用于检测细胞或组织蛋白质表达及蛋白质翻译后修饰的方法．前期的研究发现,使用低浓度（0.4%）多聚甲醛在蛋白质免疫印迹封闭环节前做膜固定,有助于提高蛋白质的检测效果．本文通过设置多聚甲醛的不同浓度和固定时间,进一步探索其在蛋白质免疫印迹技术中的应用．结果发现,低浓度（≤0.4%）多聚甲醛处理30 min,能明显提升蛋白质的检测效率．通过检测不同大小蛋白质的固定效果发现,大分子量的蛋白质使用多聚甲醛固定效果不明显,中等分子量和小分子量的蛋白质的固定效果较佳．综上研究表明,在中等或小分子量的蛋白质免疫印迹检测中,封闭环节前加入低浓度多聚甲醛固定,可以提高蛋白质的检测效果．     

用蛋白质印迹转移技术分析正常及硒性白内障大鼠晶状体及房水中蛋白质的性质

本文用蛋白质印迹转移技术分析了正常及硒性白内障大鼠晶状体及房水中蛋白质的性质。结果表明,晶状体中的脲溶性蛋白质可被抗α及抗γ晶体蛋白血清识别,提示α及γ晶体蛋白均为脲溶性蛋白质的主要成份。患白内障时房水中的蛋白质含量明显增加,且主要被抗γ血清识别,而被抗α血清识别的成份很少,表明在大鼠硒性白内障形成过程中,有较多低分子量蛋白质漏出到房水中,且其主要成份为γ晶体蛋白。此外,我们还发现正常及硒性白内障大鼠晶状体膜蛋白质与抗α及抗γ血清起反应的程度及分布有所不同,提示晶状体细胞膜与晶体蛋白之间存在着相互作用。     

Electrophoretic transfer of proteins from fixed and stained gels

A procedure by which sodium dodecyl sulfate gels can be fixed and stained with Coomassie blue and subsequently transferred to nitrocellulose for immunostaining is outlined. The procedure involves the complete removal of the stain followed by equilibration of the gel in sodium dodecyl sulfate running buffer. The efficiency of transfer is comparable to unfixed gels and the protein pattern of the transfer appears to be sharper, presumably due to less diffusion during the transfer process. The procedure does not affect the antigenicity of the proteins that have been examined by subsequent immunostaining. This method is particularly useful for situations in which sample size or concentration are limiting factors resulting in insufficient material for duplicate gels.     

Problems with Multiple Use of Transfer Buffer in Protein Electrophoretic Transfer

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) and SDS-PAGE are the two most useful methods in protein separation. Proteins separated by 2DE or SDS-PAGE are usually transferred to membranes using a variety of methods, such as electrophoretic transfer, heat-mediated transfer, or nonelectrophoretic transfer, for specific protein detection and/or analysis. In a recent study, Pettegrew et al.¹ claim to reuse transfer buffer containing methanol for at least five times for transferring proteins from SDS-PAGE to polyvinylidene difluoride. They add 150–200 ml fresh transfer solution each time for extended use as a result of loss of transfer buffer. Finally, they test efficiency of each protein transfer by chemiluminescence detection. Here, we comment on this report, as we believe this method is not accurate and useful for protein analysis, and it can cause background binding as well as inaccurate protein analysis.     

蛋白免疫印迹法检测小分子蛋白的实验条件优化研究

目的:蛋白免疫印迹法自发明以来被广泛应用于现代生物学研究中的蛋白质定性和半定量分析。为了提高蛋白免疫印迹法的检测效率,需针对不同蛋白的特性调节相关的实验条件参数。本文旨在探讨免疫印迹法不同参数对小分子蛋白检测效果的影响,从而优化并获得最佳实验条件。方法:比较不同转膜电压和时间、转移缓冲液甲醇含量、不同化学发光剂对小分子蛋白的检测效果。结果:选择20 V、10 min转膜电压和时间所获得的信号显著高于10 V、25 min转膜条件,选择含20%甲醇转移缓冲液所获得的信号显著高于无甲醇转移缓冲液,选择飞克级化学发光剂所获得的信号显著高于纳克级化学发光剂。结论:选用高电压、短时间组合,选择含20%甲醇转移缓冲液和飞克级化学发光剂信号均有助于小分子蛋白免疫印迹检测。     

棉铃虫围食膜蛋白的电泳分离技术

比较了棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)围食膜不同处理方法,不同围食膜数量,在不同电泳下的分离效果,筛选最佳的围食膜蛋白分离技术。结果表明:冷冻干燥与非冷冻干燥处理围食膜后进行SDS-PAGE电泳分离效果基本相同,建议使用冷冻干燥后处理较好。取1、3、5条围食膜进行SDS-PAGE电泳,都能将围食膜蛋白分离,且分离效果基本一致,建议5条围食膜最合适,具有可靠性和代表性。浓缩胶为5%、分离胶分别为8%、10%和12%时棉铃虫围食膜的SDS-PAGE电泳分离效果差异不大,而分离胶为12%时效果较好。无水三氟利克酸处理围食膜后进行NuPAGE电泳,分离出的围食膜蛋白大约30多种,远远超过上述方法分离的16²0种,且需要的围食膜材料少,分离效果最佳,但费用高。     

生物信息学预测与实验验证相结合策略筛选鉴定新的人分泌蛋白基因

使用生物信息学预测结合实验验证的策略筛选鉴定人新的分泌蛋白基因。用SignalP、SOSUI、PSORT和BLAST等程序对UniProt蛋白数据库进行生物信息学分析 ,筛选出用于实验验证的 1 4个功能未知基因。采用RT PCR方法 ,克隆得到 1 4个基因的全长编码序列 ,并构建到真核表达载体pcDNA3.1 ( - ) Myc His质粒。采用蛋白质印迹与免疫荧光分析 ,检测到其中 7个基因的表达。除其中一个在细胞核表达外 ,其余 6个只在细胞质中表达 ;其中的 4个基因的表达产物在细胞培养液中可被检测到 ,鉴定为 4个新的分泌蛋白基因。     

Changes in Electrophoretic Patterns of Oocyte Proteins during Oocyte Maturation in Oryzias latipes

Changes in the two-dimensional SDS-electrophoretic patterns of extracts of maturing denuded oocytes of the medaka ( Oryzias latipes ) were surveyed. In oocytes without follicular constituents several proteins became detectable in the area between the acidic and slightly basic proteins on the two-dimensional electrophoretograms, while a few of the protein spots disappeared during the process of oocyte maturation. The former proteins were detected also in oocytes that were induced to mature in vivo without breakdown of the germinal vesicle. Several proteins newly observed in extracts of post-vitellogenic oocytes during maturation after breakdown of the germinal vesicle were also identified by two-dimensional electrophoresis. Of several proteins that exhibited noticeable changes in maturing oocytes, only one spot incorporated ¹⁴C-labeled amino acid during maturation, suggesting that post-translational modification of many proteins occurred during oocyte maturation.     

山羊精子介导法转染外源基因影响因素及最适条件的研究

探讨山羊精子与外源DNA共孵育转染外源DNA效率的影响因素,优化精子转染程序.用DIG免疫组化方法检测和比较精子转染效率,因素为精子洗涤程度、转染缓冲液、精予活力、BSA、肝素、异种动物精浆等.离心洗涤3次以内的山羊精子DNase Ⅰ消化前、后阳性率随洗涤次数增加而显著增加(P＜0.05),而离心3次以上的转染效率略有下降;以mDM为共孵育缓冲体系可获得较高的转染效率;活力为0.55的精子转基因阳性率显著低于活力为0.9的精子(消化前、后阳性率分别为35.4±2.9%和21.8±5.3% vs 63.5±7.2%和50.3±2.8%,P＜0.os);共孵育体系中异种动物精浆可显著降低转染效率(P＜0.01),甚至与肝素可置换出已结合和内化转运到精子内的外源DNA,而共孵育体系中的BSA可抑制精子内化外源DNA.山羊共孵育法转染外源基因最适转染条件为mDM缓冲液洗涤3次后上浮收集高活力精子进行转染.     

Development of buffers for fast semidry transfer of proteins

Western blot is an extensively used method for protein detection in cell biology. To optimize this procedure, here we examined a panel of buffers for their ability to efficiently transfer proteins from SDS–polyacrylamide gels onto nitrocellulose membranes in a short 12-min period, designated here as fast semidry transfer. Our results show for the first time that HEPES- and HEPPS/EPPS-based buffers represent the most efficient buffers for fast semidry transfer.