黑曲霉(Aspergillus niger) Uγ-2菊粉酶保护剂的研究*

研究菊粉酶热稳定性,菊粉酶在60℃具有较好的热稳定性;一些醇类物质和增稠剂可以提高菊粉酶的热稳定性;利用甘油、黄原胶和CaCl₂设计三因素三水平的正交试验,确定了以6%的甘油,0·6%的黄原胶,100mmol/L的CaCl₂组合的保护剂,对提高酶的热稳定性具有显著作用。     

Addition of protective agents for enhancing storage stabilization of alkaline polygalacturonate lyase

保藏稳定性对于商品酶具有重要的实际意义.通过对碱性果胶酶的保护剂进行研究,最终筛选得到最优复合保护剂配方为:Tween 20 1 mL/L,六偏磷酸钠1.5g/L,明胶5g/L,甘油5％(v/v),CaCl2 2 g/L;热稳定性提高18倍.此外在常温保藏时,在酶液中添加0.3‰山梨酸钾和0.3‰苯甲酸钠,能有效提高保藏效果,减少酶液染菌、混浊和发臭,最终常温保藏90d后酶活保留率为84.5％,达到工业化保藏的要求.     

化学添加剂提高重组α-环糊精葡萄糖基转移酶酶制剂稳定性

通过向重组α-环糊精葡萄糖基转移酶 (α-CGT酶) 液中添加化学添加剂以提高其热稳定性及贮存稳定性。在不同温度下研究了添加剂对酶液的贮存稳定性影响,并用圆二色谱 (CD) 研究了CGT酶在近紫外区和远紫外区蛋白质结构与热稳定性的变化关系。当单独加入各种添加剂在50 ℃水浴1 h和室温放置108 d后,发现含有20％甘油的酶液稳定性最好,与未加任何添加剂的对照酶液相比仍有91％和50％的酶活,对照酶液在50 ℃水浴1 h后仅有小于10％的活性,室温放置108 d后已经没有酶活。明胶、CaCl2和PEG40     

添加保护剂促进碱性果胶酶的工业保藏稳定性

保藏稳定性对于商品酶具有重要的实际意义。通过对碱性果胶酶的保护剂进行研究,最终筛选得到最优复合保护剂配方为：Tween201mL／L,六偏磷酸钠1．5g／L,明胶5g／L,甘油5％（口～）,CaCl22g／L;热稳定性提高18倍。此外在常温保藏时,在酶液中添加0．3‰山梨酸钾和0．3‰苯甲酸钠,能有效提高保藏效果,减少酶液染茵、混浊和发臭,最终常温保藏90d后酶活保留率为84．5％,达到工业化保藏的要求。     

内切型菊粉酶生产菌株的筛选及诱变选育

采用透明圈法筛选得到了产菊粉酶的多株菌株,并得到了1株产内切型菊粉酶较高的隐球酵母属（Cryptococcus)菌株L1,以L1作为出发菌株经Co^60诱变后,得到1株产内切型菊粉酶最好菌株C10,其诱变后低聚果糖得率比诱变前提高了52．6％,酶活力提高了51．9％。     

一步法发酵菊芋产乙醇菌种的筛选及产酶条件、酶学性质的研究

从腐烂的菊芋及实验室保存的菌种中,选育到一株发酵菊芋产乙醇的菌株克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus Y1。利用正交实验法对克鲁维酵母产菊粉酶的培养基组成及培养条件进行优化,确定培养基组成（g/L）为：菊粉40,酵母粉4,蛋白胨4,尿素1;初始pH5．0,温度30℃,150r／min条件下培养达到最佳产酶效果（57U／mL）。该菌株所产菊粉酶的性质测定结果表明：以菊粉为底物,该菊粉酶最适反应温度为55℃,在60℃以下稳定性很好,高于60℃时酶迅速失活;最适pH为5．0,pH4．6—5．2范围内酶稳定性很好;该酶属于外切型菊粉酶,体积分数为8％的乙醇对酶活力基本没有影响。     

菊粉酶基因的异源表达、分离纯化及酶学性质

为进一步提高菊粉酶在生物技术领域的应用,研究了来源于马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus YX01的菊粉酶性质。通过在毕赤酵母GS115宿主细胞中异源表达该菊粉酶基因(inu),获得了一种外切型菊粉酶,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证其分子量为86.0 k Da。进一步在该菊粉酶上增加6个His标签,采用聚乙二醇(PEG)20 000透析浓缩和Ni-NTA Agarose静态亲和吸附作用的方法,完成菊粉酶的分离纯化,纯化倍数和酶回收率分别为3.6和33.1%。比较发现粗酶液与纯酶的酶学性质相似,且菊粉酶的最适反应温度为60℃,最适p H值为4.62,并测得该酶的Km和Vmax值,以菊粉为底物时,Km和Vmax值分别为80.53 g/L和4.49 g/(L·min);以蔗糖底物时,Km和Vmax值分别为183.10 g/L和20.20 g/(L·min)。金属离子Mn2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+和Fe2+对酶活力具有不同程度的抑制作用,其中Cu2+、Zn2+和Fe2+的抑制作用最为显著。这些研究为进一步提高菊粉酶在工业化的应用奠定了基础。     

黑曲霉产菊粉酶的发酵条件优化及诱变育种

对1株黑曲霉产菊粉酶的发酵条件进行了研究,确定了优化的发酵条件为菊粉2%,酵母膏2%,(NH4)H2PO40 5%,Na Cl0 5%,MgSO4·7H2O0 05%,ZnSO4·7H2O0 01%,初始pH6 5,接种量1 6%,装液量30ml,发酵5d,菊粉酶活最高可达26U/ml,I/S为1 15。经Co60诱变筛选出1株突变株C-32,在相同的发酵条件下菊粉酶活提高30%,I/S不变。     

内切酶法制取菊苣低聚果糖工艺条件的研究

目的:利用毕赤嗜甲醇酵母表达的重组黑曲霉菊粉内切酶,从菊苣菊粉中制取低聚果糖。方法:用重组黑曲霉菊粉内切酶酶解水提菊粉,用薄层色谱、离子色谱分析酶解产物,研究酶解条件,分析产物组成。结果与结论:菊粉浓度为20～160g/L、酶浓度为12U/g菊粉时,低聚果糖的最大产率逐渐升高然后下降;在接近最大溶解度200g/L时,菊粉寡糖最大产率为62.0%,最大产率与酶的用量无关,但提高酶的浓度可以缩短达到最大产率的时间。pH5.5、50℃、菊粉浓度为40g/L、酶用量为12U/g菊粉时,可达到最大产率64.6%;酶解的产物主要为GF2到GF10的菊粉寡糖。     

黑曲霉M89菊粉酶的提纯与性质

黑曲霉(Aspergillusniger）M89菊粉酶经硫酸铵分级盐析、SephadexG-200凝胶过滤、DEAE-纤维素离子交换层析、聚丙烯酞胺凝胶电泳（PAGE）制备分离,提纯到4个菊粉酶组分EⅠ、EⅡ、EⅢ和EⅣ。用SDS-PAGE测定分子量分别为102．6、97．9、61．2和36．5kD;用等电聚焦电泳测得其等电点分别为4．15、4．24、4．48和4．15。4个组分的最适反应温度均为55～60℃;EⅠ的最适pH为pH4．0,其余3个组分为pH4．5．各组分的热稳定性有一定差异,分子量越小的组分,热稳定性越好,55℃处理90min,EⅠ有一定的热失活,其余3个组分无活力丧失,4个组分都是外切酶。     

克鲁维酵母Y-85菊粉酶的纯化和性质

克鲁维酵母(Kluyveromyces sp.)Y-85产生的胞内菊粉酶(endocellular inulinase)和胞外菊粉酶(exocellular inulinase)粗酶液分别经PEG6000-磷酸盐缓冲液双水相抽提得部分纯化酶液。前者进一步用硫酸铵分级沉淀、Protein-PAK DEAE离子交换、Protein-PAK200SW凝胶过滤后得到两个菊粉酶组分EⅠ和EⅡ;后者采用DEAE-Sephacel离子交换、Sephadex G150凝胶过滤后得到菊粉酶Eexo。经Waters 650E蛋白纯化系统鉴定,三者均呈单一的对称峰;EⅠ和EⅡ达聚丙烯酰胺盘状凝胶电泳纯。EⅠ、EⅡ和Eexo的分子量分别为42kD、65kD和57kD;三者均为糖蛋白,多糖含量分别为30％、35％和25％;I/S(Inulinaseactivity/Sucrase activity)比值分别为0.086、0.078和0.072;三者均属外切菊粉酶。EⅠ、EⅡ和Eexo酶反应最适pH分别为4.6、4.5和4.6,最适温度分别为52℃、52℃和55℃;Ag^+、Hg^(2+)和PCMB对酶活性有强烈的抑制作用;三者水解菊芋粉糖液的产物均为果糖(86.5％)和葡萄糖(13.5％)。     

菊粉酶产生菌的筛选及60Co诱变选育简

目的：从新疆石河子盐碱地菊芋生长根际土壤中分离筛选高产菊粉酶活力菌株。方法：通过稀释平板涂布法分离微生物;利用^60Co诱变选育,96孔板筛选突变菌株;采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定菊粉酶酶活。结果：分离到12株具有菊粉酶活力的菌株,复筛得到1株高产菊粉酶活力菌株,将其命名为G-60;以此菌株为出发菌株进行^60Co诱变,利用96孔板对诱变菌株进行筛选,经摇瓶发酵酶活测定,得到1株高产菊粉酶酶活的突变株,酶活达46．62U/mL,是未诱变菌株酶活的2．72倍。结论：经诱变得到1株高产菊粉酶活力的突变菌株。     

克鲁维酵母Y-85菊粉酶的纯化和性质

克鲁维酵母(Kluyveromyces sp.)Y-85产生的胞内菊粉酶(endocellular inulinase)和胞外菊粉酶(exocellular inulinase)粗酶液分别经PEG6000-磷酸盐缓冲液双水相抽提得部分纯化酶液。前者进一步用硫酸铵分级沉淀、Protein-PAK DEAE离子交换、Protein-PAK200SW凝胶过滤后得到两个菊粉酶组分EⅠ和EⅡ;后者采用DEAE-Sephacel离子交换、Sephadex G150凝胶过滤后得到菊粉酶Eexo。经Waters 650E蛋白纯化系统鉴定,三者均呈单一的对称峰;EⅠ和EⅡ达聚丙烯酰胺盘状凝胶电泳纯。EⅠ、EⅡ和Eexo的分子量分别为42kD、65kD和57kD;三者均为糖蛋白,多糖含量分别为30％、35％和25％;I/S(Inulinaseactivity/Sucrase activity)比值分别为0.086、0.078和0.072;三者均属外切菊粉酶。EⅠ、EⅡ和Eexo酶反应最适pH分别为4.6、4.5和4.6,最适温度分别为52℃、52℃和55℃;Ag⁺、Hg2+和PCMB对酶活性有强烈的抑制作用;三者水解菊芋…     

固定化克鲁维酵母Y-179外切菊粉酶的研究

鹰嘴豆孢克鲁维酵母(Kluveromyces cicerisporus Y-179)分泌的糖基化菊粉外切酶经高碘酸钠氧化其分子表面的糖链产生醛基,再共价结合于氨基型固定化载体ZH-HA上,固定化酶活力达到4 000 U/g湿载体。所制备的固定化酶在pH 3.5和70℃温度下表现出最大反应活性,该固定化酶pH稳定性和热稳定性较游离酶明显提高。固定化酶在分批式反应器中重复水解菊粉50批次,活力没有明显损失,表现出良好的工作稳定性。     

胰凝乳蛋白酶在反胶束体系中热稳定性的研究

研究了AOT／正辛烷反胶束体系中,表面活性剂AOT,助溶剂甘油和体 压力对胰凝乳蛋白酶热稳定性的影响,结果表明;常压下,40度时,体系中的甘油浓度分别为20％,30％,50％,60％（V／V）时,酶的活力分别为原来的10％,22％,59％,48％,说明在体系中加入甘油作为助溶剂可减少胰凝乳蛋白酶的运动,增强其稳定性,同时,发现体系压力的增加也能增强酶的稳定性,实验测出,AOT正辛烷反胶束体系萃取胰凝乳蛋白酶的最佳条件：R＝10,甘油浓度为50％,体系压力为50MPa,酶的萃取率为97％。     

马克斯克鲁维酵母菌菊粉酶的异源表达及低聚果糖制备工艺优化

【目的】低聚果糖是新型的食品和保健品原料,具有广阔的市场需求。以菊粉酶水解菊粉制备低聚果糖的酶法工艺是先进的绿色制造。本研究旨在获得高产的菊粉酶菌株及以菊粉为原料酶法制备低聚果糖的优化工艺。【方法】采用基因工程手段克隆马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)的菊粉酶基因,实现其在毕赤酵母中的高效表达;测定菊粉酶在不同p H、温度、金属离子和底物浓度等条件下的酶活变化趋势,获得最佳的反应参数;通过高效液相色谱法检测水解产物,获得不同酶量水解产物各组分分布。【结果】菊粉酶工程菌株在10 L发酵罐中的产菊粉酶活达1 570 U/m L、蛋白质含量为2.75 g/L发酵液;菊粉酶最适反应参数为:在体积为1 L的反应体系中,p H 5.0、反应温度50°C、含0.2 mmol/L Mg2+以及菊粉浓度为8%。在该条件下,酶量为10 U时菊粉被完全水解。水解产物中单糖和二糖含量仅为9.25%,而低聚果糖(C3-C8)含量为90.75%,且C3-C5低聚果糖含量高达72.92%。【结论】克隆了K.marxianus菊粉酶基因并实现了高效表达,获得了水解菊粉制备低聚果糖的最佳工艺条件。为菊粉酶的大量生产及低聚果糖的酶法制备奠定了良好的基础。     

药用中性蛋白酶的研究

枯草杆菌(Baceillus subtilis) AS 1.398中性蛋白酶的粗酶(5万u／g),用自来水(1：10)抽提12小时,在这抽提液中加入20％(v／v)CaCl2溶液(在100ml水中加60g无水CaCl2)：再加25％固体硫酸铵使酶沉淀,过滤后得酶饼,用0．005MpH7．2磷酸缓冲液溶解,经Sephadex G-25柱脱盐,冷冻干燥得片状粉末,含酶活60一100万u/g,纯度提高4倍,本制剂具有较强的抗炎消肿及溶解纤维蛋白的作用。     

蚕豆叶片尿囊素酶的热敏感性

蚕豆叶片尿囊素酶热敏感,在30℃的半衰期是50min。缺底物时预处理10min,半失活温度是41.5℃。甘油能提高其热稳定性,在30％甘油保护下,15℃和25℃之间的活化能是14 644J mol~(-1)(3.5 keal/mol)。     

微生物菊粉酶的研究进展

菊粉酶（Inulinas．EC3.2.1.7）是B－2．1-D-果聚糖酶,可从果糖的非应原端逐个切下单个果糖（外切酶活性）,或在分子内部随机切断某个p－2.1糖着键（内切酶活性）［1］。菊粉酶主要来源于菊科植物和部分微生物,微生物菊粉酶主要来自霉菌、酵母菌和细菌。菊粉酶可水解天然果聚精一菊粉（Inulin）,利用菊粉酶一步水解菊粉制备高果糖浆具有工艺简单、原料价格低廉、转化率高、副产物少,不增加环境污染等优点,因而具有很大的开发应用潜力。菊粉是果糖的多聚物,富含于菊芋（He－lianthustuberosus）等多种菊科植物中,菊芋块茎主要成分…     

克鲁维酵母Y-85合成菊粉酶最适条件的研究

采用响应面方法（ResponseSurfaceMethod,RSM）对克鲁维酵母（Kluyveromycessp．）Y－85产菊粉酶培养基成份进行了优选,和正交试验相比,该法选出的最适培养基的酶发酵水平提高28％。用15L自控发酵罐进行产酶条件控制试验,并在1000L罐上进行5批次酶发酵中试,平均菊粉酶活性达68.9u／ml。