小鼠类胚胎干细胞分离培养及用于制作嵌合体小鼠的实验研究

目的探讨分离小鼠囊胚内细胞群类胚胎干细胞及用于制作嵌合体小鼠的方法及应用价值。方法分离3.5d小鼠囊胚内细胞群的类胚胎干细胞作为供体细胞,通过显微注射方法将分离的类胚胎干细胞注射到供体小鼠的囊胚腔中,再将注射后的囊胚移植到假孕雌鼠的子宫中制作嵌合体小鼠。结果分离36枚囊胚的内细胞群类胚胎干细胞,注射256只昆明小鼠囊胚中,移植32只假孕雌鼠子宫中,获产崽2窝,共12只,其中2只获毛色嵌合体小鼠。结论采用该技术分离所获得的类胚胎干细胞作为供体细胞制作嵌合体小鼠获得成功,该方法为ES细胞介导的转基因动物制作增添了一条新的途径,在同种不同品系的动物改良及遗传病基因治疗中有一定的应用价值,尤其是对未能建立ES细胞系的大动物的遗传工程操作具有一定意义。     

一种新型的双功能体内突变检测系统的建立

将含有两个LacI靶基因的穿梭质粒pMCLacI/neo整合入小鼠的基因组中 ,建立一种能同时分析体内表达基因和沉默基因的双功能的新型体内突变检测系统 ,使在体内比较分析不同组织、器官中表达基因和沉默基因的突变谱和突变率成为可能。486个经显微注射过 pMCLacI/neo质粒的C5 7BL/ 6小鼠的受精卵 ,分别移植入 18只假孕母鼠的输卵管中 ,产下 32只存活小鼠 ,进一步检测证实 :(1)有 5只小鼠在基因组中整合有 pMCLacI/neo基因 ;(2 )该质粒中的两个LacI靶基因 ,只有一个表达 ;(3)能有效地从小鼠基因组中回收 pMCLacI/neo基因。因此 ,成功建立了pMCLacI/neo的转基因小鼠品系 ;可以将该小鼠用于整体动物水平研究表达基因和沉默基因突变机制的模型 ;该模型为一种具有双功能的新型体内突变检测系统     

人类凝血第八因子转基因乳山羊的培育

台湾大学农学院研究人员应用显微注射技术 ,将含有牛α 乳白蛋白基因 (αlA)调节序列与人类凝血第八因子 (hFⅧ )基因构造性cDNA序列的αLA hFV Ⅲ转基因片段 ,注入小鼠和山羊的早期胚原核中 ,并将此二早期胚分别移植于受胚小鼠和受胚山羊的生殖道内 ,希望能获得转基因小鼠和转基因羔羊 ,还分别从其乳腺生产hFVⅢ的医药用蛋白质。开始试验移植 6 1 2只已完成αLA hFVⅢ基因注射的小鼠胚于 2 1只受胚母小鼠 ,结果 1 4只怀孕并产下79只小鼠。用PCR、Southernblot及slotblot分析结果 ,证实其中 1 7只 (1 0♀ /7♂ )系带有αlA hFVⅢ基…     

绿色荧光蛋白基因在转基因小鼠体内的表达

建立绿色荧光蛋白（GFP）转基因小鼠,继而传代建系。采用显微注射法,将GFP基因注入FVB／NJ小鼠受精卵原核内,获得子代鼠。分娩后3周剪取仔鼠尾,提取基因组DNA,应用PCR、Southern印迹技术进行整合检测。结共用雌性小鼠200只,注射受精卵1586枚,移植卵数386枚,受体鼠32只,怀孕鼠4只,子代鼠18只,有4只为阳性：取2只首建鼠的胚胎,在荧光显微镜下观察GFP表达明显,表明初步获得了转绿色荧光蛋白基因小鼠,     

钙蛋白酶抑制蛋白转基因小鼠的构建和鉴定

目的：将人的钙蛋白酶抑制蛋白（ calpastatin, CAST）外源基因整合到C57BL/6J小鼠中,构建高表达CAST的转基因小鼠模型。方法利用Gateway技术构建pRP．EX3d-EF1A-CAST-IRES-eGFP载体,回收片段后通过显微注射法将目的基因片段注入到C57 BL/6 J小鼠受精卵中,将其胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内获得子代小鼠。采用PCR方法鉴定出阳性的转基因小鼠,确定首建鼠,通过与C57BL/6J小鼠回交后互交数代建系。利用RT-PCR和Western blotting方法检测CAST基因和蛋白在各组织中的表达情况。结果将90枚注射受精卵移植到3只假孕鼠中,3只均怀孕,移植成功率100％,产下23只子鼠,经PCR鉴定得到2只转基因阳性首建鼠,阳性率为9％。子代小鼠进行RT-PCR检查显示,CAST基因在转基因小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑和骨骼肌中均有表达;Western blotting检查显示,CAST蛋白表达在转基因小鼠中显著高于同窝阴性小鼠。结论通过显微注射法成功构建CAST高表达的转基因小鼠,为进一步研究CAST奠定了良好的模型基础。     

四环素调控SV40Tag转基因小鼠模型的建立

目的构建四环素调控的SV40T转基因小鼠模型。方法同时显微注射外源基因p205-rtTA-C3和pTRE-Tag至FVB小鼠原核,注射受精卵移植到同期发情的假孕受体出生个体,经PCR和Southern检测获得阳性转基因小鼠。结果经PCR结合Southern检测得到rtTA和Tag双阳性转基因小鼠一只,rtTA单阳性两只和Tag单阳性一只。结论通过饮水给与四环素的双阳性小鼠可在卵巢中检测到Tag mRNA的表达。     

携带HLA-B2704基因转基因小鼠技术的建立

应用显微注射法制备携带HLA B2 70 4基因的转基因小鼠 .对 2 86只昆明小鼠激素注射进行超排卵 ,采集受精卵 ,将含HLA B2 70 4基因的基因组DNA片段 (简称HLA B2 70 4DNA)显微注射到受精卵原核内 ,把注射存活的两细胞期受精卵移入假孕鼠的输卵管内使其发育产生后代 .用PCR方法进行F0代仔鼠及F1代仔鼠的转基因整合的检测 .利用RT PCR检测阳性鼠中的HLA B2 70 4转基因的表达 .采集了 84 11个卵 ,可注射卵 6 6 0 9个 ,其中注射存活的两细胞期受精卵 4 2 77个 ,卵的注射存活率为 6 4 7%.将卵移入 15 3只假孕鼠 ,其中 2 6只怀孕产仔 ,存活 10 1只 .在 10只F0代仔鼠基因组中有HLA B2 70 4基因整合 ,整合率为 9 9%.转基因阳性鼠F0代之间以及与正常鼠之间进行交配 ,产生的F1代仔鼠 78只 ,其中 15只为阳性 .阳性鼠的皮肤、结肠、睾丸和脾脏组织中均有HLA B2 70 4转基因mRNA的表达 .在HLA B2 70 4转基因阳性小鼠中 ,6只小鼠皮肤出现脱毛 ,1只小鼠的足部及足趾明显红肿 ,2只在脱毛同时明显畏光 ,1只出现腹泻 .结果表明 ,成功地建立了HLA B2 70 4的转基因小鼠技术 ,该小鼠类似强直性脊柱炎的小鼠模型 .     

MTA1转基因小鼠的构建及鉴定

目的将人的MTAl外源基因整合到C57BL／6J小鼠中,构建稳定高表达MTAl的小鼠模型。方法通过RT—PCR方法克隆人的MTAl编码序列,将MTAl插入真核表达载体pcDNA3．1构建pcDNA3．1-MTAl载体,回收片段后利用显微注射技术将目的基因片段注入到受精卵的雄原核中,使用MTAl特异性的引物经PCR鉴定出基因型阳性的转基因小鼠,再利用Western—blot及免疫组化方法检测MTAl在转基因小鼠全身级织表达情况。结果成功构建了MTAl转基因注射片段。在320枚显微注射受精卵中挑选出300枚存活卵移植到10只ICR小鼠假孕受体的输卵管中,10只ICR小鼠均怀孕,移植成功率为100％,共生出子代鼠80只,经PCR检测其中共有9只整合了MTAl基因,整合率为11．25％。经PCR鉴定MTAl整合阳性的F1代小鼠,再经Western—blot和免疫组化分析检测MTAl表达水平在脑、肺、肝、肠等组织中表达明显增高,肾、骨骼肌表达无差异。结论成功构建了脑、肝、肺、结肠高表达MTAl的转基因小鼠,为进一步MTAl研究奠定了良好的研究模型。     

转基因动物研究现状

导言 1980年Gordon等人将疱疹病毒胸苷激酶基因和SV40早期基因启动子重组到质粒pBR322中,再由显微注射植入小鼠受精卵原核,获得第一只转基因小鼠。原理上任何克隆基因都能永久并入哺乳动物胚胎基因组。显微注射后,外源DNA整合进细胞,随后繁衍成种系。因此通过选育能永久建立携带一个或多个新基因的动物谱系。“转基因”(Transgenic)一词应运而生。在此之前,Jaenisch(1976)观察到逆转录病毒(又称逆病毒)感染小鼠胚胎,使单个前病毒DNA插入小鼠染色体DNA。而后含异源基因的重组感染性逆病毒系统的发展导致了用     

骨形态发生蛋白9基因敲除小鼠的构建

目的运用CRISR/Cas9技术敲除小鼠基因组中Bmp9基因片段,构建Bmp9基因敲除小鼠。方法根据Bmp9基因的外显子序列,设计一段sgRNA并合成。sgRNA体外转录后和Cas9mRNA混合后显微注射受精卵细胞,注射后的受精卵细胞移植至受体动物获得子代小鼠。提取子代小鼠基因组DNA测序鉴定其基因型。基因型鉴定正确的小鼠与野生型交配后筛选纯合子小鼠。同时取纯合子小鼠心脏、肝、脾、肺、肾,匀浆后提取总RNA和总蛋白,通过qPCR、WB和免疫组化检测BMP9在各组织中的表达。结果设计并合成20bp的sgRNA并进行体外转录,显微注射并回植后得到基因突变小鼠,连续交配后得F2代纯合子。测序结果显示,突变小鼠存在两种基因型,一种为5bp缺失突变,另一种为13bp缺失并伴有1bp插入突变。与野生型C57BL/6相比,qPCR、WB和免疫组化结果均表明基因敲除小鼠肝中BMP9表达显著降低。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建出了BMP9基因敲除小鼠。     

TNNI2突变转基因小鼠模型的建立

目的建立TNNI2突变转基因小鼠模型。方法构建pEGFP-tnni2转基因构件,TNNI2基因的第175个氨基酸缺失,通过原核显微注射法。把线性化、纯化后的外源基因pEGFP-tnni2注射入BDF1小鼠受精卵中。胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠,获得子代小鼠。用PCR和Southern方法检测子代鼠尾DNA鉴定基因型。通过RT-PCR方法检测tnni2基因表达。结果移植注射胚胎115枚给4只假孕小鼠共出生了23只后代鼠。经PCR和Southern方法检测得到4只阳性小鼠。对其子代进行RT-PCR检测,tnni2基因在肌肉、心脏内表达。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP-tnni2（TNNI2基因的第175个氨基酸缺失）在小鼠基因组中得到整合,建立了转pEGFP-tnni2的转基因小鼠模型。     

潮霉素抗性转基因BDF1小鼠模型的建立

目的建立具有潮霉素（hygromycin）抗性转基因BDF1小鼠,用于制备携有hygromycin抗性筛选标志ES阳性细胞克隆的饲养层。方法通过显微注射的方法,将含有潮霉素B磷酸转移酶基因片段（5.1kb）导入BDF1受精卵雄原核中,共注射169枚受精卵,然后将129枚受精卵细胞植入同期受孕的受体母鼠输卵管内。结果共产生37只转基因小鼠,经PCR和Southern检测获得9只阳性小鼠,对一只子代鼠进行RT-PCR检测证明hyg基因已经在肾、肌肉、脾内表达。结论成功的建立具有潮霉素抗性的BDF1转基因鼠,该模型动物可以为基因敲除研究提供良好的基础条件。     

基于CRISPR/Cas9技术构建严重联合免疫缺陷小鼠

目的应用CRISPR/Cas9技术靶向敲除编码小鼠T、B细胞的Rag2基因及编码NK细胞的IL2rg基因,构建T、B细胞及NK细胞联合免疫缺陷小鼠。方法根据Genbank报道的Rag2及IL2rg基因序列,分别针对其外显子设计25 bp左右的sgRNA并进行合成,sgRNA退火后克隆入p X330载体。Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA及Cas9重组质粒体外转录为mRNA后显微注射入BALB/c小鼠受精卵细胞,受精卵细胞移植到受体动物获得子代小鼠,首建鼠(F0)与野生型小鼠交配获得F1代小鼠,突变的F1代小鼠互交后筛选F2代纯合子小鼠。通过基因测序、流式细胞技术及接种人源性肿瘤细胞系方法检测子代小鼠基因型和表型。结果成功构建了Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA重组质粒并对其进行了体外转录,mRNA显微注射并移植后获得57只F0小鼠。连续交配后,获得F2代纯合子小鼠。序列分析表明子代小鼠中IL2rg有两个基因型,分别是10 bp和11 bp的缺失突变;而Rag2只有一个基因型,为8 bp的缺失突变。与野生型BALB/c小鼠相比,小鼠外周血中CD3、B220及NKp46阳性细胞数量明显降低。接种人乳腺癌细胞系SKBR-2HL后,肿瘤生长良好,且随着时间延长肿瘤组织逐渐增大。结论利用CRISPR/Cas9技术可有效实现BABL/c小鼠体内Rag2、IL2rg基因突变,并导致小鼠T、B及NK细胞功能异常。     

通过显微注射法构建ES细胞(MESPU 13)嵌合小鼠

为了研究一个新建的小鼠胚胎干细胞系(ES细胞系)MESPU 13,我们将ES细胞显微注射到C57BL/6J小鼠的囊胚中构建嵌合鼠。在注射了2-9个ES细胞的136个囊胚中,127个囊胚(93%)经过3个小时的培养后重新出现囊胚腔。当把119个恢复的囊胚移植到假孕雌鼠的子宫内时,获得63只(52.9%)出生鼠。在59只存活到可以判断毛色阶段的小鼠中,有21只(35.6%)被判定为嵌合鼠。显示了该ES细胞系具有较高的嵌合能力。     

小鼠输精管内转染法建立人组织型纤溶酶原激活剂(tPA)乳腺定位表达生物反应器的研究

外源基因受精卵内显微注射目前仍然是种常用的建立转基因动物的方法,但此方法操作复杂,成本高。因此利用精子作为载体将外源基因带入卵细胞内建立转基因动物成了极具吸引力的方法,并且已有一些成功的报道。虽然该方法简单,但总体来说可重复性较差。我们在建立乳腺定位表达人组织型纤溶酶原激活剂(tPA)小鼠模型中,对此方法做了改进,即将脂质体包裹的外源基因在小鼠输精管及附睾管内转染精子,而非以往的在体外转染,结果:(1)五只转染小鼠,术后10天内共使10只正常母鼠受精;(2)共繁殖出79只首建者小鼠,存活42只;(3)用PCR检测首建者小鼠外源基因的整合,阳性率为7/42(16.67%);(4)用凝胶平板溶圈试验检测5只PCR阳性的雌性首建者小鼠泌乳期乳汁中的活性tPA,3/5表达,表达量在12—20IU/ml之间(约相当于48—80ng/ml);(5)PCR检测4只子一代小鼠外源基因的遗传情况,阳性率为2/4。     

通过染色体外同源重组建立乳腺中表达外源基因的转基因小鼠

为研究染色体外重组方法在创建转基因动物中的应用,选取牛asl酪蛋白基因的5′及3′侧翼区和氯霉素乙酰化酶编码区,构建了两个具有3 kb相互重叠的融合基因.将这两个DNA片段末端脱磷酸后,以摩尔比1:1的比例混合,通过显微注射导入小鼠受精原核,最后获得了11个品系的转基因小鼠.对其中10个品系的小鼠的整合分析表明,所注射的两个DNA片段均发生了染色体外同源重组,而且除了 1个品系的小鼠丢失了大约1kb的序列外,其余品系小鼠的重组产物与预想的结构符合.在当代和后代的转基因小鼠乳汁中均可测到氯霉素乙酰化酶的活性.这表明融合基因在转基因小鼠乳腺中得到表达和分泌,也说明显微共注射两个相互重叠的基因片段是建立转基因动物的一个可行途径.     

Dicer1转基因小鼠模型的建立

目的建立Dicer1转基因小鼠模型。方法构建pcDNA3.1-Dicer1转基因构件,经酶切、纯化后通过显微注射方法导入BDF1小鼠受精卵原核并移植到同期受孕的ICR受体母鼠输卵管内。出生后仔鼠用PCR和Southern方法检测鼠尾DNA鉴定基因型,通过免疫组化检测Dicer1基因表达。结果显微注射172枚卵,移植119枚卵于3只受体输卵管中,2只怀孕,共产仔15只,经PCR检测获得6只阳性鼠,Southern检测6只均为阳性。对Southern检测阳性转基因小鼠子代进行RT-PCR检测和免疫组化分析证明Dicer1基因在肝脏、肾脏、肺内均有表达。对腹腔肿胀的转基因阳性1号鼠解剖发现肝脏、脾脏明显增大,胚胎发育异常。结论成功建立Dicer1基因表达的转基因小鼠模型,该模型为进一步研究DICER1基因功能及miRNA的表达及功能等奠定基础。     

基于四环素调控系统的ApoE-rtTA/TRE-HCV-C双转基因小鼠的制备

目的为了丰富现有的四环素调控系统的小鼠资源库,同时也为更好地研究目的基因HCV-C的作用机制提供一个活体的动物模型,制备基于四环素调控系统原理的调控部分ApoE-rtTA的转基因小鼠,与反应部分TRE-HCV-C转基因小鼠,相互交配制作出双转基因小鼠。方法应用显微注射法将构建好的两种基因片段ApoE-rtTA及TRE-HCV-C分别注入超排的昆明母鼠的受精卵,再植入假母输卵管,出生动物及其后代经PCR初步筛选出阳性,将两者及阳性后代交配产生携带5只转基因鼠再经Western blot和RT-PCR在RNA和蛋白水平上进一步鉴定。结果产生了3只整合有ApoE-rtTA基因的首见鼠和125只阳性子代,以及产生了5只整合有TRE-HCV-C基因的首见鼠和16只阳性子代。PCR及Southern Blot证实上述阳性鼠确有转基因整合。将两者交配产生携带5只双转基因鼠。结论成功制备了携带有ApoE-rtTA及TRE-HCV-C转基因小鼠,建立了分别携带有这两种基因的鼠群,以及同时携带有两种基因的双转基因小鼠,为四环素调控系统提供了一个良好的通用型的调控动物模型,同时也可利用四环素调控系统来研究HCV中的C基因对小鼠的作用,也是HCV-C基因功能研究及与肝细胞癌的关系的机制研究的一个有用工具。     

Mx—cre转基因小鼠品系的建立及其培育

将携带MX启动子调控的Cre基因真核表达载体pMx-cre线性化后,通过受卵显微注射途径制备转基因小鼠,共注射99个卵,产佴0只,利用PCR对小鼠进行筛选,以基因组Southern blot确证,最后得到一个阳性的小鼠品系,进而将其保护和扩大繁殖。     

转基因动物及其在医学研究中的应用

转基因动物(transgenic animal)是指基因组中稳定地整合有以实验方法导入的外源DNA的动物。被导入的外源基因称为转基因(transgene)。1974年美国学者Jeanisch等首次应用显微注射的方法将SV40 DNA注射到小鼠囊胚腔内,在子代小鼠的许多组织中含有该DNA,后来研究证明该DNA以非整合的附加体