嵌合病毒技术在黄热病毒属病毒研究中的应用

嵌合病毒技术是用于RNA病毒研究的一个重要技术,近十年来在黄热病毒属病毒的研究中,构建了一些型内及型间的嵌合病毒,不仅有利于该属病毒的分子机制研究,更重要的是研制出一些新型减毒活疫苗.本文简单介绍该技术的原理、构建、影响因素、应用前景等.     

三重融合PCR法构建感染性辛德毕斯嵌合病毒cDNA克隆

利用三重融合PCR法,即将3个DNA片段放在同一个反应里进行长片段PCR扩增法,融合得到了包含辛德毕斯病毒XJ-160株结构基因E3、E2、6K、3′UTR和辛德毕斯病毒YN87448株结构基因E1的融合DNA片段E3E26KE13′UTR。通过此融合片段两端引入的XbaI和XhoI酶切位点将其连接到XJ-160株的感染性全基因组cDNA克隆骨架上,成功构建了辛德毕斯病毒株XJ-160与YN87448外膜糖蛋白基因E1相互替换的嵌合病毒cD-NA克隆,命名为pBR-XJ160YE1。该克隆线性化后经体外转录,RNA转录体脂质体法转染BHK-21细胞,36h后细胞发生病变。间接免疫荧光检测到病毒蛋白的表达。提取5次传代后细胞上清中病毒RNA,RT-PCR法检测证明病毒来源于嵌合病毒cDNA克隆。此感染性辛德毕斯嵌合病毒cDNA克隆可以作为研究辛德毕斯病毒E1糖蛋白基因相关功能及XJ-160病毒和YN87448病毒存在单方向血清学反应的分子机理的分子生物学工具。     

嵌合型口蹄疫病毒样颗粒构建、表达及鉴定

为提高口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus,FMDV)病毒样颗粒(Virus-likeparticles,VLPs)的特异性识别和递呈,为靶向疫苗研究奠定基础,利用反向PCR技术,将卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)第257–264位氨基酸(Amino acids,aa)的短肽嵌入FMDV结构蛋白VP3第171–172位aa或第173–174位aa,通过大肠杆菌表达FMDV结构蛋白VP0、VP1和嵌合型VP3,体外组装得到嵌合OVA257-264肽的病毒样颗粒(VLPOVA)。用动态光散射、透射电镜检测VLPOVA大小和形态,免疫印迹、酶联免疫吸附试验和激光共聚焦显微镜检测短肽的嵌入情况。结果显示在VP3的第173–174位aa嵌入OVA,不影响蛋白表达和VLPs的组装且OVA位于VLPOVA的表面,VLPOVA粒径比VLPs稍大。     

免疫球蛋白变区基因的体外扩增及人－鼠嵌合抗体的表达

应用聚合酶链反应法体外扩增抗人小细胞肺癌单克隆抗体的变区基因,经核苷酸序列分析,轻链变区基因为３２４ｂｐ,编码１０８个氨基酸;重链变区基因为３５１ｂｐ,编码１１７个氨基酸。将重链变区基因克隆至ｐＳＶ_２△ＨｇｐｔＨｕγ_３质粒,经一系列克隆、筛选,得一插入方向正确的表达人－鼠嵌合重链抗体的载体－ｐＳＶ_２△Ｈｇｐｔ２Ｆ７ＶＨＨｕγ_３。用电穿孔方法将该质粒导入鼠源骨髓瘤细胞Ｊ５５８Ｌ,用霉酚酸进行初步筛选,最终用兔抗人免疫球蛋白ＩｇＧＦｃ片段的抗体筛选得七株阳性克隆,免疫印迹法结果表明在与人ＩｇＧ相同位置上有一阳性条带。     

乙脑/登革2型嵌合病毒的构建

在乙脑病毒SA14-14-2株复制子载体pPartial△prM/E中克隆入DV2(Dengue virus serotype 2)的prM/E基因,构建乙脑/登革2型嵌合体克隆。将嵌合体克隆线性化后体外转录,获得的RNA转染BHK-21细胞,5～7d可观察到CPE。收获病毒上清液分别感染BHK-21细胞及C6/36细胞。接种于C6/36细胞中的嵌合病毒可使细胞出现CPE,RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot检测显示:获得的嵌合病毒具有预期嵌合性核酸并能表达DV2的包膜蛋白,但不能在BHK-21细胞中传代培养。成功构建的乙脑/登革2型感染性克隆为进一步研究登革病毒疫苗奠定了基础。     

马传染性贫血病毒基因非编码区LTR嵌合克隆的构建

在已有全长感染性克隆pLGFD3 8 和pD70344 的基础上,根据马传贫弱毒疫苗致弱过程中不同代次毒株LTR序列的分析,在LTR U3区选取特定的酶切位点对EIAV非编码区LTR基因进行了部分替换。将替换的全基因克隆转染驴胎皮肤细胞(FDD)并以驴白细胞(DL)传代,用逆转录酶活性检测、RT PCR方法及Real time RT PCR验证其感染性。结果发现,其衍生病毒感染上述两种细胞均出现明显的细胞病变;细胞培养上清可检测到RT酶活性和RT PCR阳性。电镜下可见大量典型的EIAV颗粒。pLGFD9 12 嵌合克隆衍生病毒与其父本克隆衍生病毒pLGFD3 8具有相似的复制水平,pLGFD9 12嵌合克隆衍生病毒在DL细胞上复制水平略高于FDD细胞。此结果为进一步深入研究LTR对马传染性贫血病毒复制水平和毒力的影响奠定了基础。     

马传染性贫血病毒基因非编码区LTR嵌合克隆的构建

在已有全长感染性克隆pLGFD3-8和pD70344的基础上,根据马传贫弱毒疫苗致弱过程中不同代次毒株LTR序列的分析,在LTR U3区选取特定的酶切位点对EIAV非编码区LTR基因进行了部分替换.将替换的全基因克隆转染驴胎皮肤细胞(FDD)并以驴白细胞(DL)传代,用逆转录酶活性检测、RT-PCR方法及Real-time RT-PCR验证其感染性.结果发现,其衍生病毒感染上述两种细胞均出现明显的细胞病变;细胞培养上清可检测到RT酶活性和RT-PCR阳性.电镜下可见大量典型的EIAV颗粒.pLGFD9-12嵌合克隆衍生病毒与其父本克隆衍生病毒pLGFD3-8具有相似的复制水平,pLGFD9-12嵌合克隆衍生病毒在DL细胞上复制水平略高于FDD细胞.此结果为进一步深入研究LTR对马传染性贫血病毒复制水平和毒力的影响奠定了基础.     

感染性马传染性贫血病毒嵌合克隆的构建

在已有的全长感染性克隆pFD3的基础上,构建了新的低拷贝的全长克隆pLGFD3-8。按照疫苗制备过程中env基因的变化情况,采用基因替换和定点突变的方法,构建了一系列具有马传染性贫血病毒(EIAV)强毒株env基因及其主要突变特征的嵌合克隆。利用这些克隆转染FDD细胞,并用逆转录酶活性检测和PCR方法确定其感染性。结果发现,在FDD细胞中传代3次后,可在细胞培养物中检测到逆转录酶活性和原病毒DNA的存在,在电镜下可以观察到典型的EIAV病毒颗粒。这一结果为进一步研究马传染性贫血病毒致病的分子机制和免疫保护机理奠定了良好的基础。     

针对猪瘟病毒E2蛋白的嵌合猪源化单克隆抗体的表达及抗病毒活性鉴定

猪瘟(Classical swine fever,CSF)是严重危害养猪业的一种烈性传染病,常造成巨大的经济损失,是世界动物卫生组织要求必须申报的动物疫病之一。猪瘟的病原是猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV),CSFV的结构蛋白由衣壳蛋白(C)和囊膜糖蛋白(E~(rns)、E1、E2)构成。E2蛋白是CSFV主要的保护性抗原,可以诱导机体产生中和抗体,从而抵抗CSFV的感染。此前,本团队制备了一株针对CSFV E2蛋白的鼠源单克隆抗体HQ06。文中将HQ06抗体重链和轻链可变区基因与猪源恒定区基因嵌合后克隆至真核表达载体,利用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞制备一株针对CSFV E2蛋白的嵌合猪源化单克隆抗体c HQ06。应用ELISA、Western blotting试验证实了c HQ06与CSFV E2蛋白具有良好的反应性;中和试验结果表明c HQ06可以中和CSFV。综上所述,本研究应用CHO细胞稳定表达了具有良好反应性和中和活性的针对CSFV E2蛋白的嵌合猪源化单克隆抗体c HQ06,为研究CSFV E2蛋白结构、功能以及开发新型的CSFV诊断和治疗制剂奠定基础。     

嵌合猪圆环病毒PCV1-2的构建及其感染性初步鉴定

猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)是当前严重危害养猪业的重要病原之一。目前,世界上还没有有效疫苗用于该病毒的免疫预防。该研究利用PCR方法,将PCV2的ORF2基因替换猪Ⅰ型圆环病毒(PCV1)的ORF2基因,构建了以PCV1基因组为骨架的嵌合病毒(PCV1-2)分子克隆(pSK2PCV1-2)。将该分子克隆转染PK-15细胞并连续盲传5代,用RT-PCR方法可以在转染后盲传的细胞中检测到PCV1的ORF1 mRNA和PCV2的ORF2 mRNA,但检测不到PCV1的ORF2 mRNA和PCV2的ORF1 mRNA。间接免疫荧光检测显示在盲传第5代的细胞中有PCV2 ORF2蛋白的表达,表达蛋白主要分布于细胞核。该研究初步证实构建的PCV1-2分子克隆转染细胞后可以形成具有感染性的嵌合病毒,从而为更深入研究嵌合病毒生物学特性奠定了基础。     

基因工程抗体融合蛋白的构建

抗体融合蛋白可以具有抗体的特性和所融合的功能蛋白的活性,可广泛用于免疫治疗、免疫诊断、抗体纯化及抗体和抗原的分析定量等,特别可用于免疫导向药物的制备。基因工程抗体融合蛋白比传统的化学交联的抗体融合蛋白具有更多的优越性。本文就基因工程抗体融合蛋白的构建和性质做一综述。     

马传染性贫血强/弱毒嵌合病毒的体外构建

马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus,EIAV)引起马传染性贫血(简称马传贫),导致马持续性感染和反复病毒血症[1].EIAV与人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)同属反转录病毒科慢病毒属,二者有很多相似的特性[2].在反转录病毒前病毒基因组两端含有长末端重复序列(long terminal repeat,LTR).LTR含有真核启动子,其中含有病毒转录调控顺式作用位点,病毒编码的反式作用因子与其结合后可以反式激活基因的表达,对病毒基因的表达和其它生命活动起重要调控作用[3,4].因此,LTR序列的变异可能会引起病毒转录和复制方式的改变,进而引起其细胞嗜性和致病性的改变[5,6].为了探讨LTR在EIAV病毒复制和转录过程中的作用,并进一步研究EIAV的致病和免疫机制,用EIAV强毒L株LTR置换了以前构建的EIAV DLA(弱毒)感染性分子克隆中的LTR,构建了马传贫强/弱毒嵌合分子克隆,并获得了具有感染性的强/弱毒嵌合病毒.     

不同信号肽对人鼠嵌合CMV-IgM分泌表达的影响

为了实现在体外制备巨细胞病毒-免疫球蛋白M(CMV-IgM)和探讨不同信号肽对CMV-IgM表达的影响,通过RLM-RACE技术钓取杂交瘤细胞基因序列,构建人鼠嵌合CMV-IgM表达载体,并通过PCR方法将5种不同的分泌型信号肽(SigA–SigE)代替CMV-IgM自身信号肽(SigF),利用中国仓鼠卵巢细胞(CHO)作为宿主细胞进行体外表达。对纯化后的CMV-IgM进行SDS-PAGE、SEC-HPLC和酶联免疫吸附试验(ELISA)确定其蛋白表达水平与免疫反应性,最终成功制备出910 kDa的重组蛋白,且研究表明,5种信号肽(SigA–SigE)的人鼠嵌合CMV-IgM表达量较CMV 6#细胞株自身信号肽SigF相比,分别提高了6.72、5.19、1.44、1.85、1.98倍。这将对人鼠嵌合CMV-IgM的开发提供理论基础,且为提高CMV-IgM表达量的研究工作提供了新思路。     

嵌合抗原受体（CAR）-T细胞的单细胞转录组测序研究

CAR-T细胞疗法是一种新兴的肿瘤免疫疗法,目前已经在白血病、骨髓瘤等血液系统肿瘤的治疗中取得显著疗效。由于CAR-T细胞是在体外诱导产生的细胞群体,具有很高的异质性。这种异质性的存在,是影响CAR-T细胞治疗效果的重要因素。本研究通过单细胞转录组测序技术,对基于NKG2D分子识别和第3代CAR-T细胞技术构建的NKG2D/CAR-T细胞进行了转录组学特征的分析。结果表明,通过对比特征基因进行降维聚类,将NKG2D/CAR-T细胞分为12个细胞簇,其特征基因显示NKG2D/CAR-T细胞以幼稚样和中央记忆样细胞亚群为主。不同细胞簇表达基因存在差异,对差异基因进行富集分析发现,这些差异基因富集在病毒侵入细胞、插入宿主细胞DNA并复制、T细胞代谢、增殖、活化及分化等信号通路。     

肿瘤特异性嵌合抗原受体EGFRvⅢ-CAR的构建及体外活性分析

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（chimeric antigen receptor-T, CAR-T）,是通过体外激活和扩增肿瘤特异或非特异性杀伤细胞达到抗肿瘤效果,在肿瘤免疫治疗方面具有良好的应用前景。本研究构建靶向EGFRⅢ(epidermal growth factor receptor variant III)的嵌合抗原受体（CAR）的重组慢病毒表达载体,利用慢病毒感染并筛选能够稳定表达该嵌合抗原受体的Jurkat细胞系。通过EGFRvⅢ分子刺激、与U87MG细胞共培养的方式检测细胞系的活化状况。结果显示,成功构建了pCDH-EGFRvⅢscFv-CAR-copGFP-T2A-puro慢病毒表达重组质粒,并筛选出可稳定表达EGFRⅢ-CAR的Jurkat 细胞系。CCK-8 法检测显示,EGFRvⅢ分子刺激12 h的Jurkat-CAR细胞增殖率约是对照组的1.36倍（P<0.05）;ELISA法检测显示,与U87MG细胞共孵育后,细胞上清中IL-2的浓度约是单独培养分泌在上清中IL-2的1.625倍（P < 0.01）。以上结果表明,稳定表达CAR的jurkat细胞,可以靶向性识别EGFRvⅢ分子及EGFRvⅢ阳性的靶细胞,并引起IL-2细胞因子释放,为后续临床细胞免疫治疗提供了理论基础。     

PCR法检测外环境水中脊髓灰质炎病毒I型基因的研究

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测外环境水中分离的脊髓灰质炎病毒Ｉ型（ＰＶＩ）毒株基因型,发现所分离的２２株病毒,均为疫苗ＳａｂｉｎＩ相关株,脊髓灰质炎病毒的温度敏感（Ｔ特征）试验亦提示为弱毒标,与ＰＣＲ试验相吻合,表明实施强化免疫和常规免疫后,外环境中的脊髓灰质炎病毒已被疫苗相关株循环所取代,同时证实用了ＰＣＲ作为相环境中ＰＶＩ病毒株的基因型分析的检测方法是特异和敏感的。     

人源性抗腮腺炎病毒噬菌体抗体库的构建

应用噬菌体表面呈现技术,从腮腺炎病毒抗体阳性者淋巴细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增出抗体重链Fd和轻链基因,经XhoI/SpeI、SacI/XbaI双酶切,先后克隆入噬粒载体pComb3中,再电转化大肠杆菌XL1-blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染。从分离出的淋巴细胞中共提取高质量RNA约110μg,经逆转录、PCR,分别扩增出约700 bp大小的κ、λ和Fd基因。PCR产物和载体经纯化、双酶切后进行连接,在2.5 kV、200 Ω、25μF的条件下电转化,转化率为2.48×107。最终得到库容量为6.4×106,滴度为7.8×1013 cfu/L的噬菌体抗体库。所构建的抗腮腺炎病毒特异性噬菌体抗体库容量中等大小,能满足从中筛选抗HN蛋白噬菌体抗体的需要。