鸭疫里氏杆菌B739＿RS00825基因缺失株抗血红素毒性和氧化应激损伤以及定殖能力分析

【目的】血红素可作为细菌重要的铁离子来源,然而转运过多的血红素也会对细菌造成毒性。细菌通过调节、外排、螯合等多种方式减轻血红素毒性作用。鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer, RA)是一种感染鸭及其他禽类的革兰氏阴性病原菌。前期研究表明,该菌编码血红素转运系统,且能够从血红蛋白获取血红素,然而该菌是否编码血红素解毒蛋白未知。本研究以编码一氧化氮合成酶的基因B739＿RS00825为研究对象,分析其在抗血红素毒性和氧化应激损伤以及定殖能力中的功能。【方法】构建B739＿RS00825缺失株,并通过测定生长曲线、细菌存活率、毒力及定殖等试验方法鉴定其在抗血红素毒性、抗氧化应激损伤、宿主致病中的功能。【结果】与RA CH-1相比,RA CH-1ΔB739＿RS00825在添加过量血红素的培养基中生长不受影响;然而与RACH-1Δfur相比,RACH-1ΔfurΔB739＿RS00825在含血红素培养基中的生长明显受到抑制且对H₂O₂的抵抗力降低;B739＿RS00825基因在氧化应激条件下及fur缺失株中明显上调;与RA ...     

鹅源鸭疫里默氏杆菌的分离、鉴定与生物学特性研究

【目的】从疑似鸭疫里默氏杆菌病的病死雏鹅分离病原菌进行鉴定。【方法】根据细菌培养特性、生化特性、动物试验、血清型鉴定及分子生物学特性对分离菌株进行鉴定。【结果】分离菌株为革兰氏阴性菌,不发酵糖类和醇类,尿素酶试验和氧化酶还原试验为阳性,致病,不同分离株的16S rRNA基因经多重序列比对分析,结果显示鹅源分离株与鸭源鸭疫里默氏杆菌处于同一进化支上,与鸡源鸭疫里默氏杆菌进化关系稍远,血清型鉴定为1型。【结论】分离菌株为血清1型的鸭疫里默氏杆菌,对鸭和鹅均有高致病性,自家疫苗能够较好地保护雏鹅。     

鸭疫里氏杆菌hemH基因功能初步鉴定及其缺失株的转录组学分析

血红素是绝大多数细菌生长繁殖所必需的一种营养物质,其参与了细菌多种重要的生理过程。细菌可以通过自身合成和从外界摄取2种方式获得血红素。然而过多的血红素对细菌是有毒性的,细菌则会利用外排、螯合和降解等多种方式减轻血红素毒性。鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer, RA)是一种感染禽类的革兰氏阴性菌,前期研究表明该菌可通过转运的方式从外界环境摄取血红素。然而,是否该菌也可以自身合成血红素未知。基因组分析发现鸭疫里氏杆菌ATCC11845菌株中的基因RA0C＿RS08070编码铁螯合酶(ferrochelatase) HemH,是参与将铁插入卟啉中心,形成血红素的关键酶。hem H缺失后会导致铁离子和卟啉的积累,对细菌造成毒性。【目的】为鉴定Hem H在合成血红素中的功能及查找参与鸭疫里氏杆菌铁离子和卟啉解毒相关基因。【方法】本研究构建了RAATCC11845Δhem H缺失株,并检测亲本株和hem H缺失株在GCB以及GCB添加血红蛋白液体培养基中的生长情况;随后对亲本株和hem H缺失株进行转录组测序并进行比较分析。【结果】RAATCC11845Δhem H缺失...     

大肠杆菌-鸭疫里默氏杆菌高效穿梭质粒pFY02的构建和应用

鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)是引起鸭、鹅、火鸡等家禽传染性败血症及浆膜炎的主要病原。目前主要通过基因缺失及基因回补的方法对鸭疫里默氏杆菌的基因功能进行研究。然而,目前使用的穿梭质粒pLMF03存在结合转移效率低、酶切位点少等缺陷,不能用于所有鸭疫里默氏杆菌基因的回补。为解决这一问题,文中将结合转移位点oriT、鸭疫里默氏杆菌复制起始基因pRA0726ori、高表达启动子基因及多种酶切位点逐一克隆至质粒pPM5,构建了新的穿梭质粒pFY02。结果表明,该质粒能够稳定存在于鸭疫里默氏杆菌,且具有较高的结合转移效率。通过回补鸭疫里默氏杆菌tonB2基因缺失株表明,该质粒可用于鸭疫里默氏杆菌基因的回补。总之,文中构建的穿梭质粒pFY02更加完善了用于鸭疫里默氏杆菌基因回补的材料。     

血清2型鸭疫里默氏杆菌脂多糖单克隆抗体的研制及特性鉴定

【背景】鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)可感染雏鸭、鹅、火鸡等多种禽类,引起急性或慢性传染病。RA血清型众多且各血清型之间缺乏有效的交叉保护。细菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)位于革兰氏阴性菌细胞壁的外侧,其组成和结构变化决定了细菌表面抗原决定簇的多样性。【目的】制备血清2型鸭疫里默氏杆菌LPS单克隆抗体并对其特性进行研究。【方法】以血清2型RA NJ3株免疫BALB/c小鼠,细胞融合后以RA NJ3株LPS作为包被抗原,筛选出能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,通过体内诱生腹水法制备抗体,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测单克隆抗体效价,玻片凝集试验和Westernblot检测单抗特异性。【结果】获得两株能稳定分泌抗血清2型鸭疫里默氏杆菌LPS单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为8G5和8G10;两株单抗的亚型均为IgM/κ链。ELISA结果表明,8G5和8G10腹水效价分别为1:32 000和1:16 000。Western blot结果显示,两株单抗仅与血清2型RA菌株发生特异性反应,而与其他血清型RA菌株和禽源致病菌无反应性。【结论】研究获得的单克隆抗体具有良好的反应性和血清型特异性,可用于RA致病机制的基础研究和进一步建立RA血清型快速检测方法。     

基于响应面分析的高抗原活性鸭疫里默氏杆菌疫苗培养基的研制及其效果评价

【背景】鸭疫里默氏杆菌广泛存在于养殖场,引起雏鸭发生传染性浆膜炎,严重危害养鸭业的发展。【目的】提高鸭疫里默氏杆菌发酵培养水平和抗原活性,为鸭疫里默氏杆菌灭活疫苗的研制提供技术指引。【方法】利用单因素及响应面的试验设计方法,针对鸭疫里默氏杆菌进行疫苗培养基的研制,并探究不同发酵时间点该菌的抗原活性,选择抗原活性最高点时制备灭活疫苗,通过动物免疫保护试验评价疫苗免疫效果。【结果】使用研制的疫苗培养基发酵培养鸭疫里默氏杆菌,其活菌数能够达到4.68×1010 CFU/mL,较市面上该菌专用的培养基提高2.29倍。该菌发酵12 h后抗原活性达到最高,在此时制备的灭活疫苗诱导小鼠产生的抗体水平显著高于商品化灭活疫苗,攻毒保护率达到了100%。【结论】本研究研制的培养基具有优异的增菌效果,可作为生产鸭疫里默氏杆菌灭活疫苗抗原的发酵培养基,疫苗生产过程中可选择菌株抗原活性达到最高时收集菌体。     

鸭疫里氏杆菌hemH基因功能初步鉴定及其缺失株的转录组学分析

血红素是绝大多数细菌生长繁殖所必需的一种营养物质,其参与了细菌多种重要的生理过程。细菌可以通过自身合成和从外界摄取2种方式获得血红素。然而过多的血红素对细菌是有毒性的,细菌则会利用外排、螯合和降解等多种方式减轻血红素毒性。鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)是一种感染禽类的革兰氏阴性菌,前期研究表明该菌可通过转运的方式从外界环境摄取血红素。然而,是否该菌也可以自身合成血红素未知。基因组分析发现鸭疫里氏杆菌ATCC11845菌株中的基因RA0C_RS08070编码铁螯合酶(ferrochelatase)HemH,是参与将铁插入卟啉中心,形成血红素的关键酶。hem H缺失后会导致铁离子和卟啉的积累,对细菌造成毒性。【目的】为鉴定Hem H在合成血红素中的功能及查找参与鸭疫里氏杆菌铁离子和卟啉解毒相关基因。【方法】本研究构建了RAATCC11845Δhem H缺失株,并检测亲本株和hem H缺失株在GCB以及GCB添加血红蛋白液体培养基中的生长情况;随后对亲本株和hem H缺失株进行转录组测序并进行比较分析。【结果】RAATCC11845Δhem H缺失株不能在GCB培养基中生长,而在GCB培养基补充血红蛋白后生长良好。转录组测序及比较分析发现,与亲本株相比,hem H缺失株中有354个显著差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)。基因本体论(gene ontology,GO)功能富集分析发现差异表达基因主要富集在催化活性、生物调节和代谢过程等途径,京都基因和基因组百科全书(Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes,KEGG)通路富集分析发现差异表达基因主要富集在氨基酸代谢、氧化磷酸化和三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA cycle)等途径。【结论】Hem H参与了血红素的合成,hem H缺失后导致大量的基因表达改变来适应代谢的改变,为进一步研究鸭疫里氏杆菌的Hem H的功能奠定基础。     

鸭疫里默氏杆菌强、弱菌株外膜蛋白的比较蛋白质组学研究

应用双向电泳及质谱技术对血清2型鸭疫里默氏杆菌强毒株及其体外传代200代(RA200)的弱毒菌株的外膜蛋白进行比较蛋白质组学研究,借此分析鸭疫里默氏杆菌的外膜蛋白表达特点,研究差异表达蛋白与细菌毒力的关系.在实验中检测到血清2型鸭疫里默氏杆菌原代及其体外传代获得的弱毒菌株的外膜蛋白约表达60个蛋白质点(n=3),其中相差5倍以上3个.胶内酶解和肽质量指纹图谱分析后鉴定,W1为热休克蛋白Hsp20家族成员,W2、W3为转座酶,推测它们可能与里默氏杆菌的毒力密切相关.     

鸭疫里默氏杆菌流行菌株的分离鉴定及生物学特性

【背景】鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)是引起雏鸭、鹅、火鸡等多种家禽、野禽发生传染性浆膜炎的病原,在全世界范围内广泛存在,危害养禽业发展,造成严重的经济损失。【目的】了解国内RA的流行现状,探究该菌的生物学特性,更好地指导防控鸭疫里默氏杆菌病。【方法】对2020-2021年从山东省、河北省、广东省、山西省等地分离的RA疑似菌株进行PCR、生化和血清型鉴定,并根据药物敏感性结果分析耐药现象,根据半数致死量(median lethal dose,LD₅₀)测定结果分析致病力差异。【结果】共鉴定78株RA分离株,其中,血清1型4株、2型21株、10型11株、6型3株、7型17株,1株有交叉凝集现象,21株血清型未定型;药敏结果显示78株分离株对多粘菌素B、磷霉素、克林霉素等的耐药性最强,对头孢拉定、多西环素、呋喃唑酮、氟苯尼考等抗生素最为敏感,并且78株分离株均存在多重耐药性,其中77株耐药5重及以上;动物试验结果显示,RA的分离株致病力普遍较强,而且不同地区分离株、同地区不同分离株之间均存在差异,数株RA分离株的LD₅₀在10⁴-10⁷ CFU不等。【结论】RA在国内流行表现了强致病力及严重耐药情况,本研究结果为更好地预防控制、临床用药及后续致病机制研究提供了参考依据。     

江苏地区10株鹅源鸭疫里默氏杆菌的耐药性及致病性特征分析

[背景] 鸭疫里默氏杆菌感染是危害水禽业最严重的细菌传染性病之一,鹅源鸭疫里默氏杆菌病的发病率有逐渐增高趋势,给养鹅业带来了巨大经济损失。[目的] 为更好地预防控制鹅源鸭疫里默氏杆菌病、解决鹅养殖场临床用药问题及进一步探究鸭源和鹅源鸭疫里默氏杆菌之间的关系。[方法] 对江苏地区的发病鹅进行鸭疫里默氏杆菌的分离培养、多重PCR方法鉴定及生化试验,并对分离获得的10株鸭疫里默氏杆菌进行药敏试验、血清型鉴定及雏鸭致病性试验。[结果] 药敏试验结果显示,鹅源分离菌株对大观霉素、磺胺异噁唑、头孢曲松、头孢拉定、氟苯尼考最敏感,对新霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、庆大霉素和克林霉素耐药性最高且多重耐药性严重。血清型鉴定表明,江苏地区分离的10株鹅源鸭疫里默氏杆菌主要以血清型2型为主。雏鸭致病性试验表明,鹅源鸭疫里默氏杆菌分离株均引起雏鸭不同程度发病,其中3株鹅源临床分离株经1×10⁷ CFU/羽攻毒后可引起雏鸭100%的致死率。[结论] 为鹅源鸭疫里默氏杆菌的预防控制、临床治疗及进一步研究鸭源和鹅源鸭疫里默氏杆菌之间的关系提供依据。     

巨桉扩展蛋白EgrEXPA8和EgrEXPA10基因的克隆和表达特性分析

为探讨扩展蛋白在桉树生长发育中的作用,以在桉树初生生长到次生生长转换转录组测序中筛选出的差异表达基因EgrEXPA8和EgrEXPA10为基础,从巨桉(Eucalyptusgrandis)中克隆了2个扩展蛋白基因EgrEXPA8和EgrEXPA10,分别编码249和244个氨基酸,属于亲水蛋白,但Egr EXPA8稳定性高于Egr EXPA10。q RT-PCR分析表明,Egr EXPA8和Egr EXPA10基因均在幼叶和茎尖组织中表达量较高,在木质部和韧皮部表达量较低;且在茎顶端初生生长阶段表达量较高,而在下部次生生长节间表达量较低,可能其主要参与巨桉的初生生长或者负调控次生生长;另外在盐胁迫、茉莉酸甲酯处理下其均被抑制表达;而在水杨酸、缺硼、缺磷处理下均上调表达。这说明EgrEXPA8和EgrEXPA10在巨桉响应逆境胁迫时起到重要作用,且呈现出相似的调控方式。     

西葫芦CpWRKY2基因的分离、鉴定及其对非生物胁迫分析

为了解西葫芦(Cucurbita pepo)的WRKY2的功能，通过转录组测序技术从叶片中分离到1条长度为1 071 bp的c DNA，并对其进行序列分析。结果表明，该序列包含1个840bp的开放读码框，预测编码279个氨基酸，与中国南瓜(Cucurbita moschata,XM＿023091218.1)的WRKY核苷酸序列相似性为98.51%，命名为CpWRKY2 (GenBank登录号:XM＿023676898.1)。CpWRKY2定位于细胞核内，CpWRKY2蛋白包含有1个保守的WRKY结构域(第201～267位)，206～266位为WRKY蛋白DNA结合区域，锌指结构域(第232～264位)为C2H2型，且含有1个保守RTGHARFRRAP (第76～86位)氨基酸序列，属于典型的Ⅱd亚类WRKY家族蛋白。CpWRKY2基因上游启动子区域(ATG前的1 513 bp的序列)含有ARE、ABRE、MBS、TCrichrepeat和W-box等可能的胁迫响应顺式作用调控元件。CpWRKY2具有组织表达特异性，在花中表达量最高，其次为根和茎，在叶片和果实中的表达量较低。经5℃、10...     

圆柏大痣小蜂对祁连圆柏挥发物的触角电位和行为反应

圆柏大痣小蜂(Megastigmus sabinae Xu et He)是我国甘肃、青海和西藏等地祁连圆柏(Sabina przewalskii)球果的重要害虫,其危害严重影响了祁连圆柏的种子生产和育苗。为了筛选和鉴定圆柏大痣小蜂寄主定位相关的化学活性物质,利用动态顶空采集法和气相色谱-质谱联用技术(GC-MS,Gas Chromatograph-Mass Spectrometer)分析了祁连圆柏不同状态的球果和枝叶共5类挥发物样品成分,采用气相色谱-触角电位联用技术(GC-EAD,Gas Chromatography-Electroantennagram Detection)测定圆柏大痣小蜂对寄主挥发物的触角电位反应,利用Y型嗅觉仪测定圆柏大痣小蜂成虫对几种化学活性物质的行为反应。研究结果表明：5类挥发物中共鉴定到117种化合物,每类样品都含特有的植物挥发性成分,但其主要成分基本相似;有15种化合物能引起圆柏大痣小蜂的触角电位反应;圆柏大痣小蜂对其中的12种挥发物具有明显的趋向行为反应。3种共有成分月桂烯、桧烯和右旋萜二烯均对圆柏大痣小蜂具有吸引作用,一年生未产卵球果挥发物特有成分α...     

姜状三七根茎的皂苷类化学成分研究

为了解姜状三七(Panax zingiberensis)根茎的皂苷类化学成分,采用正相硅胶、反相硅胶和凝胶等色谱方法从其根茎的乙醇提取物中得到9个皂苷类化合物,根据理化性质和波谱数据,其结构分别鉴定为人参皂苷SL₁ (1)、人参皂苷Rh₁ (2)、三七皂苷R₈ (3)、竹节参皂苷IVa (4)、越南人参皂苷R₁₀ (5)、人参皂苷Rg₁ (6)、菠菜皂苷A 28-O-β-d-葡萄糖苷 (7)、齐墩果酸28-O-β-d-葡萄糖苷 (8)和姜状三七苷R₁ (9)。化合物1、3、5、7和8为首次从该植物中分离得到, 其中化合物5为奥克梯隆醇型皂苷,此类皂苷在该植物中未见报道。     

来源于中国南海的微生物新种乙醇速生杆菌(Celeribacter ethanolicus)多相分类研究

【目的】研究来源于南海海水的一株速生杆菌属菌株NH195^T 的多相分类。【方法】采用表型、基因型和化学分类方法,并综合系统发育关系结果,分析菌株NH195^T 的分类学地位。【结果】菌株NH195^T 是一株革兰氏阴性、好氧、杆状、无运动性细菌;能积累Poly-β-hydroxybutyrate (PHB);能在0.5%-10.0% (质量体积比) NaCl 浓度,pH 5.0-9.0 和20-40 ℃ 条件下生长,最适NaCl 生长浓度为1.0%-3.0%;氧化酶、触酶和脲酶反应结果阳性。菌株NH195^T 主要呼吸醌为Q-10,主要脂肪酸为C_18:1ω7c、C_18:1ω6c 和11 methyl C_18:1ω7c,主要极性脂为磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、双磷脂酰甘油、一个未知的氨基脂和两个未知脂。基因组G+C 含量为61.3 mol%。基于16S rRNA 基因的系统发育结果显示,菌株NH195^T 隶属于速生杆菌属;其与速生杆菌属标准菌株的16S rRNA 基因相似性范围为94.4%-97.7%。菌株NH195^T 与速生杆菌属标准菌株C. halophilus ZXM137^T 和C. indicus P73^T 的平均核苷酸一致性(ANI)分别为78.6%和78.0%;基于基因组数据计算所得的DNA 杂交同源率分别为26.1%和23.0%。【结论】基于表型和基因型结果,菌株NH195^T 代表了速生杆菌属一个新物种,命名为Celeribacter ethanolicus,标准菌株为NH195^T (CGMCC 1.15406^T=JCM 31095^T)。     

拟诺卡氏菌属放线菌研究进展

拟诺卡氏菌属是一个经典的丝状放线菌类群,在近十余年来获得了快速发展,目前已合格发表42个种、2个亚种。该菌群在土壤环境,尤其是天然高盐碱土样生境中广泛分布,同时从海洋、人居环境、临床样本、堆肥等生境中也能分离到。拟诺卡氏菌不仅能合成抗生素、酶抑制剂、生物表面活性剂等多种结构新颖的活性物质,而且还能产生多种具有潜在工业用途的酶,因此近年来引起了国内外学者的广泛关注。本文综述了拟诺卡氏菌分类学、生态分布与适应机制、代谢产物及遗传转化的研究进展,并对其研究趋势做了分析。     

致病疫霉PiSAK1的生物学功能分析

【背景】致病疫霉是引起世界范围内马铃薯晚疫病的重要病原菌。Stress-activated protein kinases (SAPKs)是一类胁迫激活的mitogen-activated protein kinases (MAPKs)，研究表明真菌SAPKs在调控细胞应答外界胁迫等方面有重要作用。致病疫霉中存在一个SAPK，即PiSAK1，其生物学功能并不明确。【目的】探究PiSAK1在致病疫霉生长发育、抵抗外界胁迫及侵染马铃薯过程中发挥的生物学功能。【方法】利用生物信息学手段分析PiSAK1的特性，通过RT-qPCR分析明确致病疫霉PiSAK1在不同发育阶段及侵染马铃薯不同时期的表达量，最后构建PiSAK1沉默、过表达菌株并测定其各项生物学表型。【结果】PiSAK1具有丝裂原活化蛋白激酶典型的Ser/Thr蛋白激酶催化结构域，并且与其他卵菌的SAPKs同属一个进化分支。致病疫霉PiSAK1分别在休止孢阶段、侵染马铃薯48 h时表达量最高，且0.3 mol/L NaCl及3 mmol/L H2O2胁迫刺激0.5 h后PiSAK1的表达量均显著升高。构建PiSAK1沉默、过表达菌株并测...     

Genome Analysis inNeurospora crassa;Cloning of Four Lociarginine-1(arg-1),methionine-6(met-6),unknown-7(un-7), andribosome production-1(rip-1) and Associated Chromosome Walking

We have cloned fourNeurospora crassagenes by complementation analysis. Cloned genes include thearginine-1(arg-1),methionine-6(met-6),unknown-7(un-7), andribosome production-1(rip-1) loci. Chromosome walks were initiated in ordered cosmid libraries from the cloned loci. A total of about 700 kb of theNeurosporagenome is covered in these walks.     

白粉菌BGP(TG)在不同抗性草地早熟禾叶片上的侵染过程观察

【背景】草地早熟禾(Poa pratensis)白粉病是气传性病害,种植抗病品种是防治白粉病最经济、环保和有效的方法。【目的】明确禾布氏白粉菌BGP(TG)在3个不同抗性草地早熟禾叶片上的侵染过程和乳突在草地早熟禾抗白粉病中起的重要角色。【方法】利用考马斯亮蓝染色结合显微镜观察的方法,对不同抗性的3个草地早熟禾品种进行白粉菌侵染过程观察,统计分生孢子形成次生芽管的速度、吸器和乳突的形成情况,分析白粉菌对不同抗性草地早熟禾侵染过程的差异。【结果】‘探险家’草地早熟禾病症较其他2个品种更为严重,禾布氏白粉菌BGP(TG)侵染不同抗性品种的侵染过程基本一致,但‘探险家’叶片上初生吸器形成早于其他2个品种;接菌1-2 d后,在‘太行’叶表面分生孢子形成5级芽管的速度显著低于‘探险家’和‘黑杰克’;接种1d后,‘太行’草地早熟禾有效乳突形成率显著高于‘黑杰克’(P<0.05),‘黑杰克’有效乳突形成率显著高于‘探险家’(P<0.05)。【结论】明确了白粉菌在草地早熟禾叶片上的侵染过程和乳突在草地早熟禾抵御白粉菌侵入过程中起的重要作用,为草地早熟禾白粉病的预防和防治提供了理论基础和参考...     

萱草响应非生物胁迫的研究进展

萱草是萱草属(Hemerocallis)多年生宿根花卉,被誉为中华母亲花,具有重要的观赏和药用价值。非生物胁迫导致光合效率降低,渗透调节物质浓度改变,活性氧(ROS)含量上升,膜系统持续受损,诱导AP2/ERF (APETALA2/ethylene-responsive element binding factors)、WRKY等家族基因的表达。该文综述了干旱、涝渍、盐碱、极端温度和重金属胁迫非生物胁迫因子对萱草形态学、生理生化及分子水平的影响,统计了各胁迫下的萱草抗性品种资源,认为地域与胁迫对萱草药用成分代谢变化的影响、抗逆相关基因调控网络与多种胁迫复合分子育种为未来的重点研究方向,为萱草资源开发利用与抗逆品种育种提供理论参考。