抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体可变区基因的5＇RACE扩增及序列分析

目的：克隆并分析抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体轻链和重链的可变区基因。方法：从分泌抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取总RNA,根据小鼠IgG恒定区序列设计特异性引物,通过5’RACE法扩增其轻链和重链的可变区基因,克隆入pMD18-T载体,测序并分析其可变区序列。结果：3株抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体的重链可变区基因序列全长均为423bp,编码141个氨基酸残基;轻链可变区基因序列全长均为393bp,编码131个氨基酸残基;在GenBank中对氨基酸序列进行比对分析,均符合小鼠IgG可变区基因的特征;根据Kabat法则对3株抗体轻链和重链可变区氨基酸序列进行分析,确定了3个抗原互补决定区、4个框架区和前导肽。结论：通过5＇RACE法得到了3株抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体轻链与重链可变区基因,为进一步研究抗体三维结构、人源化改造奠定了基础。     

甲型H1N1流感病毒血凝素单克隆抗体轻链和重链可变区基因的巢式PCR扩增及序列分析

目的：采用巢式PCR对甲型H1N1流感病毒血凝素单克隆抗体的轻链和重链基因进行扩增,对获得的基因进行序列分析,并找出克隆鼠Igκ轻链和重链可变区基因的通用方法。方法：设计22对扩增鼠Igκ轻链可变区和重链可变区基因的引物,对6株鼠抗人甲型H1N1流感病毒血凝素单克隆抗体的轻链和重链可变区基因进行克隆并测序,与NCBI公布的鼠免疫球蛋白序列比对分析。结果：巢式PCR方法可以有效避免单克隆抗体克隆过程的假基因,并且得到的单克隆抗体的氨基酸序列均符合鼠免疫球蛋白可变区特征。结论：建立了克隆鼠免疫球蛋白轻链和重链可变区基因的通用方法,为后期克隆鼠源性单克隆抗体的可变区基因提供了基础,并为研究甲型H1N1流感病毒血凝素与抗体的结合位点提供了实验数据。     

抗人肺腺癌单克隆抗体重,轻链可变区基因的分离克隆和序列测定

根据鼠免疫球蛋白重。轻链可变区基因ＦＲ１和ＦＲ４的序列保守性,化学合成了适于体外扩增Ｉｇ重、轻链可变区基因（Ｖ_Ｈ和Ｖ_Ｌ）的数对引物。以分泌抗人肺腺癌单抗的杂交瘤细胞株ＷＬＡ－２Ｃ４的基因组ＤＮＡ为模板,ＰＣＲ扩增Ｖ_Ｈ和Ｖ_Ｌ基因,分别克隆人ｐＵＣ１９载体。转化子经蓝、白斑筛选,酶切鉴定,双脱氧测序证实确为鼠单抗可变区基因,其中Ｖ_Ｈ基因全长为３４８ｂｐ,编码１１６ａａ,属重链ⅡＢ亚类;Ｖ_Ｌ基因全长３１８ｂｐ,编码１０６ａａ,属Ｋ轻链Ⅵ亚类。     

抗人CD3单抗重,轻链可变区基因的体外扩增,克隆和序列分析

根据免疫球蛋白重链和轻链可变区基因５＇端序列和Ｊ区序列,化学合成适合于体外扩增抗体重、轻链可变区基因的二对引物。从体外培养的ＯＫＴ３杂交瘤细胞中提取总ＲＮＡ,反转录生成ｃＤＮＡ,以ｃＤＮＡ为模板,分别加入合成的重、轻链可变区引物进行ＰＣＲ,扩增出抗体重、轻链可变区基因片段。将扩增产物分别插入ｐＵＣ１９质粒,筛选出阳性克隆,用链终止法进行ＤＮＡ序列测定。所测重链可变区基因全长３５７ｂｐ,编码１１９个     

用RACE技术扩增并克隆牛BMP4基因3′端序列

RACE技术是一项扩增基因末端序列的新技术。该研究从牛BMP4基因出发,以牛软骨的RNA为模板,按照不同物种BMP4基因的相似性设计特异引物,运用PCR和RACE技术扩增并获得了特异片段,该片段经PCR、酶切和测序验证,证实所克隆序列为牛BMP4的3′端序列,包含有1170bp组成的开放读码框(ORF),编码389个氨基酸,3′非编码区121bp个核苷酸和poly(A)15。同源性分析结果表明,牛BMP4 cDNA最大开放读码框所推测的氨基酸序列与已知人、小鼠、大鼠、狗、羊和鸡等真核生物BMP4氨基酸序列进行比较,分别有94.5%、93.1%、91.9%、87.4%、94.2%、79%的同源性。这为克隆其他物种的BMP4基因提供了依据,同时牛骨形态发生蛋白的测序为我们更好的理解牛的生骨机理提供帮助。     

抗炭疽保护性抗原单克隆抗体可变区基因的克隆及序列分析

目的:克隆并分析抗重组炭疽芽孢杆菌保护性抗原(rPA)单克隆抗体4B2、5E1和2A8轻、重链可变区基因。方法:从分泌抗rPA特异性单抗的杂交瘤细胞株4B2、5E1和2A8中提取总RNA;利用RT-PCR技术克隆抗rPA单抗4B2、5E1和2A8的VL、VH基因,并将其连入pMD18-T载体中进行测序分析。结果:4B2VL基因全长378bp,VH基因全长414bp;5E1VL基因全长420bp,VH基因全长426bp;2A8VL基因全长384bp,VH基因全长342bp。通过分析,这些基因均符合小鼠IgGV区基因的特征,含有4个框架区、3个抗原互补决定区,而且抗体特征性的半胱氨酸残基的数量和位置也正确。结论:克隆了抗rPA单抗4B2、5E1和2A8的VL、VH基因,为下一步构建多种形式的基因工程抗体奠定了良好的基础。     

利用RACE技术扩增大豆抗病基因同源cDNA 5′末端序列

利用抗病基因保守序列筛选大豆cDNA文库,获得一抗病基因同源cDNA片段,命名为KR3-1。根据KR3-1设计两个基因特异引物（GSP 和 NGSP）,分别与通用引物(UPM)和巢式通用引物（NUP）共同扩增,成功地克隆到了该基因的5′末端序列。该扩增片段长447 bp,与已知序列重叠部分为129 bp。 Abstract:Based on part of a known partial cDNA sequence of a disease resistance gene homolog,KR3-1,obtained by screening a cDNA library from soybean,5′-RACE-PCR was carried out with gene specific primers and universal primers.After the nested PCR reaction,an amplified fragment of 447 bp in length which overlapped the known KR3-1 sequence by 129 bp was obtained subsequently.Thus,a 5′ cDNA end of KR3 was successfully cloned.     

抗人活化血小板单克隆抗体SZ—51可变区基因的克隆与序列分析

抗人活化血小板单克隆抗体ＳＺ—５１可变区基因的克隆与序列分析顾建明,张效民,万海英,李佩霞,Ｍ．Ｐ．ＬＥＦＲＡＮＣ阮长耿（江苏省血液研究所,苏州医学院血栓与止血研究室,２１５００７）法国Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ分子遗传研究所关键词单克隆抗体,免疫球蛋白...     

β-淀粉样肽前体蛋白的结构及生物活性

β－淀粉样肽前体蛋白是ＡＤ患者脑内神经炎斑的主要成分－－β－淀粉样肽的代谢前体。其基因定位于人第２１号染色体,经可变剪接可产生１０种转录物。β－淀粉样肽前体蛋折广泛表达于几乎所有的神经元和非神经元组织,具有一个较长的细胞外肽链、单一跨膜区及一个短的胞内区域。研究表明,它具有神经营养、调节细胞粘附及抑制丝氨酸蛋白酶等多种生物活性。现有资料还提示β－淀粉样肽前体蛋白可能是细胞因子（或其类似物）的受体。     

抗胃癌鼠单抗3Gg轻链可变区基因的克隆和序列分析

本文报导了用ＰＣＲ方法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）从抗胃癌单抗３Ｇｇ杂交瘤细胞的基因组ＤＮＡ中,扩增出３３３ｂｐ的轻链可变区基因,克隆至ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ⅱｋｓ ＋／－载体上,筛选到阳性克隆。核苷酸序列分析表明：有５３％的核苷酸序列与抗体基因库中的一般序列相符。证明已获得抗胃癌单抗轻链可变区基因。     

抗人AEG-1单克隆抗体可变区基因克隆及序列分析

AEG-1基因位于人染色体8q22,编码582个氨基酸,参与多种信号转导途径并与多种恶性肿瘤的发生、发展及生物学表型密切相关。为更好地探讨AEG-1生物学功能,以纯化的pGSTag-AEG-1蛋白免疫BALB/c小鼠,应用细胞融合技术并经筛选及鉴定,获得了分泌抗人AEG-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E3;Western blot及免疫组化证实该细胞株分泌的单克隆抗体能与肿瘤细胞中AEG-1蛋白特异性结合;RT-PCR方法从1E3细胞中克隆出抗AEG-1抗体的VH和VL基因片段,通过测序分析、碱基和蛋白序列的比对确认该株抗体为鼠源性IgG的轻、重链可变区基因。进一步运用Kabat System在线分析系统对VH和VL基因进行结构分析,确证FWRs和CDRs的结构完整,VH编码117个氨基酸;VL编码119个氨基酸,属于轻链κV家族。实验结果为进一步研究AEG-1与恶性肿瘤发生、发展的关系及在其临床诊断中的应用奠定了基础。     

猪瘟病毒E2蛋白表位分析及其单克隆抗体可变区cDNA测序

猪瘟病毒(CSFV)囊膜表面结构糖蛋白E2(gp55)是诱导机体产生中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白。E2和E^ms与细胞表面受体的相互作用介导病毒对细胞的感染过程。本文采用抗CSFV(Alfort Tiibingen毒株)E2结构蛋白的单克隆抗体c2410和a18,淘选噬菌体展示的12肽随机肽库,对CSFV E2蛋白表位进行分析。研究发现：单克隆抗体c2410和a18识别同一线性表位,定位于E2蛋白的832-837位氨基酸(SPTTLR),但二者在ELISA和免疫印迹分析中对不同表(拟)位的反应性存在差异。自杂交瘤细胞中提取总RNA,对单克隆抗体轻链和重链可变区cDNA进行序列分析。结果表明：c2410和a18虽然来源于同一批次融合的杂交瘤细胞系,识别同一表位,但仍属于不同的单克隆抗体。     

抗人CD3单抗重、轻链可变区基因的体外扩增、克隆和序列分析

根据免疫球蛋白重链和轻链可变区基因５’端序列和Ｊ区序列,化学合成适合于体外扩增抗体重、轻链可变区基因的二对引物。从体外培养的ＯＫＴ３杂交瘤细胞中提取总ＲＮＡ,反转录生成ｃＤＮＡ,以ｃＤＮＡ为模板,分别加入合成的重、轻链可变区引物进行ＰＣＲ,扩增出抗体重、轻链可变区基因片段。将扩增产物分别插入ｐＵＣ１９质粒,筛选出阳性克隆,用链终止法进行ＤＮＡ序列测定。所测重链可变区基因全长３５７ｂｐ,编码１１９个氨基酸,轻链可变区基因全长３２１ｂｐ,编码１０７个氨基酸。     

乙酰胆碱酯酶(AChE)与β淀粉样肽(Aβ)的相互关系

老年性痴呆症(Alzheimer‘s Disease,AD)是一种慢性的、进行性的神经系统退行性疾病。主要特征为各方面智力的损伤,包括学习记忆、语言、读写、行为,以及对周围环境的识别,最终可导致死亡。它有三大病理特征：(1)主要由β淀粉样肽(β—amyloid peptide,Aβ)沉积而成的淀粉样斑;(2)由高度磷酸化的Tau蛋白组成的神经纤维缠结;(3)神经元及神经突触的丢失。在AD疾病的发病机制及治疗的对策中,AD和乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)都有重要的作用。近年来对Aβ和AChE在AD疾病发生发展过程中相互作用的研究有了越来越多的报道。在此,作者对Aβ和AChE的关系作一综述。     

促进β-淀粉样肽聚集为目标的阿尔茨海默病治疗新策略探讨

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种具有复杂病理学特征的老年失智症.淀粉样蛋白级联假说与寡聚体毒性假说在解释AD病理机制方面占据主导地位. AD患者数量庞大,但目前尚未发现治疗AD的有效疗法,多数药物在Ⅲ期临床试验的结果不够理想.本文对影响β-淀粉样肽(β-amyloid, Aβ)聚集的国内外相关研究进展进行总结,并阐述小分子化合物加速Aβ纤维形成过程的可能机理.这一过程与传统疗法相悖却在动物模型中取得了相当好的疗效,意味着促进Aβ聚集可能成为AD治疗的新策略,为新药开发指明了新方向.     

APP17肽对β—淀粉样肽及有关蛋白质表达的影响

本研究选用人类野生型SY5Y及SY5YA4CT基因转染细胞,应用免疫沉淀Western Blot等分析方法研究APP17肽对β-淀粉样肽及有关蛋白质如IDE,NT－3,NF表达的影响,探讨其影响神经元存活和退变的可能机理,结果发现,APP17肽能抑制转染细胞Aβ胞外分泌,并能促进野生型SY5Y细胞中IDE的表达,同时对内源性NT－3和NF的表达也有促进作用,提示：APP17肽抑制Aβ分泌和促进内源性神经营养因子的表达可能是其支持神经元存活,改善神经退变的机理之一。     

抗乙型脑炎病毒单抗重链可变区基因的筛选和鉴别

为了制备抗乙型脑炎病毒的人-鼠嵌合抗体,以分泌抗乙型脑炎病毒单抗的51-8杂交瘤细胞株为材料,分离这一单抗的重链可变区基因。杂交瘤细胞的大分子量DNA经Bam HI部分酶切后,以λEMBL-3为载体,构建了总数为2×10~7pfu的基因文库。以抗乙脑病毒单抗重链可变区cDNA为探针,从360000个噬菌斑中筛选出9个阳性斑,经点杂交及Southern杂交证明它们都含有重链可变区基因的片段。进一步以J_(11)探针(含J_3、J_4和重链增强子)对其中4个重组体进行鉴别。经EcoRI酶切后,有3个重组体含有与肝细胞和Sp2/0细胞相同的3.8kb片段,而第4个重组体(λ8a4)没有这一片段,却有一个4.5kb片段,这是在肝细胞和Sp2/0细胞中不存在的。从而证明前3个重组体的插入片段是未经重排的重链可变区基因片段,而λ8a4中的插入片段含有经过重排的功能性可变区基因。这一4.5kb片段不能与含有J_1—J_2的探针杂交,却同时含有V_H、J,或/和J_4和增强子。进一步证明,这是一个功能性的可变区基因。因此,将这一4.5kb片段分离出来之后,在pUC19中亚克隆并作酶切图。为构建抗乙脑病毒的人-鼠嵌合重链基因奠定了基础。