慢性蜜蜂麻痹病病毒核酸与蛋白质组分的研究

从自然感染的意大利麻痹病蜂(APis mellifera)头部,经二次差速离心与蔗糖梯度离心获得纯化的慢性蜜蜂麻痹病病毒(CBPV)。纯化的CBPV制备物感染正常蜜蜂,4天后出现典型的麻痹症状,接着死亡,平均死亡率分别为95％与100％。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,二次差速离心初步纯化的病毒制备物含有多条蛋白带,而蔗糖密度梯度纯化的病毒制备物仅含有单一的多肽带。5％、7.5％与10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,均检测出一种病毒蛋白质,分子量大约为24,200道尔顿,而且不同凝胶浓度检测的蛋白质分子量相近。慢性蜜蜂麻痹病病毒核酸也用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,结果表明,凝胶中有5条带,对核酸酶敏感,证明该病毒含有5个单股RNA组分。对慢性蜜蜂麻痹病病毒的基因组结构进行了讨论。     

北京地区六种蜜蜂病毒病的流行病学研究

【目的】对蜜蜂的6种病毒:以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus,IAPV)、残翅病毒(Deformed wing virus,DWV)、囊状幼虫病病毒(Sacbrood virus,SBV)、急性蜜蜂麻痹病毒(Acute bee paralysis virus,ABPV)、黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)、慢性麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,CBPV)在北京地区的流行情况进行调查,以期为该地区蜜蜂病毒病的防控提供一定的理论依据。【方法】应用多重RT-PCR法确定上述6种病毒在该地区的感染情况,并通过序列分析确定特异性。【结果】在所有检测样本中均未检测到急性麻痹病病毒和慢性麻痹病病毒,感染率最高的是以色列急性麻痹病毒,其次是残翅病毒。检测的样本普遍存在混合感染。【结论】以色列急性麻痹病毒、残翅病毒、囊状幼虫病病毒、黑蜂王台病毒4种病毒可能在北京地区广泛分布。     

慢性蜜蜂麻痹病毒半套式PCR检测方法的建立

参考NCBI(National Center of Biotechnology Information)已发表的慢性蜜蜂麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,CBPV)的全基因序列,设计3条检测CBPV的特异性引物,建立CBPV半套式PCR(Polymerase Chain Reaction)检测方法,对其外引物退火温度(52、54、56和58℃)、内引物退火温度(48、50、52和54℃)、引物浓度(0.1、0.2和0.4mmol/L)和ExTaq酶体积(0.25、0.5和1μL)进行优化,并对优化后的方法进行了特异性、敏感性验证,同时,利用该方法对20份临床样品进行检测。结果表明,该半套式PCR最佳外引物退火温度、内引物退火温度、引物浓度和ExTaq酶体积分别为56℃、50℃、0.2mmol/L和0.25μL;感染CBPV与健康蜜蜂、急性蜜蜂麻痹病毒(Acute paralysis virus,ABPV)、中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese sacbrood bee virus,CSBV)、黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)、蜜蜂残翼病毒(Deformed wing virus,DWV)的cDNA均无交叉反应,检出最低下限为10-3pg;从20份临床样品中检出4份阳性。说明建立的CBPV半套式PCR检测方法具有快捷、敏感、特异等优点,可用于CBPV感染的临床诊断和流行病学调查。     

中华绒螯蟹呼肠孤病毒样病毒病研究

为了探讨中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)颤抖病的发生原因,从表现出颤抖症状的中华绒螯蟹中初步分离纯化出一种病毒,人工感染健康触,出现明显的阳性反应,并从人工感染的蟹的血液、肠道、性腺等组织中检测到病毒,表明分离到的病毒为中华绒螯蟹的病原 ,且对野生锯齿华溪蟹(Sesarnadehanni)也具感染性.电镜观察结果显示该病毒粒子呈球状,无囊膜,大小为55nm左右.病毒核酸在1%琼脂糖凝胶电泳中,电泳图谱呈现3/3/4/2型,总分子量约20kb.该核酸对DNaseⅠ不敏感,对RNase敏感,推测病毒核酸为dsRNA,从病毒形态大小、病毒核酸等特性初步确定该病毒为呼肠孤病毒样病毒(Reovirus-like Virus).该研究为探讨中华绒螯蟹颤抖病的发生原因及防治方法有很大的指导意义.     

基于TaqMan探针的蜜蜂囊状幼虫病病毒荧光PCR检测方法的建立和应用

为建立快速有效的蜜蜂囊状幼虫病检疫方法, 依据TaqMan荧光标记探针技术原理, 针对蜜蜂囊状幼虫病病毒保守序列, 设计出一对特异性引物和一条探针, 建立了一种快速检测蜜蜂囊状幼虫病病毒的荧光PCR方法。该方法对蜜蜂囊状幼虫病的检测具有较好的特异性, 与蜜蜂急性麻痹病病毒、蜜蜂慢性麻痹病病毒、蜜蜂残翼病病毒和黑蜂王台病病毒之间均无交叉反应。检测灵敏度可达1.0×10²拷贝/μL阳性质粒, 可对低病毒含量的样品进行准确检测。重复性和稳定性试验结果显示, 变异系数为1.6%, 说明该方法具有较好的重复性和稳定性。应用该方法对蜜蜂及蜂制品进行检测, 结果显示所建立的荧光PCR检测方法4 h内即可报告检测结果, 该方法具有快速、灵敏、特异及重复性好等优点, 适用于蜜蜂及其制品中蜜蜂囊状幼虫病病毒的快速检疫。     

一步法RT-PCR和两步法RT-PCR对蜜蜂病毒诊断研究的比较

【目的】探讨适合蜜蜂病毒病诊断的RT-PCR技术。【方法】从感染蜜蜂以色列急性麻痹病毒、残翅病毒、囊状幼虫病毒、急性麻痹病毒、黑蜂王台病毒以及慢性麻痹病毒的阳性样品中,分别提取这6种病毒的RNA。然后,同时应用一步法RT-PCR和两步法RT-PCR的反应体系对6种病毒扩增,并对两种方法的灵敏性进行比较和分析。【结果】上述两种方法分别得到158(IAPV)、269(DWV)、342(SBV)、460(ABPV)、536(BQCV)和774 bp(CBPV)的扩增片段,测序结果证实扩增片段符合预期。两步法RT-PCR可检测到更低浓度的病毒颗粒。【结论】结果表明,该2种方法均可快速、有效地诊断蜜蜂病毒。但两步法RT-PCR灵敏性更高。     

中华绒螯蟹呼肠孤病毒样病毒病研究

为了探讨中华绒螯蟹（Ｅｒｉｏｃｈｅｉｒ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）颤抖病的发生原因,从表现出颤抖症状的中华绒螯蟹中初步分离纯化出一种病毒,人工感染健康触,出现明显的阳性反应,并从人工感染的蟹的血液、肠道、性腺等组织中检测到病毒,表明分离到的病毒为中华绒螯蟹的病原,且对野生锯齿华溪蟹（Ｓｅｓａｒｎａ〈Ｈｏｌｏｍｅｔａｐｕｓ〉ｄｅｈａｎｎｉ）也具感染性。电镜观察结果显示该病毒粒子呈球状,无囊膜,大小为５５ｎｍ     

安徽省七种蜜蜂病毒的发生与流行研究

【目的】调查安徽省内7种常见蜜蜂病毒:蜜蜂畸翅病毒(Deformed wing virus,DWV)、以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus,IAPV)、急性蜜蜂麻痹病毒(Acute bee paralysis virus,ABPV)、慢性麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,CBPV)、黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)、囊状幼虫病病毒(Sacbrood virus,SBV)、克什米尔病毒(Kashmir bee virus,KBV)的感染发生情况,为安徽养蜂业可持续健康发展提供理论依据。【方法】运用反转录RT-PCR和序列分析比对的方法对安徽省内21个乡镇中的38个蜂场蜜蜂样品进行研究分析,以获得以上7种蜜蜂病毒的特异性发生情况。【结果】意大利蜜蜂Apis mellifera蜂场感染率:DWV(64%),IAPV(43%),CBPV(32%),ABPV(14%),BQCV(11%);中华蜜蜂Apis cerana蜂场感染率:DWV(80%),IAPV(40%),CBPV(30%),ABPV(10%),BQCV(0)。SBV和KBV在所有的蜜蜂样品中均未检测到。【结论】DWV,IAPV,CBPV,ABPV,BQCV在安徽省内大范围都存在发生流行现象,SBV和KBV对安徽蜜蜂的潜在危害可能性小。     

兔细小病毒肺炎的诊断与防治

兔细小病毒肺炎(常称兔瘟)病原体为一种新RNA病毒,是1984年首次在我国发现的一种家兔烈性传染病。本病来势凶猛,传播迅速,流行面广,病程短,发病率(90—100%)和死亡率(90%以上)极高。病兔、死兔、隐性感染兔为主要传染源,成年兔发病急,死亡快,死亡率最高;育成兔死亡率稍低;哺乳期仔兔很少发病死亡。感染兔无性别差异。一年四季均可发病,春冬常见,主要经过消化道及呼吸道传播。发病机制至今尚不清楚。许益民等(1986)认为,病毒感染兔后作用于靶细胞一血管内皮细胞,病毒毒素侵害并损伤血管内皮细胞而启动体内的凝血机制和继发性纤溶而导致弥散…     

克什米尔蜜蜂病毒(KBV)研究进展

克什米尔蜜蜂病毒(Kashmir bee virus, KBV)作为一种毒力较强的蜜蜂急性病毒,自20世纪70年代被分离鉴定以来,已发现其广泛侵染世界各地的东方蜜蜂Apis cerana和西方蜜蜂Apis mellifera。KBV在蜂群内通过垂直和水平两种方式进行传播,且狄斯瓦螨Varroa destructor在其中扮演着重要角色,这使得KBV的分布范围持续扩散。目前已报道的病毒宿主除蜜蜂外,其还可侵染熊蜂、胡蜂等多种野生授粉昆虫。同时,KBV作为一种典型的双顺反子病毒科病毒,由于其在分子生物学上与同科的蜜蜂急性麻痹病毒(acute bee paralysis virus, ABPV)和以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus, IAPV)间的高相似性,对该病毒流行性的调查与检测、分类等研究的混乱局面也接踵而至。本文对过去40多年来的KBV相关研究进行综述,以期为KBV及类似昆虫病毒的后续研究提供一定的参考和借鉴,促进养蜂业的健康发展。     

感染囊幼病的工蜂咽下腺细胞的超微结构的变化

前言 中华蜜蜂囊幼病是我国养蜂业的一种重要病毒病,发病率很高,有的地区造成大量的幼虫死亡,给我国养蜂生产带来一定的危害,为了对防治病害提供科学的依据,我们首先对该病病原进行了分离、提纯及电子显微镜的研究等工作。发现该病毒对幼虫和成蜂,尤其对工蜂体内各个器官都有程度不同的影响。在幼虫发病期症状特别明显,病幼虫身体松软多水,其表皮容易破裂,当悬挂幼虫时其幼虫末端积聚有透明的液滴,在巢房内幼虫头部尖并变成黑色,头部稍微向上抬起呈船形。死后的幼虫干涸变为褐色的外壳留于巢房内,当感染的幼虫全部封盖后,巢房盖的中央有一小孔,这些异常的变化都是囊幼病的典型症状。幼虫症状虽很明显,但工蜂感染病毒后在外部形态上却没有明显     

蜜蜂以色列急性麻痹病毒(IAPV)研究进展

2006年冬季至2007年春季,美国发生了大范围的蜜蜂突然消失现象,类似的情况也发生在欧洲的部分地区,引发了严重的授粉危机。科学家对此展开了深入细致的研究并推测以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysisvirus,IAPV)很可能是蜂群崩溃失调病(colony collapse disorder,CCD)的致病因素。随着研究的深入,对CCD的致病因素及其发生机制有了更深入的认识,并趋向于认为多方面的致病因素可能导致了CCD的发生。本文综述了目前国内外对IAPV的研究进展。     

蜜蜂畸翅病毒的传播方式

一种常见蜜蜂病毒转移途径的发现,使科学家们发现数10亿蜜蜂死亡的原因。蜜蜂畸翅病毒（Deformed wing virus,DWV）通过一种叫Varroa的寄生螨,由成年蜜蜂传染给幼蜂。但是研究还表明,蜜蜂畸翅病毒不会在Varroa体内复制,研究结果发表在7月份出版的《普通病毒学杂志》（Journal of General Virology）上。     

兔的一种新病毒 IlI.兔出血症病毒形态的超微结构和抗原性的研究

1986年春,武汉市第二制药厂(WSPMM)试验用家兔突然口鼻渗出鲜血,几乎全部猝死。作者观察了罹病死亡的症状,认为此病例与黄印尧等所报道的相同。湖北省中医药研究院(HTCMI)也发生此病的流行。作者对这两种不同来源的病料,进行相同的处理,提取病毒粗纯物,回接同种动物,可引起同样典型的发病症状。进一步将死亡兔的肝、睥等脏器组织匀浆。经低速、高速、超速和蔗糖密度梯度离心后制样,电镜观察可见典型的病毒柱子。以上两种病毒粒子制备的抗血清和南京农业大学的兔出血症病毒抗原在双扩散沉淀中,产生典型的沉淀反应,说明三种病毒抗原的一致性。但是湖北株、南京农业大学病毒株抗原和日本细小病毒的抗血清,在双扩散反应时均无沉淀反应。湖北株病毒的形态大小、超微结构、外壳蛋白的 多肽和血清学特性,均不同于标准兔细小病毒,可能是一新的病毒。     

狄斯瓦螨和蜜蜂病毒对意大利蜜蜂蜂群越冬的影响

越冬期是蜂群损失最主要的阶段.通过比较分析45个意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica蜂群在繁殖越冬蜂前的狄斯瓦螨Varroa destructor寄生率和病毒感染情况、越冬表现及越冬期存活蜂群的病毒感染情况等,探究与越冬期蜜蜂健康紧密相关的影响因素.结果表明,繁殖越冬蜂前蜂群的狄斯瓦螨寄生率与蜜蜂残翅病毒(DWV)和以色列急性麻痹病毒(IAPV)基因组拷贝数呈中等线性相关关系(pDWV=0.003,pIAPV=0.001),且狄斯瓦螨寄生率低于9％的蜂群与DWV感染程度相关性更高,而寄生率高于9％的蜂群与IAPV的相关性更高.越冬期死亡蜂群在繁殖越冬蜂前的狄斯瓦螨寄生率和IAPV病毒基因组拷贝数均显著高于存活蜂群.狄斯瓦螨和IAPV是本次实验中意蜂蜂群越冬期健康的首要影响因素.结合狄斯瓦螨寄生率和IAPV基因组拷贝数的正相关性,本研究认为在繁殖越冬蜂前将蜂螨寄生率控制在较低水平(9％以下)能有效减少越冬期意蜂蜂群损失.     

两例输入性登革病毒合并基孔肯雅病毒感染实验室检测

对不明原因发热病人开展登革病毒和基孔肯雅病毒合并感染的检测,明确合并感染的可能性,为防御这两种虫媒传染病的传播提供依据。通过流行病史调查,临床症状和实验室检测对两名从泰国普吉岛旅行归来的发热病人进行了登革病毒和基孔肯雅病毒感染的诊断。两名患者在泰国旅行停留10天,在此期间两人均有蚊虫叮咬史。回国3天后两患者相继出现高热症状(39℃以上),且伴有皮疹,肌肉酸痛和乏力。实验室血常规检测发现轻度血小板降低伴淋巴细胞减少,登革病毒IgG/IgM快速诊断试剂盒检测发现一名患者登革病毒IgM阳性。实时荧光RT-PCR检测证实两患者血液中登革病毒和基孔肯雅病毒核酸均阳性,同时用RT-PCR方法扩增获得了登革病毒C-prM蛋白部分基因,经测序和同源性分析,证实感染登革病毒属于Ⅰ型登革热病毒。这是我国首次出现的输入性登革病毒合并基孔肯雅病毒感染病例,本研究建议对流行病史和临床症状满足的病例要同时进行两种病毒的实验室检测。     

兔出血症病毒体外复制的研究

在几种动物细胞上,采用同步感染的方法研究了兔出血症病毒(RHDV)的复制特性。病毒感染细胞后(PI)48—72小时可观察到明显的细胞病变,血凝效价可增高5—10倍。病毒对细胞传代代数不同,敏感性也不同。在兔婴肾(RK)和兔婴肺(RL)细胞上以4—8代最为敏感。采用免疫荧光染色法,经病毒感染48—72小时的细胞中可观察到特异性荧光。细胞增殖的病毒经PEG-DS浓缩,Sepharose 4B柱层析提纯后,在电镜下可观察到完整的病毒粒子,将此病毒回接健康实验兔可致100％死亡。免疫双扩散和免疫电泳试验表明,细胞增殖的病毒抗原与来自病兔肝的RHDV抗血清之间产生明显的沉淀带。SDS-PAGE分析病毒获得四条多肽,其分子量大小与病兔肝组织提取的病毒蛋白多肽分子量相比略有差异。     

河蟹颤抖病病毒的分离纯化及其动物致病性试验

将人工复制发病的河蟹(中华绒螯蟹)组织匀浆,离心上清经聚乙二醇(PEG 6 000)沉淀,再经分子筛层析,分部收集分别测定256～300nm的吸光值.各收集峰用PEG20000,于4℃浓缩,制作负染标本经透射电镜观察,发现在第一峰浓缩液中存在大量球状病毒颗粒,大小50～100nm.用纯化的病毒进行动物致病性试验,接种石蟹(锯齿华溪蟹)发生"颤抖病",并用ELISA双抗体夹心法进行检测,显示感染石蟹较对照石蟹有明显差异.     

一种新的蜜蜂细菌性幼虫病病原的分离鉴定

2005年早春,在浙江部分地区出现了一种严重的蜜蜂细菌性幼虫病,该病导致蜜蜂幼虫颜色发黄,失去光泽;严重时幼虫死亡腐烂。从10批发病死亡幼虫样品中,分离得到并保存了5类纯培养物。通过蜂群接种试验和实验室人工培养的幼虫接种,确定L2菌株能引起与自然发病相似的症状,且能从接种发病的幼虫上再次分离到相同菌株,证明L2菌株是该蜜蜂细菌性幼虫病的致病菌。进一步对分离到的该致病菌从发病特征、病原形态学、生理生化特性、16SrRNA序列等方面进行了分析鉴定,结果显示:该菌株属于肠球菌属的屎肠球菌(Enterococcusfaecium),不是目前报道的任何一种已知蜜蜂细菌性幼虫病的病原。     

蜜蜂残翅病研究进展

蜜蜂残翅病病毒(Deformed Wing Virus, DWV)是蜜蜂残翅病的病原体,能够侵染各个发育阶段的蜜蜂,严重时导致蜂蛹发育缓慢,成蜂翅膀畸形、体型萎缩、行动乏力,蜂群早衰;不严重的隐形感染也会缩短蜜蜂寿命。DWV借助于狄斯瓦螨Varroa destructor在全球广泛传播,并产生DWV-B和DWV-C等变异体,它们的共同作用促使蜂群群势急剧衰弱,是导致"越冬蜂群的消失(OCL)"和"蜂群崩溃失调症(CCD)"的主要病因之一,给养蜂业造成巨大损失,而目前尚没有特异性的有效治疗药物。DWV的自身特征、与狄斯瓦螨的关系、以及单独或者和狄斯瓦螨共同作用对蜜蜂的影响等研究都是开发防治技术方法的基础,本文从生物学、流行学、病理学和防治技术等方面对残翅病病毒的最新研究成果进行了综述。