PRKAG2基因新突变体重组腺病毒载体的构建及其在心肌细胞中的表达

目的:构建携带人全长PRKAG2基因新突变体(PRKAG2 G100S)及增强型绿色荧光蛋白报告基因(EGFP)的重组腺病毒载体,并将其在乳鼠心肌细胞中表达.方法:利用Invitrogen的GatewayTM技术,通过重叠PCR技术将目的基因突变体PRKAG2G100S-IRES-EGFP及野生型PRKAG2-IRES-EGFP定向克隆至入门载体pDONR221上,然后与腺病毒载体pAd/CMV/V5-DEST重组反应,形成包含目的基因及EGFP的腺病毒表达克隆.经筛选阳性表达克隆并测序验证后,Pacl酶切、包装、扩增、纯化获得携带EGFP及PRKAG2基因的重组体腺病毒.病毒PCR鉴定并将其感染原代培养的SD乳鼠心肌细胞.用Western blot技术检测PRKAG2蛋白的表达.结果:成功构建了携带人PRKAG2 G100S及EGFP基因的重组腺病毒,病毒的滴度为8.4×108 pfu/ml.荧光显微镜下可见Ad-PRKAG2 G100S重组体腺病毒感染后的乳鼠心肌细胞表达EGFP而发出绿色荧光,PCR证实重组腺病毒载体构建成功,Western blot证明PRKAG2蛋白在乳鼠心肌细胞中过表达.结论:成功构建了携带EGFP基因的Ad-PRKAG2 G100S重组腺病毒载体并将其在乳鼠心肌细胞中正确表达,为今后突变体PRKAG2基因的功能研究奠定了基础.     

重叠延伸PCR法构建小鼠IL-35单链融合基因及其真核表达载体

目的:构建小鼠IL-35单链融合基因及其真核表达载体.方法:将10 ug LPS和等体积的完全福氏佐剂乳化后皮下注射C57BL/6小鼠,7天后,取小鼠脾脏,提取脾细胞总RNA,通过RT-PCR克隆小鼠EBI3和IL-12p35 cDNA;采用重叠延伸PCR,通过编码疏水性多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序列连接小鼠EBI3全长基因和IL-12p35成熟肽基因,构建小鼠IL-35单链融合基因(Inouse sigle chain IL-35,mscIL-35),并将其克隆至pcDNA3.1/V5-His TOPO TA载体.通过酶切和测序鉴定阳性重组载体.结果:DNA序列分析结果表明:小鼠IL-35单链融合基因中EBI3、IL-12p35和linker的连接顺序、方向及序列完全正确.结论:成功构建了小鼠IL-35单链融合基因及其真核表达载体,为进一步探讨IL-35的生物学功能奠定了基础.     

Cloning and identification of APX gene from Isatis indigotica

为进一步研究菘蓝APX基因的功能,构建了菘蓝APX基因真核表达载体.从菘蓝植株中提取总RNA,逆转录为cDNA,根据APX基因在该类植物中的同源性设计简并引物,利用PCR方法钓取目的基因,将目的基因与T载体连接,PCR检测阳性克隆,同时菌液送往测序公司进行测序.结果表明:测序片段的生物信息学分析证实了该序列与GenBank登录的APX基因一致.说明成功构建了菘蓝APX重组质粒和克隆鉴定了菘蓝APX基因,可进一步用于基因表达和表达产物的功能研究.     

在DH5α中拼接构建ADAM10全长真核表达载体的基因突变

目的:构建ADAMI0真核表达载体,为进一步研究其生物学功能打基础.方法:将人ADAM10的上下两部分基因片段(分别为全长基因的1 ～910bp和911 ～2 247bp片段),依次与真核表达载体pcDNA3.1相连,以大肠杆菌DH5α或BL21(DB)作为感受态宿主菌用于转化连接产物,拼接成全长的阳性克隆通过PCR、酶切和测序鉴定.结果:ADAM10下段基因与已正确连入上段的pcDNA3.1重组质粒拼接时,若用DH5α为感受态菌,则下半段出现碱基插入增加512bp,测序结果显示为ADAM10基因第1 531 bp～2 042 bp间的序列有紧邻的双份;若用BL21(DE3)为感受态,则无突变.结论:将ADAM10基因与pcDNA3.1真核表达载体依次拼接构建重组质粒时,以DH5α为宿主菌可出现基因序列增加的罕见突变,而以BL21(DE3)为宿主则无突变,由此成功构建ADAM10全长基因与pcDNA3.1的重组质粒.     

大鼠Otos基因RNA干扰质粒体的构建

目的:构建其基因Otos的RNA干扰质粒载体,为研究Otospiralin在内耳的生理功能奠定基础。方法:在GenBank中查到大鼠Otos基因的序列,输入到相应的设计软件中,以此设计引物序列,经过PCR扩增,酶切后,克隆于pAVU6 27载体并行酶切鉴定。结果:构建的鼠Otos shRNA载体经过测序鉴定,所得和预期相符。结论:重组质粒pAVU6 27-Otos的成功构建为下一步研究打下良好的基础。     

小鼠白细胞介素-33基因的克隆及序列分析

目的:克隆小鼠IL-33基因全长编码区cDNA,并对其进行序列分析。方法:从BALB/c小鼠的脊髓组织中提取总RNA,逆转录为cDNA,用热启动PCR技术,扩增小鼠IL-33基因全长编码区cDNA,经双酶切后,克隆入pcDNA3.1( )载体中,构建真核表达载体pcDNA3.1-mIL-33,然后进行酶切鉴定与序列分析。结果:小鼠IL-33基因的PCR产物和重组载体经凝胶电泳和酶切鉴定、测序分析证实,其序列与GenBank中数据一致。小鼠IL-33基因的全长编码序列为801 bp,编码266个氨基酸。结论:小鼠IL-33基因成功的克隆并构建了其真核表达载体,为进一步进行IL-33的表达与功能研究奠定了基础。     

甘蔗全长丙酮酸磷酸二激酶（PPDK）基因的克隆

和C3植物相比,C4植物具有明显的生长优势及水分和营养利用率,生物产量也较高。甘蔗是典型的C4作物之一。以甘蔗叶片提取的基因组DNA为模板,以GenBank公布的甘蔗PPDK基因cDNA序列设计引物,进行LA-PCR(Long Acute PCR)扩增。将PCR产物克隆到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109,测序,得到了13.5Kb的甘蔗全长PPDK基因序列。为方便后续实验,在引物中引入可利用的XhoI和NotI酶切位点,将全长PPDK基因分两段克隆到pMD18-T Simple载体中,转化大肠杆菌JM109,完成了甘蔗全长丙酮酸磷酸二激酶（PPDK）基因的完整克隆,为将其导入C3作物中奠定了研究基础,实验室保藏菌种。     

菘蓝APX基因克隆及序列分析

为进一步研究菘蓝APX基因的功能,构建了菘蓝APX基因真核表达载体。从菘蓝植株中提取总RNA,逆转录为cDNA,根据APX基因在该类植物中的同源性设计简并引物,利用PCR方法钓取目的基因,将目的基因与T载体连接,PCR检测阳性克隆,同时菌液送往测序公司进行测序。结果表明:测序片段的生物信息学分析证实了该序列与GenBank登录的APX基因一致。说明成功构建了菘蓝APX重组质粒和克隆鉴定了菘蓝APX基因,可进一步用于基因表达和表达产物的功能研究。     

基质金属蛋白酶组织抑制剂-2基因的人工合成与克隆

根据GenBank报道的基质金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)氨基酸序列和毕赤酵母偏爱密码子设计,通过化学方法合成得到适合在毕赤酵母中表达的目的TIMP-2基因序列,并将其克隆到质粒pPIC9中,构建了pPIC9-T2表达载体,PCR鉴定及测序结果表明得到了正确的TIMP-2基因序列。     

人胰岛素样生长因子-1真核双顺反子表达载体pIRSES2-EGFP-hIGF-1的构建与鉴定

目的:利用基因工程原理构建人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)全长基因的真核表达栽体pIRES2-EGFP-hIGF-1,并观察其在人胚肾293细胞中的表达.方法:应用PCR方法从人肝细胞文库中提取人hIGF-1全长cDNA序列,克隆入T-pMD18载体中,经测序证实序列正确后,利用XhoI/EcoRI进行双酶切并定向插入真核表达载体pIRES2-EGFP中,利用双酶切、电泳和PCR进行鉴定证实插入片段的正确性.应用高效转染试剂X-treme GENE HP DNA Transfection reagent介导真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-1转染人胚肾细胞(HEK293),转染后利用倒置荧光显微镜与RT-PCR观察目的基因在靶细胞中的表达.结果:经酶切和测序证实重组质粒栽体构建正确,转染后48小时可观察到绿色荧光的表达,RT-PCR结果证实转染pIRES2-EGFP-hIGF-1后可有hIGF-1基因靶细胞中表达.结论:成功构建真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-1,目的基因与标记基因可同时在靶细胞中表达,为后续研究奠定基础.     

类胡萝卜素合成的相关基因及其基因工程

类胡萝卜素具有多种生物功能,尤其在保护人类健康方面起着重要的作用,如它们是合成维生素A的前体,能够增强人体免疫力和具有防癌抗癌的功效。人体自身不能合成类胡萝卜素,必须通过外界摄入;但类胡萝卜素在许多植物中含量较低,并且很难用化学方法合成。随着类胡萝卜素生物合成途径的阐明及其相关基因的克隆,运用基因工程手段调控类胡萝卜素的生物合成已成为可能。本文综述了微生物和高等植物类胡萝卜素生物合成途径中相关基因的克隆,以及运用这些基因通过异源微生物生产类胡萝卜素和提高作物类胡萝卜素含量的基因工程研究进展。     

基因诱捕技术及基因诱捕数据库

基因诱捕（gene trap）是基于小鼠胚胎干细胞、报道载体（诱捕载体）建立的一种基因突变方法。诱捕载体在整合位点利用内源基因调控元件模仿内源基因表达,使其表达终止,从而可以阐明内源基因的功能。由于诱捕载体及其报道基因的特点,基因诱捕技术可用于高通量生产,便于小鼠基因功能的大规模研究．为各类疾病动物模型的建立奠定良好基础。     

基因打靶突变小鼠与基因功能研究

ES细胞是建立基因打靶突变小鼠的必要条件 ,也可用于制备转基因动物 .基因敲除、精细突变和条件性基因打靶技术建立的基因打靶突变小鼠在人类遗传病机理研究、基因治疗和基因功能研究方面都有着重要作用 .     

益生菌的功能基因导入和基因编辑

益生菌已经在临床和食品领域应用多年,其安全性和有效性已经获得人们的认可。随着分子生物学技术的发展,采用益生菌作为载体进行基因导入或基因编辑,这些遗传改造的益生菌一部分已经作为新的药品或疫苗进入到临床应用阶段。携带功能基因的益生菌定殖于肠道进行表达和缓慢释放,这类益生菌作为活体药物获得益生菌和功能基因的双重功效,可用于治疗某些疑难病症。携带蛋白质抗原基因的益生菌定殖于肠道进行表达,可诱导肠道黏膜免疫、细胞免疫和体液免疫,这是一条更安全的口服疫苗途径。成簇的规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)及其相关蛋白(CRISPR-associated protein, Cas)以其高效与便捷性推动了益生菌基因编辑的发展。这篇综述介绍了CRISPR-Cas9操作系统在益生菌方面的应用。对传统遗传操作较难的益生菌采用CRISPR-Cas9技术进行基因编辑,使其基因敲除和基因突变,基因敲入和基因调控等更为简单、高效和易操作。这些CRISPR/Cas9、CRISPRa和CRISPRi技术在...     

壳聚糖作为基因治疗载体的研究

本文从壳聚糖－DNA复合物／微球的形成方法和机理,稳定性,转染细胞效率等方面综述了壳聚糖在基因治疗领域目前的研究现状。     

Identifying Gene Interaction Enrichment for Gene Expression Data

Gene set analysis allows the inclusion of knowledge from established gene sets, such as gene pathways, and potentially improves the power of detecting differentially expressed genes. However, conventional methods of gene set analysis focus on gene marginal effects in a gene set, and ignore gene interactions which may contribute to complex human diseases. In this study, we propose a method of gene interaction enrichment analysis, which incorporates knowledge of predefined gene sets (e.g. gene pathways) to identify enriched gene interaction effects on a phenotype of interest. In our proposed method, we also discuss the reduction of irrelevant genes and the extraction of a core set of gene interactions for an identified gene set, which contribute to the statistical variation of a phenotype of interest. The utility of our method is demonstrated through analyses on two publicly available microarray datasets. The results show that our method can identify gene sets that show strong gene interaction enrichments. The enriched gene interactions identified by our method may provide clues to new gene regulation mechanisms related to the studied phenotypes. In summary, our method offers a powerful tool for researchers to exhaustively examine the large numbers of gene interactions associated with complex human diseases, and can be a useful complement to classical gene set analyses which only considers single genes in a gene set.     

杆状病毒p74基因具有种属特异性

选用苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒杆粒 (AcMNPVbacmid)为材料 ,通过在大肠杆菌中利用RecA基因介导的同源重组 ,将其p74基因剔除 ,并精确地用斜纹夜蛾核多角体病毒 (SpltMNPV)的p74基因进行了替换。所构建的重组AcMNPV杆粒在修饰后的p74基因位点中未留下任何有可能影响该基因表达及功能的选择标记 ,SpltMNPV的p74基因直接位于AcMNPVp74基因的启动子控制下。RT PCR显示替换后的p74基因得到了表达。生物测定结果显示 ,重组病毒AcMNPV杆粒 polhSL74无法通过口服方式感染银纹夜蛾幼虫 ,表明杆状病毒p74基因具有种属特异性。