力复霉素前体甲基丙二酰CoA合成途径的研究

力复霉素合成的碳前体之一(2R)—甲基丙二酰CoA至少可以有三条酶学合成途径。三条途径中的关键酶分别为甲基丙二酰CoA转羧基酶、丙二酰CoA羧化酶、甲基丙二酰CoA变位酶和甲基丙二酰CoA消旋酶。通过比较各个酶活性的时间进程和力复霉素合成时间的相关性,以及各个酶的底物亲合力,对它们在地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)甲基丙二酰CoA合成中的贡献作了排序,发现甲基丙二酰CoA变位酶途径是主要负责酶系。但是各个途径的贡献排序并不是固定不变的,能受到环境因素的调控,丙酸盐的加入将抑制甲基丙二酰CoA变位酶活力,而使得甲基丙二酰CoA转羧基酶成为主要酶系。甲基丙二酰CoA合成途径的多样性有助于细胞对环境变化的灵活反应。此外,对各个酶的调控特性也进行了研究。     

地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)合成力复霉素代谢调节的研究——Ⅰ.硝酸盐对地中海诺卡氏菌合成力复霉素SV的促进作用

本文报导了硝酸盐促进力复霉素生物合成现象的初步观察结果。加入硝酸钾0.8％,地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)NG 12—4合成力复霉素SV的产量可增加1.7倍。在发酵96小时之前加入硝酸盐均能促进力复霉素SV的合成,但产量的增加随加入时间的延迟而降低。硝酸钾在促进产量的同时,使菌体生长减少,看来硝酸盐对力复霉素SV的合成与菌体生长之间起着调节作用。 洗涤菌体试验指出,硝酸盐的加入诱导了力复霉素合成所需要的酶系,蛋白陈不能代替硝酸盐,进一步说明硝酸钾的作用并不是作为氮源利用。在蛋白质合成抑制剂氯霉素存在下,硝酸盐不再能促进力复霉素的合成,说明氯霉素抑制了硝酸盐所诱导的酶系的合成。 铵盐明显地抵消了硝酸盐对力复霉素合成的促进作用,可能是由于铵盐阻遏了硝酸还原酶的合成。 KNO~3~-菌体与-KNO~3~-菌体的形态有明显差别。两种菌体的脂肪含量也不相同。 KNO~3~-一菌体的脂肪含量为5.7％,而-KNO~3~-菌体则高达13.6％,看来硝酸盐在脂肪合成与力复霉素合成两条途径之间起着调节作用。     

甘油对利福霉素SV生物合成的影响

利福霉素SV脂肪链桥部分的合成是以乙酸单位（由丙二酰CoA提供）和丙酸单位（由甲基丙二酰CoA提供）为延伸单元经过缩合、环化和后修饰而形成的,一些短链碳前体对二碳或三碳延伸单位的合成具有调节作用。研究发现添加一定量的甘油对利福霉素SV的生成具有明显的促进作用,其最适添加量为3％,添加时间以72h为宜,并且分批补加效果更好,最高提高效价21％以上。有机酸分析结果显示,甘油的加入导致乙酸和琥珀酸在胞外积累的增加,促进了EMP和TCA代谢途径,有利于利福霉素SV合成前体的积累。     

甘油对利福霉素SV生物合成的影响*

利福霉素SV脂肪链桥部分的合成是以乙酸单位(由丙二酰CoA提供)和丙酸单位(由甲基丙二酰CoA提供)为延伸单元经过缩合、环化和后修饰而形成的,一些短链碳前体对二碳或三碳延伸单位的合成具有调节作用。研究发现添加一定量的甘油对利福霉素SV的生成具有明显的促进作用,其最适添加量为3%,添加时间以72h为宜,并且分批补加效果更好,最高提高效价21%以上。有机酸分析结果显示,甘油的加入导致乙酸和琥珀酸在胞外积累的增加,促进了EMP和TCA代谢途径,有利于利福霉素SV合成前体的积累。     

S-丙二酰转移酶基因失活对地中海拟无枝酸菌产利福霉素的影响

为提高利福霉素的产量,构建了S-丙二酰转移酶基因失活的地中海拟无枝酸菌。利用融合PCR构建S-丙二酰转移酶基因的同源重组载体,通过电击转化导入到地中海拟无枝酸菌中,使之发生同源重组,以安普霉素为标记,筛选了S-丙二酰转移酶基因失活菌株,并对比了突变菌株与原始菌株的利福霉素SV产量。成功构建了S-丙二酰转移酶基因的同源重组载体,获得了地中海拟无枝酸菌突变株A.mediterranei △fab D,失活菌株的利福霉素SV产量为168.08 mg/L,比原始菌提高了9.94%。S-丙二酰转移酶基因的失活,弱化了突变菌株脂肪酸的合成,强化了利福霉素的合成。     

铵离子对梅岭霉素生物合成的调控效应

通过考察不同浓度的硫酸铵对梅岭霉素生物合成的影响,证实在低浓度下,硫酸铵可以促进梅岭霉素的生物合成,当其浓度大于5mmol/L时,菌丝生长和产物合成均受到抑制,而耗糖速率却随着铵离子的浓度增大而增大。在此基础上,进一步测定了与梅岭霉素生物合成和糖代谢过程密切相关的6种酶的活性变化,结果表明较高浓度的铵离子对6_磷酸葡萄糖脱氢酶、柠檬酸合成酶、琥珀酸脱氢酶以及脂肪酸合成酶的活性均表现出一定的促进作用,而对缬氨酸脱氢酶和甲基丙二酰CoA羧基转移酶的活性进行抑制,由此产生的结果一方面是HMP途径和TCA循环得到了加强,促进了菌体的初级代谢,另一方面则是梅岭霉素生物合成所需前体的来源受到限制,从而造成了梅岭霉素的低产。     

硝酸盐对力复霉素SV和脂肪合成的调节作用

地中海诺卡氏菌菌体的脂肪分析指出十KNO3,菌体的中性脂比一KNO3菌体的含量低,但两种菌体的中性脂所含脂肪酸组分上无显著的差异。定量分析表明,在硝酸盐存在下力复霉紊sV产量的增加几乎相当于脂肪含量的减少。显然,在硝酸盐存在的情况下,用于合成脂肪的中间代谢物被用于力复霉素SV合成,从而使SV产量增高。     

地中海拟无枝酸菌“硝酸盐效应”的研究进展

地中海拟无枝酸菌"硝酸盐效应"是指发酵基质中的硝酸盐在一定浓度下大幅度促进该菌合成利福霉素,并对初级代谢产生多种影响的现象。针对该效应,本实验室开展了多年的研究,阐明硝酸盐主要通过两个方面促进利福霉素的生物合成:一方面,硝酸盐增加利福霉素生物合成前体的供给(如UDP-葡萄糖、AHBA、丙二酰Co A以及甲基丙二酰Co A等),尤其是通过抑制体内脂肪酸的合成来保障利福霉素前体丙二酰Co A的供给;另一方面,硝酸盐提升利福霉素生物合成酶基因的表达。因此,在充足的利福霉素前体和合成酶系的协同效应下,菌体生成大量的利福霉素。进一步的工作将围绕"硝酸盐效应"的信号分子、信号转导途径以及相关基因的表达调控和翻译后修饰机制等方面展开。     

安普霉素的生物合成:辛二糖C7′-N上甲基的甘氨酸来源

安普霉素是一类结构特殊的氨基糖苷类抗生素,其分子中含一个稀有的辛二糖结构单元.迄今为止,尚无关于安普霉素生物合成途径及其前体化合物的完整报道.研究发现,向发酵培养基中添加甘氨酸和丝氨酸均可以出现在菌体生长保持基本不变的情况下促进抗生素产量的现象,表明甘氨酸和/或丝氨酸可能参与了安普霉素的合成.[2-13C]甘氨酸示踪实验的核磁共振(NMR)检测结果表明,甘氨酸专一地掺入安普霉素辛二糖环C7′-N甲基.同时发现,菌体胞内的S腺苷甲硫氨酸(SAM)水平上升与外加甘氨酸的量呈正比,但是甲硫氨酸的加入会抑制安普霉素的合成.据报道,甲硫氨酸对结构中含有甲基取代基的抗生素,如对rapamycin的生物合成中转甲基过程有抑制作用.由此推测,尽管甲硫氨酸本身对抗生素产量呈抑制作用,甘氨酸仍然可能通过甲硫氨酸循环提供甲基.此外,[2-13C,15N]丝氨酸的示踪实验结果表明丝氨酸也可能作为安普霉素的限制性前体物参与了NH2的合成.     

安普霉素的生物合成: 辛二糖C7′-N上甲基的甘氨酸来源

安普霉素是一类结构特殊的氨基糖苷类抗生素, 其分子中含一个稀有的辛二糖结构单元. 迄今为止, 尚无关于安普霉素生物合成途径及其前体化合物的完整报道. 研究发现, 向发酵培养基中添加甘氨酸和丝氨酸均可以出现在菌体生长保持基本不变的情况下促进抗生素产量的现象, 表明甘氨酸和/或丝氨酸可能参与了安普霉素的合成. [2-¹³C]甘氨酸示踪实验的核磁共振(NMR)检测结果表明, 甘氨酸专一地掺入安普霉素辛二糖环C7′-N甲基. 同时发现, 菌体胞内的S腺苷甲硫氨酸(SAM)水平上升与外加甘氨酸的量呈正比, 但是甲硫氨酸的加入会抑制安普霉素的合成. 据报道, 甲硫氨酸对结构中含有甲基取代基的抗生素, 如对rapamycin的 生物合成中转甲基过程有抑制作用. 由此推测, 尽管甲硫氨酸本身对抗生素产量呈抑制作用, 甘氨酸仍然可能通过甲硫氨酸循环提供甲基. 此外, [2-¹³C,¹⁵N]丝氨酸的示踪实验结果表明丝氨酸也可能作为安普霉素的限制性前体物参与了NH₂的合成.     

硝酸盐、镁盐对林可霉素生物合成的促进作用

在林肯链霉菌生物合成林可霉素代谢调节的研究中,发现硝酸盐可明显促进林可霉素的生物合成．加入硝酸钾０．８％,林肯链霉菌合成林可霉素的产量可增加３７％．在发酵９６ｈ之前加入硝酸盐均能促进林可霉毒的合成,但产量的增加随加入时间的延迟而降低．硝酸钾在促进产量的同时,使菌体生长减少,看来硝酸盐对林可霉素的合成与菌体生长之间起着调节作用．洗涤菌体试验指出,硝酸盐的加入诱导了林可霉素合成所需要的酶系,这可能是加入硝酸盐后,产生进一步氮代谢的结果;蛋白胨不能代替硝酸盐,进一步说明硝酸钾的作用并不是作为氮源利用．在蛋白质合成抑制剂氯霉素存在下,硝酸盐不再能促进林可霉素的合成,说明氯霉素抑制了硝酸盐或其代谢中间物所诱导的酶系的合成．同时还报导了镁盐促进林可霉素生物合成现象的初步观察结果．硫酸镁在促进林可霉素产量提高的同时,使菌体生长延迟．硫酸镁的这种作用机制可能是通过磷酸镁铵沉淀,降低了培养基中游离氨和可溶性磷酸盐浓度,解除了铵盐和磷酸盐对林可霉素合成的抑制．     

芳香途径终产物和中间体对力复霉素SV生物合成的调节作用

本文报道了芳香化合物对力复霉素生物合成和芳香途径开始的DAHP合成酶活力的调节作用。首先,洗涤菌体实验结果指出,色氨酸对力复霉素sV合成有明显抑制,苯丙氨酸和酪氨酸本身作用不明显。其次,酶活力测定结果表明,色氨酸抑制力复霉素生物合成是由于它对DAHP合成酶的反馈抑制;同时,在无细胞抽出液中酪氨酸和苯丙氨酸对色氨酸抑制也显示了协同作用。此外,力复霉素芳香前体(C7N)的结构类似物对氨基苯甲酸和对羟基苯甲酸对抗生素合成也有影响,主要影响c,N的生物合成。     

异源生物合成聚酮化合物的研究进展

聚酮是一大类具有重要生物活性的天然产物,其生物合成途径复杂多样。利用异源宿主合成聚酮化合物要比使用天然生产菌有很多优点。异源宿主的选择是异源生物合成聚酮的关键。这种宿主必须能够大量表达大分子聚酮合成酶(300 kDa或更大)且能够大规模的转译后修饰这些蛋白;还要能够形成大量的像丙二酰CoA、甲基丙二酰CoA等细胞内起始单元。随着各种技术的不断进步,异源宿主很可能成为大规模生产聚酮化合物的一个强有力平台。本文对聚酮合成酶,异源生产聚酮的优点、条件和应用都有所阐述。     

基于前体供给途径遗传改造提高褐黄孢链霉菌纳他霉素的产量

纳他霉素(natamycin)是一种高效、广谱、安全的抗真菌剂,广泛应用于食品防腐与医药领域。纳他霉素可由多种链霉菌发酵产生。它是以乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A及甲基丙二酰辅酶A为前体经Ⅰ型聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)催化合成的多烯大环内酯类化合物。本研究以纳他霉素产生菌——褐黄孢链霉菌为研究材料,分别对不同前体分子供给途径中的关键酶进行过表达,并确定影响纳他霉素产量的关键前体供给途径。研究结果发现：通过过表达乙酰辅酶A合成酶(acetyl-CoA synthase,ACS)加强乙酰辅酶A合成途径,以及通过过表达甲基丙二酰辅酶A变位酶(methylmalonyl-CoA mutase,MCM)加强甲基丙二酰辅酶A合成途径,重组菌株纳他霉素产量分别比野生型菌株提高了44.19%和20.51%。共过表达ACS和MCM,重组菌株纳他霉素产量获得进一步提升(达1123.34mg/L),比野生型菌株提高了66.29%。上述发现为通过前体代谢工程的策略构建纳他霉素工业高产菌株提供了参考,也为其他聚酮类天然产物高产工程菌株的构建提供了借鉴。     

地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)合成力复霉素代谢调节的研究——Ⅱ、硝酸盐对地中海诺卡氏菌代谢途径的调节

地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)的硝酸还原酶是底物—诱导酶,和细菌一样以NADH为专一性电子供体,并可能在细胞膜上,但与细菌不同,对超声波不敏感。加入硝酸盐促使菌体的力复霉素合成能力提高的同时,诱导硝酸还原酶和亚硝酸还原酶的合成,但需较长的诱导期。同时戊糖循环的G-6-P脱氢酶、6-P-G脱氢酶、莽草酸脱氢酶以及三羧酸循环的异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶亦相应提高。G-6-P脱氢酶和莽草酸脱氢酶活力的提高,可由莽草酸途径提供合成力复霉素的芳香环来源,三羧酸循环酶活力的提高看来是在脂肪合成与多聚酮(polyketide)合成之间起着调节作用,使菌体合成更多的力复霉素的环桥部份。至于硝酸盐如何引起这一系列酶活力的变化而使力复霉素的合成增加,尚有待进一步深入研究。     

培养基磷缺乏对黄瓜毛状根生长、抗氧化酶活性及氮源利用的影响

采用液体培养的方法研究了培养基磷缺乏对黄瓜毛状根生长及其抗氧化酶活性及培养基中氮源和钙利用的影响.结果表明,黄瓜毛状根在完全缺磷的培养基中几乎不能生长;而培养基无机磷缺乏会抑制黄瓜毛状根的生长,且浓度越低,其抑制作用越明显,毛状根变得越纤细而长,侧根数减少且短小.与全磷培养相比,磷缺乏培养基培养的黄瓜毛状根可溶性蛋白含量明显偏低,但其SOD和POD活性则明显升高.与完全缺磷(对照)相比,在培养过程中不同无机磷浓度培养的黄瓜毛状根的SOD和POD活性均比对照低.当黄瓜毛状根在不同磷缺乏浓度的液体培养基中培养时,随着培养时间的延长,培养基的电导率逐步下降,并与培养基起始无机磷浓度成正比;其培养基的铵态氮和硝态氮不断被吸收和利用,培养至15d时,培养基中的铵态氮已绝大部分被消耗完毕,但直至培养30d时培养基的硝态氮仍未被消耗完毕.培养基中无机磷缺乏会降低黄瓜毛状根对培养基硝态氮的吸收和消耗以及抑制黄瓜毛状根对钙的吸收.而适当提高培养基的无机磷浓度可促进黄瓜毛状根对培养基中钙的吸收和消耗.     

地中海拟无枝菌酸菌U32染色体特性的脉冲场电泳分析

地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)U32是产力复霉素SV的工业生产菌株。采用脉冲场电泳分析发现,地中海拟无枝菌酸菌U32仅有一条约10 Mb的线性染色体, 没有内源性质粒。利用Southern杂交法,对11个编码力复霉素生物合成、相关初级、次级代谢关键酶以及调控蛋白的基因,在U32染色体DNA的PshBI酶切片段上进行了定位。分析发现在一条长度约700kb的PshBI酶切片段上,分别存在着力复霉素合成基因簇(rif)、氮代谢的亚硝酸还原酶小亚基基因(nasD)、衔接初级与次级代谢的甲基丙二酰变位酶基因(mcm)、脂肪酸代谢的乙酰辅酶A羧化酶生物素载体蛋白基因(accA)以及一套核糖体RNA转录单元。同时还发现U32至少有5套核糖体RNA转录单元。其余定位的基因均只出现单一杂交信号。     

三孢布拉霉JM9207合成油脂的研究

STUDIESONSYNTllliSISOFLIPIDS！NBLAKESEAIRliyl,nnxJIANGWen－HouSHANZhi-PingMENGYu（JangsuInstituteofMicrobiology．Wuxi214063）用三抱布拉霉发酵生产卜胡萝卜素需要在培养基中加入植物油,它能显著提高胡萝卜素产量,该菌在吸收利用植物油脂合成胡萝卜素过程中也在细胞内积累丰富的油脂。本文研究了该菌的油脂合成,结果表明,三抱布拉霉菌有较强的吸收同化培养基中添加的植物油并合成菌体自身油脂的能力。菌体油脂脂肪酸组分中C;。和C;。酸含量占绝大多数,其中亚油酸和油酸占62～84％。菌体油脂脂肪酸…     

金属离子对黄柄曲霉生长和抗真菌抗生素合成的影响

不同的金属离子对兼性海洋霉菌黄柄曲霉179的生长有不同的影响。在0．002mol/L的浓度下,Hg^2 、Ag^ 和Cr^3 能强烈抑制该菌的生长,Pb^2 、Sr^2 、Co^2 、Al^3 对其生长有一定的抑制,生长量低于对照;Mn^2 、Ba^2 、Zn^2 对其生长没有明显影响;Cu^2 对该菌的生长有微弱的促进作用。菌体生物量略高于对照;不同的金属离子对曲霉179真菌抗生素179M合成有不同的影响。与对照相比,Ba^2 对共产量没有影响;Al^3 、Zn^2 、Sr^2 有一定的抑制作用,其发酵相对效价分别为对照的81．4％、55．5％和65％;0．002mol／L斩Mn^2 和Pb^2 能强烈抑制此抗生素的合成,在添加0．002mol/LMn^2 和Pb^2 的培养基中,虽然菌体生长良好,但无179M产生;Co^2 和Cu^2 则有明显的促进作用,当培养基中添加0．002ml／L的Co^2 时其发酵相对效价提高到261．4％;当培养基中添加0．003mol／L的Cu^2 时其发酵相对效价提高到350．2％。Co62 和Cu62 对发酵的促进效应是相互拮抗的。     

硝酸盐,镁盐对林可霉素生物合成的促进作用

在林肯链霉菌生物合成林可霉素代谢调节的研究中,发现硝酸盐可明显促进林可霉素的生物加入硝酸钾０．８％,林肯链霉菌合成林可霉素的产量可增加３７％．在发酵９６ｈ之前加入硝酸盐均能促进林可霉素的合成,但产量的增加随加入时间的延迟而降低。硝酸钾在促进产量的同时,使菌体生长减少,看来硝酸盐对林可霉素的合成与菌体生长之间起着调节作用。