效应与包含体的变性和复性

Ｈｏｒｍｅｉｓｔｅｒ效应反映了溶质小分子通过与水分子的相互作用,对蛋白质等生物大分子造成的结构上的影响。通过对此效应的深入研究,可以从个解释许多常见的生理生化现象。蛋白质的变性、复性问题是与Ｈｏｒｍｅｉｓｔｅｒ效应密切相关的生化基础课题。目前重组蛋白生产过程中包含的变性和复性问题为上述理论研究提供了广泛的应用空间。     

包含体内重组蛋白质的复性

具有临床、工业生产、药用功能的真核生物蛋白质的供给常常受到其天然来源的限制。可喜的是基因工程技术的发展使许多真核生物蛋白质能在细菌细胞中进行表达[1] 。大肠杆菌由于培养和基因操作容易而成为最受欢迎的表达系统 ,但是重组蛋白质在大肠杆菌中的高水平表达常常导致以包含体形式存在的胞內聚集的变性蛋白质的形成。这种变性蛋白质的量可高达总的重组蛋白质量的95%。由于以包含体形式存在的聚集蛋白质分子不具有正确的三维结构 (天然结构 ) ,它们在水溶液中通常不溶解且没有活性 ,因此大肠杆菌中包含体的形成就意味着可溶性重组蛋白…     

Hofmeister效应与包含体的变性和复性

Hofmeister效应反映了溶质小分子通过与水分子的相互作用, 对蛋白质等生物大分子造成的结构上的影响.通过对此效应的深入研究, 可以从理论上解释许多常见的生理生化现象.蛋白质的变性、复性问题是与Hofmeister效应密切相关的生化基础课题. 目前重组蛋白生产过程中包含体的变性和复性问题为上述理论研究提供了广泛的应用空间.     

包含体蛋白质的复性研究进展

包含体的形成是异源蛋白质在大肠杆菌中高效表达的必然结果,也是目前产生重组蛋白质最有效的方法之一。不可溶、无生物活性的包含体必须经过变性、复性才能获得天然结构,完整特定的生物学功能。聚集是造成重组蛋白质复性产率低下的主要因素,因此理解蛋白质聚集机制,减少和防止聚集的发生是建立高效、高产率复性方法的关键。分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。     

包含体的体外复性策略

外源基因在大肠杆菌中高水平表达时,通常会形成不溶性、无活性的蛋白聚集体即包含体。包含体富含表达的重组蛋白,经分离、变性溶解后须再经过一个合适的复性过程实现变性蛋白的重折叠,才能够得到生物活性蛋白。近年来,发展了许多特异的策略和方法来从包含体中复性重组蛋白。介绍稀释法、透析及分子排阻、固定化金属离子亲和层析、疏水层析复性等策略和进展;物理化学因素、前导肽协助蛋白折叠;人工分子伴侣辅助蛋白折叠及反胶束、多聚物用于蛋白复性。     

包含体的体外复性研究进展

在大肠杆菌中大量表达的重组蛋白质常常形成无活性的、不溶性的包含体。包含体经过液固分离、洗涤、变性溶解后,经过一个合理的复性过程可重新折叠成有活性的蛋白质。本文概述了常用的包含体复性方法,并对近年来出现的色谱复性法和应用一些低分子量添加剂等来提高蛋白质复性的产率做了简述。     

大肠杆菌表达的单链抗体柱复性的研究

对包含体表达的抗乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的单链抗体（ScFv）纯化复性进行了探索.尝试了利用金属螯合亲和层析和凝胶层析柱进行柱上在位复性的可行性. 对包含体表达的ScFv进行透析复性与柱复性,比较其相对复性率及蛋白质回收率,发现柱上复性效果优于传统的透析复性.抗HBsAg ScFv经凝胶色谱Sephacyl S-200柱复性的相对复性率为98%, 蛋白质回收率为81%.由于将纯化复性同步进行,简化了操作程序,提高了产品的回收率.     

重组包涵体蛋白质的折叠复性

综述了减少包涵体形成、包涵体分离和溶解以及包涵体折叠复性的策略及其最新进展 .详细讨论了包涵体蛋白质折叠复性的基本原则、包涵体折叠复性促进剂和包涵体折叠复性方法     

大肠杆菌表达的单链抗体柱复性的研究

对包含体表达的抗乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的单链抗体(ScFv)纯化复性进行了探索.尝试了利用金属螯合亲和层析和凝胶层析柱进行柱上在位复性的可行性. 对包含体表达的ScFv进行透析复性与柱复性,比较其相对复性率及蛋白质回收率,发现柱上复性效果优于传统的透析复性.抗HBsAg ScFv经凝胶色谱Sephacyl S-200柱复性的相对复性率为98%, 蛋白质回收率为81%.由于将纯化复性同步进行,简化了操作程序,提高了产品的回收率.     

重组人粒细胞集落刺激因子的复性研究

通过小试研究对重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的复性条件,如氧化剂和还原剂比例、操作方法、时间和蛋白浓度,进行了优化选择,并在此基础上进行了中试放大试验的验证.试验结果表明,采用优化后的复性方法复性液中rhG-CSF的效价可达到1.8×107U/ml以上,比活性达到0.9×108/mg以上.     

Isolation, renaturation, and formation of disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli as inclusion bodies

Expression of recombinant proteins in Escherichia coli often results in the formation of insoluble inclusion bodies, In case of expression of eukaryotic proteins containing cysteine, which may form disulfide bonds in the native active protein, often nonnative inter- and intramolecular disulfide bonds exist in the inclusion bodies. Hence, several methods have been developed to isolate recombinant eukaryotic polypeptides from inclusion bodies, and to generate native disulfide bonds, to get active proteins. This article summarizes the different steps and methods of isolation and renaturation of eukaryotic proteins containing disulfide bonds, which have been expressed in E. coli as inclusion bodies, and shows which methods originally developed for studying the folding mechanism of naturally occurring proteins have been successfully adapted for reactivation of recombinant eukaryotic proteins. (c) 1993 John Wiley & Sons, Inc.     

大肠杆菌表达的重组hIL-4的分离纯化

对大肠杆菌表达的重组人白细胞介素 4进行了分离纯化。人 IL- 4基因表达产物在大肠杆菌中以不溶性包含体形式存在 ,经过超声破菌、包含体抽提、洗涤处理 ,可使包含体纯度达 70 %以上 ,用 6mol/L盐酸胍变性溶解包含体沉淀后上清直接稀释复性 ,再经浓缩、透析、离子交换色谱一系列纯化步骤终产物纯度达 95 %以上 ,回收率 1 0 %以上 ,比活性达 2 .5× 1 0 6U/mg     

重组N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶包涵体的稀释复性

N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶（N-Acetylornithine deacetylase,NAO）是一种重要的用于手性拆分的酶,具有广泛的底物选择性,常用于多种活性氨基酸的酶法拆分。采用稀释复性法研究了重组NAO包涵体的复性条件,如蛋白浓度、复性液中尿素浓度、pH、GSH浓度及c（GSH）/c（GSSG）比例,同时对稀释操作方式进行了考察,得到了较为适宜的复性条件。结果表明,尿素能有效抑制复性过程中蛋白质的聚集,随着蛋白质浓度的增加,复性效果变差。当复性缓冲液中尿素浓度为2 mol/L,GSH浓度为5 mmol/L,c（GSH）/c（GSSG）为2.5,pH为8.5,在4℃下进行分批稀释复性操作,复性后重组NAO的活性为1.077 U/mL,比酶活达到14.943 U/mg,与可溶性表达的NAO比较,复性率达到21.48%。     

大肠杆菌表达的重组人骨形成蛋白-7的复性

带有pBV221-hBMP-7的E．coli表达得到的rhBMP-7以不溶的包涵体形式存在,用高浓度的变性利溶解后,经过DEAE-FF纯化,得到高纯度的目的蛋白,达95％以上。分别用尿素浓度梯度降低法、添加促复性剂及人工分子伴侣法对蛋白质进行复性,并通过不同方法对复性结果进行比较。Western blot中辉度扫描结果显示,GSH／GSSG法样品二聚体／单体比例为79．5／20．5,尿素浓度梯度降低法二聚体／单体比例为73．6／26．4,表明GSH／GSSG法复性样品溶液上清中含较高比例的蛋白质二聚体。根据不同复性样品对NIH3T3细胞ALP活性影响大小的比较结果,氧化还原剂最有助于二聚体的形成,蛋白质活性最高。     

重组人GM—CSF／MCAF融合蛋白的变性,复性及纯化研究

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和单核细胞趋化激活因子(MCAF)融合蛋白在大肠杆菌中高效表达后,表达产物以包涵体形式存在。包涵体经分离和洗涤后,探索了rhGM-CSF/MCAF变性和复性的合适条件。复性后的样品经Sephadex G-75凝胶过滤和CM-Sepharose FF离子交换两步层析,得到了具有生物学活性的SDS-PAGE纯的rhGM-CSF/MCAF。Western blot检测表明,纯化的rhGM-CSF/MCAF能分别与GM-CSF和MCAF抗体发生特异反应。     

来源于青霉菌聚半乳糖醛酸酶的筛选及其在大肠杆菌中的异源表达

聚半乳糖醛酸酶属于果胶水解酶类,在食品、饲料、纺织和造纸等工业生产中应用广泛。本研究筛选获得一株能分解果胶的青霉菌Penicillium sp. FJ2,使用简并引物PCR和TAIL-PCR方法从该菌中克隆得到一个聚半乳糖醛酸酶基因pgp1。pgp1基因全长1 225 bp,包含2个内含子,其cDNA全长1 104 bp,编码367个氨基酸和一个终止密码子。将pgp1基因连接pET-30a(+)载体并转化大肠杆菌BL21(DE3),重组蛋白以包涵体形式获得表达。通过尿素溶解和梯度稀释方法对重组蛋白PGP1进行了重折叠复性试验,复性后的PGP1聚半乳糖醛酸酶活力达到12.9 U/mL,比活力为583 U/mg。     

利用大肠杆菌高效表达人载脂蛋白AI及其性质分析

载脂蛋白AI(apolipoproteinAI,apoAI)是高密度脂蛋白HDL的主要组成成分 ,流行病学研究表明apoAI的含量决定血浆中HDL的高低 ,而HDL具有胆固醇逆向转运的功能 ,起到降低冠心病发生概率的作用。通过大肠杆菌表达系统来生产apoAI的蛋白原proapoAI,蛋白的表达形式为包涵体 ,通过疏水柱进行柱上复性。同时在proapoAI和apoAI之间设计一个酸水解位点 ,通过将蛋白原proapoAI进行酸水解来得到成熟蛋白apoAI。最终得到的成熟蛋白apoAI在结构分析和脂结合特性上都与天然的apoAI相似 ,从而为该蛋白的工业生产上提供了一个良好的基础。     

Protein folding in vivo and renaturation of recombinant proteins from inclusion bodies

Eukaryotic proteins expressed inEscherichia coli often accumulate within the cell as insoluble protein aggregates or inclusion bodies. The recovery of structure and activity from inclusion bodies is a complex process, there are no general rules for efficient renaturation. Research into understanding how proteins fold in vivo is giving rise to potentially new refolding methods, for example, using molecular chaperones. In this article we review what is understood about the main three classes of chaperone: the Stress 60, Stress 70, and Stress 90 proteins. We also give an overview of current process strategies for renaturing inclusion bodies, and report the use of novel developments that have enhanced refolding yields.