MALDI-TOF质谱源后衰变技术鉴定2D胶蛋白点

PMF方法由于具有高灵敏度、高通量和容易自动化等优点,在蛋白质组学鉴定中占有重要的地位。然而,许多样品(比如：小分子蛋白,混合物等)仅仅通过PMF方法不能明确鉴定。在这种情况下,在测定PMF的同一个样品上,选择一个酶解片段峰进行PSD测序,并把这些序列信息输入MS—Tag软件进行搜索,结合PMF方法,表观分子量等电点等参数,能够对胶上的点进行明确的鉴定。本文先用PSD方法对胶上的三个标准蛋白进行鉴定,都得到了非常准确的结果,同时鉴定了胶上的几个未知点。     

双向凝胶电泳银染蛋白质点的肽质谱指纹图分析

对双向凝胶电泳后银染显色的蛋白质点经脱色与原位还原和烷基化处理后,用ＴＰＣＫ胰蛋白酶进行酶解,采用带有Ｃ１８反相载体的ＺｉｐＴｉｐ＾ＴＭ吸头进行脱盐处理,再进行ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ肽质谱指纹纹图分析,然后将肽质数据在ＥＭＢＬ数据库中进行搜寻从而对蛋白南点进行鉴定。结果表明用该实验程序可对银染的单一蛋白南点进行快速肽质谱指纹图ｉｐＴｉｐ＾ＴＭ的应用可以明显增加质谱分析的信噪比,提高分析灵敏度。用以上方     

MALDI-TOF质谱技术对克罗诺杆菌的鉴定与分型

以基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)技术用于克罗诺杆菌的鉴定与分型。通过对获得的克罗诺杆菌属典型菌株、阴沟肠杆菌和产气肠杆菌近似菌株以及克罗诺杆菌分离株的蛋白质质量图谱进行对比分析,找出克罗诺杆菌特征性离子峰,将其作为鉴定克罗诺杆菌的生物标识物;对全细菌蛋白质质量图谱进行聚类分析,将克罗诺杆菌属进一步划分为不同类型,结果显示,4株克罗诺杆菌参考菌株质量图谱约在5740(m/z)离子质荷比处出现1个相近离子峰,28株克罗诺杆菌分离株中27株(占96.4%)表现出相同结果;32株克罗诺杆菌被分为6种类型(以50%距离水平为分类界限)。MALDI-TOFMS作为一种新的技术,不仅能够用于克罗诺杆菌的鉴定,而且根据获得的细菌蛋白质质量图谱可将克罗诺杆菌划分为不同类型。     

串联质谱数据的从头解析与蛋白质的数据库搜索鉴定

蛋白质的鉴定是蛋白质组学研究中必不可少的一步。用串联质谱 (tandemmassspectrometry ,MS/MS)可以进行多肽的从头测序 (denovosequencing) ,并搜索数据库以鉴定蛋白质。用图论以及真实谱 理论谱联配 (alignment)的方法对串联质谱得到的多肽图谱进行从头解析 ,得到了可靠的多肽序列 ,并应用到数据库搜索中鉴定了相应的蛋白质。同时 ,还用统计的方法对SwissProt以及TrEMBL蛋白质数据库进行了详细的分析。结果表明 ,3个四肽或者 2个五肽或者 1个八肽一般可以唯一地确定一个蛋白质     

蛋白质组学中新蛋白质鉴定的研究方法和策略

当前,基于生物质谱进行蛋白质鉴定的技术已经成为蛋白质组学研究的支撑技术之一.产生的数据主要使用数据库搜索的方法进行处理,这种方法的一大缺陷是不能鉴定数据库中未包含的蛋白质,因此如何充分利用质谱数据对蛋白质组研究的意义很大,而新蛋白质鉴定更是其中一个重要的内容.新蛋白质鉴定是蛋白质鉴定的一个方面,新蛋白质的定义按照序列和功能的已知程度分为3个层次;以蛋白质鉴定的方法为基础,目前新蛋白质鉴定的方法可分为denovo测序和相似序列搜索结合的方法以及搜索EST、基因组等核酸数据库的方法2大类;两者各有利弊.存在各自的问题和相应处理的策略.不同的研究者可以根据具体目的应用和发展不同的鉴定方法,同时新蛋白质的鉴定也将随着蛋白质组学研究的发展而更加完善.     

基于质谱和生物信息学分析的小菜蛾蛋白质鉴定

本研究以非模式昆虫小菜蛾Plutella xylostella为材料, 对比2, 3, 4龄幼虫的蛋白质组双向电泳图谱, 得到24个蛋白质差异点, 从中选取了编号为1111的差异表达蛋白质点进行质谱鉴定和生物信息学分析. 采用胶内酶解的多肽进行MALDI-TOF/TOF分析, 获得该点的肽质量指纹图谱（PMF）及串联质谱（MS/MS）图谱。将获得的PMF分别用MASCOT和ProFound等常用软件在NCBInr的Metazoa蛋白质数据库进行搜索, 匹配结果不理想. 进一步用PMF+MS/MS谱图搜索NCBInr的Metazoa蛋白质数据库, 以及小菜蛾EST数据库。 在NCBInr库中匹配结果为拟暗果蝇Drosophila pseudoobscura中的一种假定蛋白GA18218-PA, 而用EST库搜索的结果为家蚕Bombyx mori的ATP合酶的亚基。为验证搜索结果, 将该蛋白质点进行磺基异硫氰酸苯酯（SPITC）化学衍生后de novo测序, 最后确认该点可能为ATP合酶的一个亚基。最后着重讨论了蛋白质的质谱鉴定与生物信息学分析的联合使用, 希望据此选择出最适合于非模式昆虫蛋白质组学鉴定的方法。     

基于核糖体蛋白质标志物及MALDI-TOF MS技术快速鉴定伦茨菌属放线菌

【目的】伦茨菌属(Lentzea)放线菌(Actinobacteria)代谢产物具有广泛的生物活性,在医药领域展现出潜在的应用价值。本研究尝试建立以核糖体蛋白质为标志物,利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight masss pectrometry,MALDI-TOF MS)技术鉴定伦茨菌属放线菌的方法。【方法】检索基因组数据库,提取伦茨菌属菌种模式菌株15种核糖体蛋白质的序列并计算理论分子量;通过分子量比对分析伦茨菌属菌种模式菌株之间及其与邻近属菌种模式菌株之间15种核糖体蛋白质的匹配度,提出鉴定至菌种及属的核糖体蛋白质匹配数标准;选取目标属和非目标属菌种进行MALDI-TOFMS测试和分析并修正鉴定标准。【结果】将待测菌株的MALDI-TOF质谱峰与伦茨菌属各菌种模式菌株的15种核糖体蛋白质分别匹配,通过最大匹配数及质谱峰强度模式可鉴定至属或种。【结论】本研究建立了基于15种核糖体蛋白质标志物及MALDI-TOF MS技术鉴定伦茨菌属放线菌的方法,可为放线菌纲其他类群的快...     

基于核糖体蛋白质标志物及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术快速鉴定糖丝菌属放线菌

【目的】糖丝菌属(Saccharothrix)是一类丝状稀有放线菌,在生物医药、工业酶制剂和环境修复等领域展现出应用价值。本研究尝试建立以核糖体蛋白质为标志物,利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)技术鉴定糖丝菌属放线菌的方法。【方法】检索基因组数据库,提取糖丝菌属测序菌株15种核糖体蛋白质的序列并计算理论分子量;通过分子量比对分析糖丝菌属不同菌种之间及其模式菌株与邻近属菌种模式菌株之间15种核糖体蛋白质的匹配度,提出鉴定至菌种及属的核糖体蛋白质匹配数标准;选取目标属和非目标属菌种进行MALDI-TOF MS测试和分析并修正鉴定标准。【结果】将待测菌株的MALDI-TOF质谱峰与糖丝菌属各菌种模式菌株的15种核糖体蛋白质分别匹配,通过最大匹配数、质谱峰强度模式及特征质谱峰鉴定至属或种。【结论】本研究建立了基于15种核糖体蛋白质标志物及MALDI-TOF MS技术鉴定糖丝菌属放线菌的方法,可用于定向筛选和快速鉴...     

规模化蛋白质鉴定中母离子的准确检测技术研究

蛋白质组学的基础研究之一是蛋白质鉴定.规模化的蛋白质鉴定通常采用"鸟枪法",即选择一些酶切肽段(母离子)碎裂生成二级谱图,通过二级谱图及其母离子质量鉴定肽段,再推断对应的蛋白质.在鉴定过程中,母离子质量是一个关键参数.母离子是否是肽段的单同位素峰决定了正确肽段是否能进入候选,母离子的质量精度决定了候选肽段的数目.本文从判断单同位素峰和系统误差校准这两个角度研究了母离子的准确检测技术.判断单同位素峰的技术在蛋白质上已有研究,包括电荷判断、单同位素峰判断和重叠同位素峰判断.可以借鉴蛋白质水平的技术研究母离子的单同位素峰判断方法.同时母离子的系统误差校准也有较为成熟的方法.这两个角度的研究有助于提高规模化蛋白质的鉴定率.     

纳升电喷雾串联质谱技术对阻断泛素通路诱导凋亡相关蛋白质的鉴定

应用毛细管液相色谱 电喷雾 四极杆 飞行时间串联质谱和纳升电喷雾 四极杆 飞行时间串联质谱技术 ,对阻断白血病细胞泛素通路诱发的凋亡相关蛋白质进行了鉴定。通过双向电泳发现 ,蛋白质斑点H在阻断Mo7e白血病细胞泛素通路 2h之后 ,表达量明显增加 ,6h达到最高。该斑点经MALDI TOF MS肽质量指纹谱分析未获结果 ,但通过上述 2种串联质谱技术获得其胰蛋白酶水解肽段的串联质谱图和肽段的全长序列 ,经检索均确认为RhoGDIβ蛋白。进一步发现阻断泛素通路还诱发了另 2个斑点出现 ,位于H点附近 ,经鉴定为同一蛋白质 ,可能是不同翻译后修饰所造成     

一种优化的MALDI-TOF质谱分析多肽C端序列方法

利用基质辅助激光解吸飞行时间 (MALDI TOF)质谱技术 ,测定羧肽酶Y消化蛋白质和多肽 .所产生的缩短肽片段的质量 ,在一张谱图上得到各个不同酶解时间所形成的肽质量梯度 .根据谱图中相邻两肽峰的质量差得到切去氨基酸的信息 ,从而读出C端氨基酸序列 .在pmol水平下对人促肾上腺皮质激素片段 (ACTH 1 3 9) ,人血管紧张肽片段 (angiotensin Ⅰ ,angiotensin Ⅱ )的C端序列进行了测定 .讨论了在不同浓度 ,不同时间 ,不同温度下酶解所得到的序列测定结果 .在优化条件下 ,人ACTH片段得到了C端 2 0个氨基酸残基顺序 ,为目前C端序列分析所得到的最长序列     

毛细管区带电泳／串联质谱联用法鉴定多肽和蛋白质

建立了毛细管区带电泳－串联质谱联用（ＣＺＥ／ＭＳ／ＭＳ）对多肽和蛋白质高灵敏度鉴定方法,对Ｍｅｔ－脑啡肽和Ｌｅｕ－脑啡肽的混合物进行了分析,用ＣＺＥ／ＭＳ／ＭＳ方法验证了各自的序列,同样对细胞色素ｃ的胰蛋白酶酶解产物用ＣＺＥ／ＭＳ／ＭＳ方法进行了肽质谱分析,几科所有肽段的序列及其与在分子中的位置都得到了确定,通过ＳＥＱＵＥＳＴ软件进行蛋白质序列数据库搜索得到准确的鉴定结果,所消耗的样品量均在低皮可     

Peptide Sequencing by Mass Spectrometry for Homology Searches and Cloning of Genes

It is now possible to obtain sequence information from gel-separated proteins by mass spectrometry at levels too low for conventional approaches. Usually this tandem mass spectrometric data are used for database searches with the aim of identifying the corresponding gene. Recently it has been shown that long and accurate amino acid sequences can be obtained which are sufficient for PCR-based strategies to clone the corresponding gene [Wilm et al. (1996), Nature 379, 466–469]. More than eight proteins have now been cloned based on that method. In many more cases the sequence information identified homologous proteins. Issues involved in cloning by mass spectrometric sequence information are discussed, as are two case studies. These results clearly establish mass spectrometry as a viable tool not only for the database identification of proteins, but also for the de novo sequencing of gel-separated proteins at the low-picomole to femtomole level.     

Identification of Protein Markers Specific for Papillary Renal Cell Carcinoma Using Imaging Mass Spectrometry

Since the emergence of proteomics methods, many proteins specific for renal cell carcinoma (RCC) have been identified. Despite their usefulness for the specific diagnosis of RCC, such proteins do not provide spatial information on the diseased tissue. Therefore, the identification of cancer-specific proteins that include information on their specific location is needed. Recently, matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry (MS) based imaging mass spectrometry (IMS) has emerged as a new tool for the analysis of spatial distribution as well as identification of either proteins or small molecules in tissues. In this report, surgical tissue sections of papillary RCC were analyzed using MALDI-IMS. Statistical analysis revealed several discriminative cancer-specific m/z-species between normal and diseased tissues. Among these m/z-species, two particular proteins, S100A11 and ferritin light chain, which are specific for papillary RCC cancer regions, were successfully identified using LC-MS/MS following protein extraction from independent RCC samples. The expressions of S100A11 and ferritin light chain were further validated by immunohistochemistry of human tissues and tissue microarrays (TMAs) of RCC. In conclusion, MALDI-IMS followed by LC-MS/MS analysis in human tissue identified that S100A11 and ferritin light chain are differentially expressed proteins in papillary RCC cancer regions.     

基于质谱技术的蛋白质互作研究进展

蛋白质作为生命活动的执行者,其功能往往体现在与其他蛋白质的相互作用中,研究蛋白-蛋白相互作用对于人们深入了解和预防传染病、靶向治疗多基因疾病、阐明蛋白质的分子作用机制及各种复杂的生命现象具有重要意义。目前,有多种技术被用来研究蛋白间的相互作用,研究难点在于实时捕获瞬时或弱蛋白质间的相互作用,质谱技术（mass spectrometry, MS）可在某种程度上解决该难点。由于质谱技术可研究简单的蛋白质复合物再到大规模的蛋白质组实验,基于质谱技术研究蛋白质间相互作用被越来越多地应用于科学研究中。综述了蛋白质间相互作用检测方法的研究进展,重点介绍了氢氘交换质谱法和化学交联质谱法研究蛋白质间相互作用的优缺点及其应用,最后对基于质谱技术研究蛋白质间相互作用进行了总结与展望,以期为深入开展相关研究提供借鉴。     

MALDI-TOF-MS对寡核苷酸的序列分析

通过对几种基质测定含不同碱基的寡核苷酸的灵敏度及精确度的比较,发现用混合基质α－氰基４－羟基肉桂酸（α－Ｃｙａｎｏ）／３－羟基吡啶羧酸（３ＨＰＡ）用于基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱中测定脱氧寡核苷酸,不仅能得到较好的分子离子峰,而且一些金属离子的加合物峰能得到有效的抑制,提高了测定的灵敏度。用３′－和５′－外切酶对脱氧寡核苷酸１２－ｍｅｒ（５′－ＡＴＧＣＡＴＡＴＧＣＡＴ－３′）进行部分降解,再进行ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析,得到了完整的寡核苷酸的序列。     

双向电泳和肽质量指纹谱技术鉴定支气管上皮细胞恶性转化相关蛋白质ANX1-human

采用 2 - D PAGE及质谱技术对α粒子照射诱发人支气管上皮恶性转化细胞的不同阶段进行了比较蛋白组分析与鉴定 .2 - D电泳后在分子量 1 4.4～ 94k D,等电点 3～ 1 0范围内分离出约 1 1 0 0个不同蛋白质斑点 .对等电点约 7,分子量约 40 k D的蛋白质点进行了质谱分析 .鉴定出分子量为38.58k D、等电点 6.64的蛋白质 ANX1 - human(脂皮质蛋白 ,lipocortin ) ,并且发现该蛋白质在BEP2 D细胞恶性转化过程的不同时期存在差异表达 .提示蛋白质 ANX1 - human参与了支气管上皮细胞恶性转化过程 ,与细胞恶性转化相关 .     

利用碱性磷酸酶初步判定二维电泳中蛋白质磷酸化修饰

磷酸化是蛋白质最重要的翻译后修饰形式之一.以二维电泳为基础的蛋白质组学是发现蛋白磷酸化状态改变的有效途径. 本文介绍了在用于二维电泳的蛋白样品制备过程中,利用小牛肠碱性磷酸酶成功去除蛋白质上磷酸基团的过程. 该技术将去磷酸化作用和蛋白质组学手段联系在一起,为蛋白质磷酸化修饰的初步判定提供了简便、经济、切实可行的方法.