白蜡虫碱性磷酸酶功能基团的研究

白蜡ricerus pela雌成虫经匀浆,正丁醇抽提,硫酸铵分段盐析,SephadexG-150凝胶过滤等步骤,得到比活力为136.65U/mg蛋白酶制品,用苯甲基磺酰氟、N-溴代琥珀酰亚胺、三硝基苯磺酸、二巯基苏糖醇、对氯汞苯甲酸、琥珀酸酐、溴乙酸、碘乙酸等化学修饰剂在一定条件下选择修饰白蜡虫碱性磷酸酶的几种氨基酸残基,并测定酶活力变化。结果表明：苯甲基磺酰氟、N-溴代琥珀酰亚胺、三硝基苯磺酸、琥珀酸酐、二巯基苏糖醇的修饰能显著抑制酶的活力,活力的降低与修饰剂的浓度有关,氯汞苯甲酸、溴乙酸、碘乙酸的修饰对酶的抑制作用影响较小。初步认为：丝氨酸、赖氨酸和色氨酸残基是白蜡虫碱性磷酸酶的必需功能基团,部分二硫键也是酶的催化功能所必需的。     

金属离子对牛小肠碱性磷酸酶的影响

经Tris-HCl缓冲液抽提,硫酸铵分级分离沉淀,2次DEAE-32柱层析和Sephadex G-150凝胶过滤,从牛小肠中得到碱性磷酸酶(ALP),提纯倍数为50.69倍,比活为48.87 U/mg,酶液经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测呈现单一条带.该酶催化底物对硝基苯磷酸二钠(pNPP)水解反应的最适pH值为9.7,最适温度为45℃.研究了多种金属离子对牛小肠碱性磷酸酶活性的影响,结果表明:一价金属离子Na+、K+对酶活力没有影响;不同的二价金属离子对酶的影响不同,过渡态金属离子中,Ni2+、Co2+对酶的活力影响不大,Mg2+、Ca2+、 Mn2+对酶有不同程度的激活作用,Zn2+、Cu2+对酶有抑制作用;重金属离子Pb2+、Cd2+对酶的活力起抑制作用.     

碱性磷酸酶分离纯化和比活性测定实验的优化

实验采用低温预处理兔肝和有机溶剂,实验前做好肝匀浆的方法,分级提取兔肝碱性磷酸酶。经过对酶提取过程中实验条件的优化,实验结果明显改善,同时也提高了学生的实验技能和实验教学效果。     

盐酸胍对人类胎盘碱性磷酸酶构象与活力的影响

研究人类胎盘碱性磷酸酶（ＰＬＡＰ,Ｅ．Ｃ．３．１．３．１）在胍变性过程中构象与活力的变化;测定胍存在时酶的表观米氏常数（Ｋｍ）。结果表明,低浓度的盐酸胍（＜０．５ｍｏｌ／Ｌ）使变性平衡态酶的发射荧光强度略有下降,酶活力增强;随盐酸胍浓度的增加,其荧光强度不仅不再下降,反而升高,酶逐渐失活;当盐酸胍浓度为１．５ｍｏｌ／Ｌ时,其荧光光谱的最大峰位红移,酶活力迅速下降;当盐酸胍浓度为３ｍｏｌ／Ｌ时,峰位由３３３．５ｎｍ红移至３５７．１ｎｍ,此时酶活力丧失;当盐酸胍浓度为４ｍｏｌ／Ｌ时,峰位不再红移,但其荧光强度继续增加。测得变性初态酶的表观Ｋｍ值随盐酸胍浓度的增加而增大。结果说明,荧光强度的增加和最大发射峰位的红移是该酶变性失活的一个灵敏指标;酶活力的变化明显快于酶分子整体构象的变化;低浓度的盐酸胍微扰了酶活性部位的构象,而对其整体构象无显著影响。提示酶活性部位具有柔性。     

重金属镉对鲫鱼碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性的影响

研究了重金属镉对鲫鱼肠、肝胰脏、鳃组织碱性磷酸酶和酸性磷酸酶活性的影响。结果表明,在0.2、0.4、0.8mg/L镉浓度条件下静态染毒12h、24h、48h、96h后,鲫鱼肠、鳃组织中碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)的活性降低,肝和胰脏的碱性磷酸酶活性没有明显变化,其酸性磷酸酶活性则升高。     

无机磷酸盐对耐热碱性磷酸酶耐热性的影响

 为研究体外磷酸根离子对嗜热菌 (Thermussp .30 4 1)碱性磷酸酶TAPND2 7耐热性的影响 ,通过克隆于高表达质粒上编码TAPND2 7的基因在E .coli中的诱导表达和蛋白产物的纯化 ,获得了电泳纯的TAPND2 7.耐热性实验表明磷酸根离子能显著提高该酶的热稳定性 ,在 10mmol L磷酸根离子存在下 ,TAPND2 7的Tm 值从 91℃上升到了 97℃ ;酶的动力学实验证实无机磷酸盐 (Pi)对TAP ND2 7的酶活性有可逆竞争性抑制作用 ,Ki 值为 0 99× 10 -4 mol L .上述结果说明 ,TAPND2 7耐热性的提高是由于磷酸根离子对TAPND2 7活性位点的竞争性结合 ,这种结合 ,推测为Pi 与氨基酸残基间的非共价相互作用 ,减小了TAPND2 7的自由能 ,从而提高了它的热稳定性     

大肠杆菌碱性磷酸酶的体外定向进化研究

大肠杆菌碱性磷酸酶（E.coli alkaline phosphatase, EAP, EC 3.1.3.1）是一个非特异性二聚体磷酸单酯酶. 采用易错聚合酶链反应(error prone PCR)的方法,在原有高活力突变株的基础上,对EAP远离活性中心催化三联体的区域进行定向进化,经两轮error prone PCR,获得催化活力较亲本D101S突变株提高3倍、较野生型酶提高35倍的进化酶4-186,并对该酶的催化动力学特征进行了分析. 进化酶基因的DNA测序表明4-186含两个有义氨基酸置换：K167R和S374C,二者既不位于底物结合位点,也不位于酶的金属离子结合位点.     

环境因子对日本沼虾消化酶和碱性磷酸酶的影响

研究了水环境中不同Ca2 + 浓度 (2 0、35、6 0、80和 15 0mg·L-1)、盐度 (7、14和 2 0‰ )和 pH(7 6、8 8和 9 8)对日本沼虾 (Macrobrachiumnipponense)肝胰腺中消化酶 (胃蛋白酶和类胰蛋白酶 )和碱性磷酸酶的影响 .结果表明 ,Ca2 + 对日本沼虾的胃蛋白酶有促进作用 ,Ca2 + 浓度为 15 0mg·L-1时酶活力最高 ;高浓度的Ca2 + 对类胰蛋白酶有抑制作用 ,而在一定范围内 ,碱性磷酸酶活力随Ca2 + 浓度的增高而增高 .盐度为 14‰时 ,日本沼虾的胃蛋白酶、类胰蛋白酶和碱性磷酸酶活力均高于 7‰和 2 0‰组 .随着 pH值升高 ,蜕皮率和 3种酶活力也随之增高 ,pH9 8时均达到最高值 ,但增长率和增重率则降低 .     

五氯酚对人胎盘碱性磷酸酶抑制的研究

监测人胎盘碱性磷酸酶在不同浓度五氯酚溶液中活力与荧光光谱的变化;测定五氯酚对其抑制的类型及pH对其抑制的影响.结果显示：低浓度的五氯酚(＜1.0 mmol/L)使酶活力及其荧光强度迅速下降,发射峰位明显红移;继续提高五氯酚浓度,其活力与荧光强度逐渐下降,发射峰位仍在红移;五氯酚浓度为5.0 mmol/L时,荧光淬灭,但酶仍保留51.4%的活力;五氯酚浓度高达10.0 mmol/L时,酶剩余活力为30.0%.进一步实验表明五氯酚使L-色氨酸的荧光强度降低,并伴有发射峰位的红移,当五氯酚浓度为5.0 mmol/L时,L-色氨酸的荧光淬灭.五氯酚是人胎盘碱性磷酸酶的反竞争性抑制剂,其抑制常数(K_i)为3.86 mmol/L.其抑制也受溶液pH影响,pH＜7.5时,对酶无抑制;pH为7.5～10.5时,随pH的增加,抑制作用逐渐增强.提示五氯酚能够进入酶分子内部使其荧光淬灭,并抑制了酶活力;表明酶活力抑制与五氯酚的解离状态有关.     

白蜡虫雌成虫某些生化成分分析

分析了白蜡虫雌成虫含氮 6.3 3 4 %、蛋白质 3 9.59% (含非蛋白氮 )、脂肪 6.2 556% ,其碘价68.877。白蜡虫乙醇提取液含氮 0 .2 60 %、蛋白质 0 .656%、还原糖 3 3 %、总糖 7 0 0 % ,测定出含有 1 7种氨基酸 ,其中以His、Glu、Ala含量较高。测定了Ca、Fe、Mg、Al、Ba、Co、Mn、Sr、Zn、P元素的含量 ,其中Ca、Mg、P含量较高。微量元素较为丰富     

白蜡虫七种寄主植物枝条树皮比较解剖研究

采用常规石蜡切片法解剖观察了白蜡虫7种寄主植物一年生枝条树皮横切面结构特征,结果表明:白蜡虫7种寄主植物一年生枝条树皮从内到外由次生韧皮部、初生韧皮部纤维束、皮层和周皮组成;次生韧皮部横向系统均由筛管、伴胞和薄壁细胞组成;轴向系统由射线组成。木栓层以美国白蜡和流苏细胞层数最多,达10～12层;华南小蜡、紫药女贞和白枪杆次之,为5～8层;女贞和白蜡树最少,分别为2～3和3～4层。初生韧皮部纤维束排列整齐连接为带状或分散,女贞属纤维连接成带状,白蜡属和流苏属纤维分散。带状纤维层厚薄不均,厚度在26.93±13～59.15±7μm之间,以白枪杆纤维层最厚,为59.15±7μm;美洲白蜡次之,为50.05±7μm;白蜡树最薄,为26.93±13μm。分散型纤维束直径在25.12±13～76.15±36μm之间,纤维束直径大小顺序为:流苏(76.15±36μm)>紫药女贞(43.44±10μm)>女贞(25.12±13μm)。女贞、紫药女贞和流苏纤维束间距分别为78.53±39μm、149.78±27μm和212.02±95μm。次生韧皮部厚度在48.52±12～377.44±24μm之间,以女贞的次生韧皮部最厚,达377.44±24μm,华南小蜡最薄,为48.52±12μm。树皮次生韧皮部厚、木栓层数少和纤维束直径小为白蜡虫优良寄主植物的显著特征。     

白蜡虫及其寄主植物游离氨基酸的研究

作者研究了白蜡虫越冬前后体内游离氨基酸的组成及变化 ,并通过对虫体、蜜露及被寄生植物游离氨基酸含量及百分率组成进行对比分析 ,探讨了白蜡虫对游离氨基酸的利用问题。虫体含量较高的氨基酸有丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸。大部分氨基酸及其总量在越冬期下降 ,越冬以后升高 ,逐渐超过越冬前水平。虫体大量吸收的氨基酸是丙氨酸 ,利用较少的氨基酸是天门冬氨酸 ,其它氨基酸或多或少地为白蜡虫所利用。     

白蜡虫体内杀雄菌属(Arsenophonus)共生菌的分子检测

[目的]研究白蜡虫体内杀雄菌属(Arsenophonus)共生菌的含量与白蜡虫性比之间的关系.[方法]采用16S rDNA文库的方法对白蜡虫雄虫体内的共生菌进行分析,利用杀雄菌属特异的2条16S rDNA引物以及23S rDNA引物进行PCR检测.对昭通、昆明、金口河、杭州、长春、江华6个不同地理种群白蜡虫体内的杀雄菌属共生菌进行半定量分析,并采用荧光定量PCR对昭通、昆明、金口河白蜡虫体内的杀雄菌属共生菌进行绝对定量分析.[结果]在白蜡虫体内首次发现杀雄菌属共生菌.在白蜡虫雌雄虫体内均扩增出杀雄菌属的两条不同长度的16S rDNA序列,分别为445bp和1462bp,并扩增得到长度为582bp的23S rDNA序列.杭州和江华地理种群白蜡虫的一些个体不含杀雄菌属共生菌.昭通地理群的杀雄菌属共生菌含量显著高于金口河和昆明,而昆明和金口河白蜡虫的杀雄菌属含量无显著差异.[结论]白蜡虫体内杀雄菌属共生菌的含量与白蜡虫性比无关.     

环境因子对白蜡虫泌蜡的影响

白蜡虫是一种具有重大的经济价值资源昆虫,白蜡虫分泌的白蜡是一种重要的天然化工原料。研究了不同温度、湿度、光照等因子对白蜡虫泌蜡的影响,试验种群和自然种群研究结果表明,白蜡虫在15～25℃下能正常分泌白蜡和生长发育,在30℃以上的持续恒温下,白蜡虫能分泌白蜡,但泌蜡量低,不能正常生长发育,化蛹,2龄末期死亡;在高湿度（年相对湿度〉80％）、低光照（〈1600h／a）条件下,白蜡虫泌蜡量高,但种群不能正常生长发育,雌虫死亡率高,不能完成生活史。多因素分析表明,白蜡虫泌蜡对温度不敏感,影响白蜡虫泌蜡的关键因子是湿度和光照,适于白蜡虫泌蜡的环境因子为：温度15～25℃、年降雨量1300～2000mm,年相对湿度〉80％,泌蜡期5～8月份的相对湿度〉90％,年光照时数〈1600h／a。根据在峨嵋、昭通、昆明等地对白蜡虫的生态适应性观察和分析,白蜡虫泌蜡高的环境不是白蜡虫适生区域,白蜡虫适生区域主要生态指标为：年均温11～16℃,降雨量800～1200mm／年,年相对湿度65％～75％,年光照时数为1900～2500h／a。     

Characterization and functional assay of a fatty acyl‐CoA reductase gene in the scale insect,Ericerus pela Chavannes (Hemiptera: Coccoidae)

Ericerus pela Chavannes (Hemiptera: Coccoidae) is an economically important scale insect because the second instar males secrete a harvestable wax‐like substance. In this study, we report the molecular cloning of a fatty acyl‐CoA reductase gene (EpFAR) of E. pela. We predicted a 520‐aa protein with the FAR family features from the deduced amino acid sequence. The EpFAR mRNA was expressed in five tested tissues, testis, alimentary canal, fat body, Malpighian tubules, and mostly in cuticle. The EpFAR protein was localized by immunofluorescence only in the wax glands and testis. EpFAR expression in High Five insect cells documented the recombinant EpFAR reduced 26‐0:(S) CoA and to its corresponding alcohol. The data illuminate the molecular mechanism for fatty alcohol biosynthesis in a beneficial insect, E. pela.     

白蜡虫far3基因cDNA全长克隆、原核表达和酶活分析

脂酰辅酶A还原酶(FAR)可将脂酰辅酶A还原为相应的脂肪醇,在白蜡生物合成中起至关重要的作用。本研究通过cDNA末端快速扩增技术获得白蜡虫Ericerus pela far3基因cDNA全长,其开放阅读框(ORF)1 566 bp。对白蜡虫FAR3编码蛋白进行系统发育分析,发现FAR3与人类Homo sapiens、小鼠Mus musculus、黑腹果蝇Drosophila melanogaster等物种的FAR聚为一支;成功构建pET-30a eGFP/EpelFAR3原核表达质粒,转入大肠杆菌Escherichia coli BL21感受态细胞,在浓度为0.05 mmol·L^-1的异丙基硫代半乳糖苷诱导6 h后有较高的蛋白表达量;经Western blot验证,表达蛋白分子量与预估蛋白分子量符合;质谱分析蛋白质分值为3 900,肽段覆盖度74%,所得肽段与理论序列相符;利用底物C24脂酰辅酶A、C26脂酰辅酶A、C28脂酰辅酶A和C30脂酰辅酶A对原核表达蛋白进行活性分析,利用气相色谱进行蛋白活性验证,没有理论产物相应脂肪醇的生成。本研究中白蜡虫far3 cDNA ORF的获得及原核表达的实现,为进一步的功能和组织表达定位研究奠定了基础。     

影响白蜡虫泌蜡主要气候因子及白蜡虫生态适应性分析

白蜡虫是一种具有重要经济价值的资源昆虫,其生态适应性问题长期存在争议。本文对四川 峨嵋、云南昆明、昭通等地白蜡虫自然种群生态学和泌蜡生态特性进行了对比研究。泌蜡与 种群死亡率的研究结果证实,在不利于种群生长的环境中白蜡虫的泌蜡量较高,死亡率也高; 而在适生环境中的泌蜡量较低,死亡率较低。故认为,传统上以白蜡虫泌蜡量的高低来作为适应生态环境的判断标准是不适合的。本文还从白蜡虫泌蜡生态适应性的角度分析了“高山产虫、低山产蜡”的原因,讨论了白蜡虫的生态适应性,得出白蜡虫适生区域主要生态指标为：年均温11℃～16℃,雨量800～1 200 mm／a,年相对湿度75％左右,年光照时数为1 900～2 500 h／a。提出白蜡虫泌蜡是其为适应环境的一种自身的保护性反应和生态对策,是对不良环境的一种抵御性反应。     

白蜡虫蜡花微生物多样性分析

【目的】探究白蜡虫Ericerus pela(Chavannes)雄若虫分泌的蜡花中微生物的多样性,比较不同厚度蜡花(随雄若虫发育蜡质层厚度增加)中细菌及真菌的种类和变化。【方法】采用Mi Seq高通量测序方法对不同发育阶段白蜡虫雄若虫分泌的蜡花中细菌16S rRNA和真菌ITS进行测序,利用Mothur软件计算蜡花中细菌和真菌的操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU)及其丰富度、Alpha多样性分析。【结果】细菌3个样品共获470个OTU,真菌2个样品共获264个OTU。细菌共鉴定出18门30纲92科173属;真菌共鉴定出3门15纲43科68属。其中丛毛单胞菌属Comamonas细菌在蜡花中为优势菌,分别占前、中、后期雄若虫分泌的蜡花中细菌总量的79.79%,41.61%和46.86%;枝胞属Cladosporium在前期雄若虫分泌的蜡花中占真菌总量的17.01%,隐球菌属Cryptococcus在后期雄若虫分泌的蜡花中占真菌总量的60.84%,是蜡花中真菌重要组成部分。【结论】不同发育阶段雄若虫分泌的蜡花中细菌及真菌群落存在差异,随着蜡花厚度增加,细菌多样性先增加后减少,而真菌多样性降低。