牧草植物鹰嘴紫云英的遗传转化

鹰嘴紫云英(Astragalus cicer)是一种优良的豆科牧草。 15kD玉米醇溶蛋白是一种富硫的蛋白质,含硫氨基酸占总氨基酸量的15.63%。本文通过农杆菌(Agrobacterium)的介导将rbcS启动子调控的15kD玉米醇溶蛋白基因的嵌合质粒导入鹰嘴紫云英,得到转化的植株。这些植株具有NPTⅡ酶活性,抗卡那霉素。Southern blot分子杂交表明,15kD玉米醇溶五白基因已转化并整合入鹰嘴紫云英的核基因组中。     

10kD玉米醇溶蛋白基因的克隆与植物表达载体构建

由于紫花苜蓿中的含硫氨基酸水平很低,采用基因工程手段将富硫蛋白基因-10kD玉米醇溶蛋白(zein)基因转入苜蓿中以提高其水平。根据该基因的保守序列设计引物,并在下游引物终止密码子前引入内质网驻留蛋白信号序列(KDEL),通过PCR技术从玉米(Zea mays L.)黄化幼苗基因组中扩增目的基因的开放阅读框(ORF)。序列测序得到全长为465bp的目的片断,该片段编码154个氨基酸,其中甲硫氨酸(M)31个占20.13%,半胱氨酸(C)6个占3.90%,含硫氨基酸共占24.03%。该基因与报道的10kD玉米醇溶蛋基因具有很高的同源性。将该基因构建到植物表达载体pCAMBIA13011上,以转化紫花苜蓿提高其含硫氨基酸的水平。     

大豆含硫氨基酸相关酶基因发掘

大豆(Glycine max)含硫氨基酸合成途径中的酶基因是含硫氨基酸组分的重要调控基因,发掘相关酶基因对高含硫氨基酸分子育种具有重要意义。文章采用大豆物理与遗传整合图谱,通过BioMercator2.1将113个含硫氨基酸合成途径酶基因及33个控制含硫氨基酸含量的QTL整合到遗传图谱Consensus Map 4.0上,依据酶基因位点与QTL的一致性以及QTL的效应值,初步筛选到16个与含硫氨基酸合成相关的候选基因。通过生物信息学方法对候选基因进行拷贝数、SNP、表达谱等分析,鉴定到12个相关酶基因,分别位于D1a、M、A2、K和G等8个连锁群上。生物信息学分析显示这些基因所在QTL可解释含硫氨基酸遗传变异的6.0%~38.5%,其中9个基因的间接效应值超过10%。12个相关酶基因参与含硫氨基酸代谢的重要途径,且多在子叶、花中高丰度表达,存在丰富的SNP。这些基因可作为候选基因进行功能标记开发,将为大豆分子设计育种奠定基础。     

人γ干扰素突变体(rIFN-γ132-PGIL)的构建及其生物学活性的测定

利用DNA重组技术,去掉人γ干扰素(IFNγ)基因3′端含编码多肽羧基(C)端11个氨基酸的核苷酸序列,与编码P,G,I,L的DNA序列相连接,构成IFNγ突变体(rIFN-γ132-PGIL)基因,将后者插入pBV220P_RP_L串连启动子下游,转化大肠杆菌DH5α,在CIts857基因的调节下,通过升温诱导,获得了高效表达,表达量约占菌体可溶性蛋白的30％以上,抗病毒活性平均可达4.9×10~-8U/L,比母体菌株高10倍。SDS—PAGE结果表明,rIFN-γ132—PGIL分子量为17kd。     

苜蓿高含硫氨基酸蛋白转基因植株再生

通过农杆菌介导法将高含硫氨基酸蛋白基因转入苜蓿,成功地诱导转基因植株再生,转化植株生长和发育良好,苜蓿子叶外植体是较理想的转化受体。冷凉湿润的环境条件是苜蓿移栽成活率高所必需的。     

紫花苜蓿外源基因共转化植株的再生

高含硫氨基酸蛋白(HNP)基因和发根(rol)基因由发根农杆菌介导转入紫花苜蓿, 成功地从子叶毛根组织诱导转基因植株再生. 子叶是较理想的转化受体, 毛根年龄与紫花苜蓿体细胞胚分化频率呈负相关. 共转化植株高产、优质性状的产生对紫花苜蓿新品种的培育有重要意义.     

酵母pro 2基因转化紫云英的研究

用外植体一农杆菌共培养法将酵母脯氨酸合成酶基因2(pro 2)导入豆科牧草紫云英,获得转基因植株。Southern blot分析检测到转化植株基因组中存在外源DNA的同源顺序,证明酵母pro 2基因已整合到紫云英细胞基因组中。转化植株具有强的NPT Ⅱ酶活性,而对照植株呈阴性反应。在含0.5%NaCl的培养基上,紫云英植株内游离脯氨酸含量增高,一些转化植株叶片内游离脯氨酸含量显著高于对照,而且耐盐性有所提高。转化植株移栽到土壤中开花结实,收获到R_1代种子。     

黄芪属六种植物的核型多样性

采用常规压片法,对豆科黄芪属6种植物制备染色体标本进行核型分析。结果表明:体细胞中期染色体数目分别为:沙打旺、斜茎黄芪、达乌里黄芪2n=16,均为二倍体;草木樨状黄芪2n=32,为四倍体;紫云英、鹰嘴紫云英则呈现多数目性,紫云英染色体数变动范围为55～65,64条稍多,鹰嘴紫云英染色体数变动范围51～65,62条稍多,均为混倍体。核型公式分别为:沙打旺2n=2x=16=12m+4sm;斜茎黄芪2n=2x=16=10m+6sm;达乌里黄芪2n=2x=16=16m;草木樨状黄芪2n=4x=32=32m;紫云英2n=64=62m+2sm;鹰嘴紫云英2n=62=12M+50m(2SAT)。染色体核型呈现多样性。     

紫云英根瘤菌基因文库的构建及含完整结瘤基因的重组质粒pRaZ15的分离

以紫云英根瘤菌菌株7653R为材料,制备总DNA,经EcoRⅠ限制酶部分酶解,通过10—50％蔗糖梯度离心,分离到20一30 kb的DNA片段。利用能在革兰氏阴性菌中转移和复制的广谱寄主载体——pLAFRl质粒,构建了紫云英根瘤菌基因文库。通过与苜蓿根瘤菌102l菌株中8．7kb的共同结瘤基因(作探针DNA)杂交,从基因文库中分离到紫云英根瘤菌共同结瘤基因片段。以紫云英根瘤菌不结瘤突变株7653R+1(7653R消除共生质粒)为受体、构建的7653R基因文库(E．Coli C600)为供体,通过协助转移质粒pRK2013(LE392)进行三亲交配,在含四环素的根瘤菌台成培养基(sM)上选择接合转移子。将得到的所有接台转移子混合在一起接种植物,通过植物结瘤试验,分离到含紫云英根瘤菌结瘤基因的重组质粒pRaz15。将该质粒用EcoRⅠ完全酶切,得到25kb左右的外源DNA片段,该片段携带完整的结瘤基因簇。     

玉米醇溶贮藏蛋白基因启动子PCR扩增及其驱动GUS基因在转基因烟草种子中的表达

以玉米(Zea mays L.)黄化苗为材料,利用PCR技术扩增了玉米19kDa醇溶贮藏蛋白基因(zein)起始密码子上游启动子片段,序列分析结果表明,克隆的-1～-694片段具有19kDa zein启动子特点,与同一家族中其它基因的对应区段同源性达90％以上。将此启动子插入pPKGT的GUS基因及NOS终止子上游构成表达载体。经农杆菌转化烟草(Nicotiana tabaccum Var.samsum),得到了转化植株。转化的烟草的PCR扩增及Southern杂交证明目的片段已整合到烟草基因组中。转基因植株的GUS活性检测表明,在叶、根中无GUS活性,GUS活性只存在于种子中。转基因植株烟草种子经冷冻切片,GUS底物Xgluc活体组织染色证明GUS活性只存在一层介于种子胚乳与种皮之间的细胞中。     

苏云金芽孢杆菌以色列亚种130kd杀蚊蛋白基因的克隆与鉴定

以人工合成的130kd杀虫蛋白基因的18—base序列为探针,通过SoutherD分子杂交,验证了在Bacillus thuringiensis var.israelensis 4Q5菌株75Md质粒上含有130kd杀蚊蛋白基因,并且证明了提纯的晶体蛋白具有杀蚊幼虫活性。对该质粒进行HindIII完全酶切,以pUCl8为载体,以E．Coli TG1为受体,得到四个与探针有强杂交信号的阳性克隆,其中两个(pFH2,PFH4)含有5．2kb HindIII插入片段,包含第一类130kd杀蚊蛋白基因;另两个(pFHI,pFH3)含有2．3kb HindIII插入片段,包含第二类13 0kd杀蚊蛋白基因的3'部分。pFH2和pFH4中,第一类130kd杀蚊基因的插入方位不同。     

电融合法产生骆驼刺与鹰嘴紫云英属间体细胞杂种

采用电融合法获得了骆驼刺和鹰嘴紫云英属间体细胞杂种。骆驼刺原生质体来自发根农杆菌A4转化系细胞,并经碘乙酰胺处理;鹰嘴紫云英原生质体从甲硫氨酸抗性系细胞分离。双亲及同源融合产物均不能在无激素的筛选培养基上持续分裂,融合后的杂种细胞由于双亲生理互补效应可恢复持续分裂能力而被筛选出来。本实验优化了电融合参数,如直流脉冲、交流脉冲和脉冲次数。融合产物经培养获得的杂种细胞系经形态学、染色体数目检查、生化及随机扩增多态性DNA分析,鉴定出10个杂种克隆,并从3个杂种克隆再生了小植株。     

紫云英根瘤菌159中两个结构和功能不同的nodD基因

紫云英根瘤菌159含2个拷贝的nodD基因。核苷酸序列测定表明由nodD1和nodD2基因所推定编码的nodD1和nodD2蛋白其氨基酸顺序同源性为69％。功能分析显示,在紫云英根瘤菌中nodD1和nodD2基因均能自主表达。由nodD1推定的nodD1能与紫云英种子浸出液（诱导物）共同激活nod基因的表达,而由nodD2推定的nodD2则无此功能。     

‘云香’水仙ACC氧化酶基因的克隆表达分析及其遗传转化与鉴定

利用RT-PCR技术,从‘云香’水仙中克隆了1个新的ACO(ACC氧化酶)基因(NtACOY2)。NtACOY2基因全长975bp,开放阅读框(ORF)936bp,编码311个氨基酸残基,蛋白分子量为35.83kD。蛋白结构预测发现,该蛋白含有典型的ACO家族保守的DIOX_N和20G-FeⅡ_Oxy结构域。进化分析表明,NtACOY2编码的氨基酸序列高度保守。实时荧光定量PCR表明,NtACOY2在花瓣和副冠中的表达均随着‘云香’水仙花的衰老而逐渐上升,并且各个时期花瓣中的表达量均高于副冠,在花蕾期的花瓣中表达量达到最高,表明NtACOY2基因可能参与‘云香’水仙花的发育,并且与其花衰老密切相关。通过PCR和酶切反应鉴定,成功构建了NtACOY2基因的正反义植物表达载体,将正义载体经农杆菌介导转化烟草,PCR检测显示共有15株转化植株扩增出了与阳性对照大小相同的片段,进一步用RT-PCR鉴定阳性转化植株,最终获得了12株转基因烟草。随机选取2株转基因植株(Z1、Z2)与野生型(WT)完全相同条件下移栽温室培养,结果 Z1、Z2分别比WT提前8和7d开花,且转基因烟草花朵开放数量均多于野生型,表明NtACOY2在转录水平能够正常表达。实验结果为进一步研究NtACOY2基因的功能奠定了基础。     

斑节对虾溶菌酶基因克隆及序列分析

参考对虾溶菌酶基因和类溶菌酶基因及其他多种生物的溶菌酶基因序列 ,设计并合成引物。运用RT PCR技术 ,从斑节对虾血细胞总RNA中扩增获得特异性片段。所获片段回收纯化后克隆到pGEM TEasyVector系统的T载体上。重组子的序列分析表明 ,所克隆的斑节对虾溶菌酶基因片段长 6 5 8bp ,包括溶菌酶基因开放阅读框 (ORF)4 77bp和 3′端非编码区的 181bp。 4 77bpORF共编码 15 8个氨基酸 ,包括溶菌酶成熟肽 14 0个氨基酸残基和信号肽 18个氨基酸残基。斑节对虾溶菌酶成熟肽推测分子量为 16 ,32kd ,等电点为 8 78。与南美白对虾溶菌酶基因的碱基序列及推测氨基酸序列比较 ,同源性分别为 89 5 %和 93 0 % ;与日本对虾类溶菌酶基因的同源性分别为 84 0 %和91 0 %。进一步的序列分析表明 ,斑节对虾溶菌酶氨基酸序列与多种类群生物的c 型溶菌酶氨基酸序列具有较高的同源性 ,并具有与c 型溶菌酶相同的活性位点氨基酸残基Glu51和Asp68,且与活性位点相邻的序列高度保守。斑节对虾溶菌酶氨基酸序列还具有与c 型溶菌酶相同的结构氨基酸——— 8个半胱氨酸残基。因而可认为所克隆的斑节对虾溶菌酶基因属c 型溶菌酶基因。     

富硫蛋白基因对牧草百脉根的转化

豆科植物百脉根（ＬｏｔｕｓｃｏｒｎｉｃｏｆａｔｕｓＬ．）是一种优良的牧草。１０ｋＤ玉米醇溶蛋白是一种富硫蛋白,依分子数计算,含硫氨基酸占总氨基酸量的２５％。通过根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）的介导,将ｒｂｃＳ启动子及ＣａＭＶ３５Ｓ启动于调控下的１０ｋＤ玉米醇溶蛋白基因的嵌合质粒导入百脉根,得到转化的植株,其卡那霉素的抗性由ＢＮＰＴⅡ活性分析进一步得到证明。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明,１０ｋＤ玉米醇溶蛋白基因已整合到百脉根的核基因组中。     

紫云英根瘤菌159中两个结构和功能不同的nodD基因

紫云英根瘤菌１５９含２个拷贝的ｎｏｄＤ基因。核苷酸序列测定表明由ｎｏｄＤ１和ｎｏｄＤ２基因所推定编码的ＮｏｄＤ１和ＮｏｄＤ２蛋白其氨基酸顺序同源性为６９％。功能分析显示,在紫云英根瘤菌中ｎｏｄＤ１和ｎｏｄＤ２基因均能自主表达。由ｎｏｄ１推定的ＮｏｄＤ１能与紫云英种子浸出液（诱导物）共同激活ｎｏｄ基因的表达,而由ｎｏｄＤ２Ｒ推定的Ｎｏｄ２则无此功能。     

转HSSP基因大豆的分子检测和遗传稳定性分析

HSSP是用大豆密码子改造的10 kD玉米醇溶蛋白基因。在前期研究中,从获得的转基因大豆中筛选到1份单拷贝转基因材料GSDH5。该研究采用染色体步移法获取转基因大豆GSDH5的T-DNA插入位点的左边界旁侧序列,对获得的左边界旁侧序列进行分析,设计特异性引物,建立转基因大豆GSDH5特异性检测方法;采用Real-time PCR检测外源基因在转基因大豆不同组织部位(根、茎、叶、花和种子)中的表达量,采用RT-PCR和Western blot检测外源基因在转录和翻译水平上的遗传稳定性,并对转基因大豆GSDH5中的粗蛋白、含硫氨基酸含量及主要农艺性状进行测定分析,为培育高含硫氨基酸转基因大豆新品种奠定基础。结果表明:(1)分子鉴定显示,外源基因HSSP和筛选标记基因Bar成功整合到受体大豆‘东农50’基因组中,且以单拷贝的形式整合到大豆基因组中。(2)HSSP基因成功插入到大豆基因组1号染色体非编码区52 873 883 bp处。(3)HSSP基因在转基因大豆GSDH5的种子中特异性表达,且在T_2～T_4代转基因大豆中能够稳定遗传并表达。(4)‘东农50’粗蛋白含量在41.53%～43.32%之间,GSDH5粗蛋白含量在40.18%～43.03%之间,两者相比无显著差异;GSDH5种子中硫氨基酸占种子干样的比例为1.35%,占种子蛋白的比例为3.14%,与转基因受体品种‘东农50’相比,占比显著升高,分别增加了11%和16%。(5)转基因大豆GSDH5植株与受体品种‘东农50’在单株荚数、百粒重、株高、结荚习性、花色、叶形等方面均无显著差异,证明HSSP基因的插入对大豆植株的生长发育无不良影响。研究认为,转基因大豆GSDH5材料具备进一步培育成高含硫氨基酸大豆新品种的潜力。     

一个棉花微管结合蛋白基因GhSP1L5的克隆及表达分析

利用RT-PCR技术从处于快速伸长发育时期的棉花纤维组织中克隆得到Spiral1-Like(SP1L5)基因(GhSP1L5),其开放读码框为315 bp,编码105个氨基酸的蛋白质,生物信息学分析表明,GhSP1L5蛋白N端和C端较为保守,并含有SCOP结构域,是典型的微管结合蛋白。进化树分析表明该基因与SP1L5家族基因的亲缘关系较近。构建原核表达载体pET28a-GhSP1L5,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行体外诱导表达,通过SDS-PAGE检测目的蛋白的表达,获得分子质量约为12 kD的重组蛋白。QRTPCR结果分析表明GhSP1L5基因在开花后15和20 dpa的纤维组织中表达量较高,在棉纤维发育的其他时期及根、茎、叶组织中表达量较低。     

酵母pro2基因转化紫云英的研究

用外植体－农杆菌共培养法将酵母脯氨酸合成酶基因２（ｐｒｏ２）导入豆科牧草紫云英,获得转基因植株。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析检测到转化植株基因组中存在外源ＤＮＡ的同源顺序,证明酵母ｐｒｏ２基因已整合到紫云英细胞基因组中。转化植株具有强的ＮＰＴⅡ酶活性,而对照植株呈阴性反应。在含０．５％ＮａＣｌ的培养基上,紫云英植株内游离脯氨酸含量增高,一些转化植株叶片内游离脯氨酸含量显著高于对照,而且耐盐性有所