牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)糖蛋白E2单克隆抗体(MAb),利用原核表达并且纯化的重组糖蛋白E2(rE2)免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合.采用以BVDV为检测抗原的间接ELISA筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得2株稳定分泌抗E2特异性MAb的杂交瘤细胞株,分别命名为4E3与1G11.用4E3与1G11杂交瘤细胞株接种BALB/c小鼠制备腹水,采用rE2及BVDV包被的ELISA测得的效价分别是6.21×106和6.83×105及6.83×105和7.5×104.间接ELISA、Western blot、IFA试验表明两株杂交瘤细胞所分泌的MAb具有良好的反应性和特异性.经抗体亚类鉴定4E3与1G11均为IgM/K.特异性试验表明4E3与1G11这2株MAb均不与牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛腺病毒3型反应;其中4E3不与猪瘟病毒反应,而1G11则可与猪瘟病毒发生交叉反应,这种反应特性可试用于BVDV与猪瘟病毒的鉴别诊断.所制备的4E3与1G11 MAb可以用于BVDV抗原的检测,为建立检测BVDV E2蛋白血清抗体的ELISA奠定了基础.     

牛病毒性腹泻病毒的成熟和释放

试验中用电镜观察了牛病毒性腹泻病毒ＯｒｅｇｏｎＣ２４Ｖ株在感染新生牛睾丸细胞中的形态发生。成熟的病毒颗粒是直径约为５０ｎｍ的球形颗粒,内含直径约为３０ｎｍ的核心。病毒在宿主细胞的胞质内复制,通过糙面内质网膜出芽成熟。病毒可以通过外排或在细胞死亡后含有病毒颗粒的空泡崩溃而释放到胞外。     

牛病毒性腹泻病毒（BVDV）对牛免疫缺陷病毒（BIV）的激活作用

通过合胞体分析和反转录酶活力测定,首次证明牛病毒性腹泻病毒能激活牛免疫缺陷病毒的复制与表达,并进一步通过转染实验和凝胶电泳漂移分析证明,当ＢＩＶ ＬＴＲ的ＮＦ－ｋ Ｂ区缺失时,ＢＶＤＶ则不能实现其激活作用,ＢＶＤＶ直接或间接诱导牛ＮＦ－ｋＢ因子作用于ＢＩＶ ＬＴＲ的ＮＦ－ｋＢ区实现其激活作用。     

牛病毒性腹泻病毒的分子生物学研究进展

牛病毒性腹泻病毒（Bovineviraldiarrheavirus,BVDV）,也称牛病毒性腹泻一粘膜病病毒（Bovinevlraldi。h。一mucosaldi。。virus,BVD一MDV）,在分类学上属黄病毒科（Flaviviri－d。）,瘟病毒属（Pestiv＿）［l］。鉴于其基因结构及分子生物学特征近来也有人提议新设一瘟病毒科［’,’l。BVDV是瘟病毒属的代表病毒,与属内的猪瘟病毒（HOgCh。le。Vi。,HCV;或称CI。icalswinefevervi。s,CSFV）及羊边界病病毒（Borderdi。asevirus,BDV）,在血清学上有交叉反应［‘］,BVDV感染牛可引起多种临床症状,如：高热、流…     

牛病毒性腹泻病毒基因组cDNA文库的构建

以牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）┥ｎＬ株的基因组ＲＮＡ为模板,经逆向转录酶作用,合成第一链ｃＤＮＡ,再以ＲＮａｄｓｅ／Ｈ与ＤＮＡ聚合酶Ｉ联合作用合成ｄｓｃＤＮＡ,并以ｄＣ同聚物尾化。ｐＵＣ８ＤＮＡ在Ｐｓｔ Ｉ酶解后,以ｄＧ同聚物尾化,两者退火构成重组质粒,转化到Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１受体菌中,另以γ－＾３２Ｐ－ＡＴＰ标记ＢＶＤＶ ＲＮＡ制备探针,通过菌落原位杂交筛选重组子。酶切分配表明重组质粒插入     

牛病毒性腹泻病毒RNA的cDNA合成及其分子杂交的研究

BVDV(牛病毒性腹泻病毒)是一类有重要经济价值的病毒,其核酸为单链RNA。该病毒提纯以后.用苯酚-氯仿-异戊醇提取RNA.在提取的BVDy RNA中所含的DNA杂质用DNase I降解除去,然后进一步用oligo dT纤维素拄亲和层析,琼脂糖凝胶电泳等方法纯化。纯化的BVDV RNA在E.coli,poly A聚合酶的催化作用下,在3’羟基末端聚腺化。cDNA在逆向转录酶的作用下,用polyA接尾的BVDV RNA作模板,oligodT_12—18作引物合成。琼脂糖凝胶电泳结果说明它与BVDV RNA相似。该cDNA的探针用斑点杂交方法与BVDV RNA,HCV RNA和酵母tRNA杂交,BVDV RNA和HCVRNA显阳性反应,酵母tRNA显阴性反应,结果说明合成的cDNA为BVDV RNA的cDNA。BVDV和HCV同为披盖科疫病毒属成员,它们具有部分相同的抗原,因此编码病毒蛋白的RNA序列具有同源序列,本研究证实了这种假设。     

牛病毒性腹泻病毒结构蛋白功能研究进展

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)基因组为单股正链RNA,编码4种结构蛋白(C、E^rns、E1和E2)和8种非结构蛋白(N^pro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。牛感染BVDV后可出现腹泻、流产、繁殖障碍、持续感染等症状,该病死亡率较高,对我国乃至世界养牛业均造成了严重影响。因此,本文就BVDV已确定的4种结构蛋白的功能进行了概括性总结,以期为BVDV的深入研究提供理论依据和参考。     

牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒的制备及其对豚鼠的免疫原性分析

为了获得预防牛病毒性腹泻病毒1型(bovine viral diarrhea virus 1,BVDV-1)感染的病毒样颗粒,扩增C-Ems-E1-E2编码区段并克隆至pFastBacDaul载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞与Bacmid重组获得Bacmid-BVDV-1,转染至Sf9细胞,获得重组杆状病毒B...     

牛病毒性腹泻病毒RT-LAMP检测方法的建立

目的:建立牛病毒性腹泻病毒(BVDv)的环介导体外等温扩增(LAMP)快速检测方法。方法:根据BVDv的5'端非编码区序列,在保守区的8个位点设计LAMP特异性引物(2对特异性引物和1对环引物),对反应条件和试剂浓度进行优化,建立恒温(63.5℃)、快速(65min)的检测方法。结果:建立的方法特异性好,检测其他对照病毒均为阴性;灵敏度高,最低可检测到1个拷贝的阳性质粒,可通过观察浑浊度或加入染料后直接判定扩增结果。结论:建立了用于检测BVDv的LAMP方法,该方法简便、快速、特异性好、灵敏度高,适合基层和现场检测。     

囊泡相关膜蛋白A调控牛病毒性腹泻病毒复制

[背景]牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)是致犊牛腹泻的重要病原之一,而目前BVDV与宿主因子互作机理研究较少,成为限制BVDV防控的重要原因。[目的]探明囊泡相关膜蛋白A (vesicle-associated membrane protein A,VAPA)对BVDV复制的影响。[方法]根据GenBank中VAPA基因,使用Benchling和CHOPCHOP等平台设计靶向VAPA的向导RNA(small guide RNA,sgRNA),融合后克隆至慢病毒lentiCRISPR v2载体中,包装慢病毒后感染牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney,MDBK),使用嘌呤霉素连续筛选5代,使用Western Blot检测VAPA蛋白敲除(knockout,KO)情况;BVDV感染VAPA KO细胞不同时间后,收集细胞提取总RNA,并将等质量的RNA反转录成cDNA,使用实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和免疫荧光分析(immunofluorescence a...     

应用菜粉蝶颗粒体病毒单克隆抗体对不同株病毒进行抗原分析

应用杂交瘤技术,以大菜粉蝶颗粒体病毒(pbGV)、菜粉蝶颗粒体病毒北京分离株(prGV-801)、武汉分离株(prGVw1-78)和济南分离株(prGV-J)等4株病毒为抗原,获得9株杂交瘤细胞(Fr1～9)。ELISA测定细胞培养上清抗体效价最高达8000,腹水效价最高达450000。9株杂交瘤细胞所分泌的抗体,各呈现株或组特异性,其中pr1～4分别与4个毒株起反应,pr5～8可与2～3个毒株起反应,而Pr9则与所有4个毒株均起反应。据此,认为这4个毒株有抗原性差异。不同毒株间抗原性的差异不仅存在于病毒粒子上,而且也存在于颗粒体蛋白上。讨论了昆虫病毒单克隆抗体在鉴别病毒抗原性差异,生物防治和流行病学研究中的意义。     

马立克氏病毒单克隆抗体的研究

获得了4株分泌马立克氏病毒(MDV)特异性单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞:4BS10对MDV所有毒株呈阳性反应;4CN8 对MDV血清1,3型毒株发生反应;2BN90和4CN24只对MDV血清1型毒株有阳性反应。3个McAb属IgG1,1个为IgG2b,均不中和MDV,免疫扩散试验也无沉淀线。对禽白血病毒(ALV)无交叉反应。 以2BN90和辣根过氧化物酶、异硫氰酸荧光素的结合物进行直接酶联免疫吸附试验和直接荧光抗体试验,均获得成功。抗体滴度前者为1/51,200,后者为1/640。对ALV无交叉反应。     

长叶车前花叶病毒单克隆抗体的制备及在病毒分型中的应用

应用细胞杂交技术,将长叶车前花叶病毒杭州分离株(RMVha)、烟草花叶病毒普通株(TMVc)和北京番茄株(TMVbe-t)免疫的Balb/c小鼠脾细胞与Sp2/0-Ag14小鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选测定,成功地获得了5株稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中1株属于IgG_(2b),其余4株均属于IgG_(?),5株细胞株均制备了腹水抗体,ELISA效价最高达256000,琼脂双扩散效价达128,根据与15个不同RMV和TMV毒株的反应特性,可将5株单克隆抗体分为A、B、C三组,分别针对a、b、c三个不同的抗原决定簇。根据三组单克隆抗体反应性的差异,15个毒株可分为8个血清型,本文讨论了所获得的5株杂交瘤细胞在植物病毒的诊断、病毒病原的鉴定及病毒分型方面的应用价值。     

麻疹病毒单克隆抗体的研究

获得6株麻疹病毒的单克隆抗体.用HI、HLI、PHA及NT等方法证明,其中X、Y、Z3株均同时有高效价的HI、HLI活性和中和病毒的能力。另3株T、U、V仅能凝集麻疹病毒致敏的血球。用免疫沉淀法进一步证明、Z株与H蛋白结合。     

新城疫病毒单克隆抗体的特性及应用

建立了8个分泌抗新城疫病毒(NDV)特异性单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株,根据它们的免疫生物学特性可以分为三种类型:(1)具有FA和ELISA特性(FN1、FN4、FN29、FN30、FN35、FNl22);(2)具有FA、ELISA和HI特性(FN7);(3)具有ELISA、HI特性和中和能力(FN106),根据FN30和FN106的ELISA试验,可将11个NDV毒株分为二种不同的抗原群,应用FN4-FITC,FN7-FITC和FN29-HRP试剂,对人工感染NDV和野外送检病例检测结果表明,单抗试剂的DFA阳性率(92.3％)高于病毒分离阳性率(87.2％),两种方法的符合率89.7％,这些单抗试剂用于临床诊断敏感性和特异性高,且方法快速、简便。