胸腺素α1/干扰素α-2b融合基因表达载体的构建与表达

通过PCR人工合成模板的方法获得牛Tα1基因,与含IFNα-2b基因的pAG-IFN重组质粒,构建Tα1/IFNα-2b融合基因重组质粒pUC18-Tα1/IFN,经序列分析证实,融合基因Tα1和IFNα-2b与GenBank登录基因的序列一致性分别为100%和98.5%,仅IFNα-2b有两处碱基发生无义突变.再将融合基因亚克隆入pBV220,构建融合表达载体pBV220-Tα1/IFN,转化到E.coli M15经IPTG诱导,实现了Tα1-IFNα-2b融合蛋白的高表达,约占菌体总蛋白的24.5%,为包涵体形式.这为研制Tα1-IFNα-2b双重活性的融合蛋白奠定了基础.     

HIV-1gag/IFNα-2b的构建与表达鉴定

目的：构建艾滋病病毒核心蛋白(gag)与干扰素(IFNα-2b)融合基因表达质粒,观察其在痘苗病毒中共表达结果,研究其意义。方法：利用基因重组技术,将IFNα-2b基因片段插入到gag基因的nt531位点,经脂质体转染与血凝素阴性蚀斑筛选,挑出重组痘苗病毒。经免疫荧光、Western blot和Dot-ELISA鉴定表送产物。结果：间接免疫荧光实验结果显示,转染重组质粒的细胞表面有绿色荧光。免疫印迹实验与Dot-EILSA结果均显示重组质粒转染细胞的裂解物中存在表达的gag／IFNα-2b蛋白。结论：成功地构建了重组真核细胞表达质粒,表达的蛋白具有良好的免疫原性与免疫反应性。     

鼠疫耶尔森氏菌VcrV基因在大肠杆菌中的高效表达

将测序后的鼠疫耶尔森氏菌（Yersinia pestis)LcrV基因重组质粒pGEM－T／ypV酶切,克隆于原核表达载体pBV220,构建成pBV/ypV表达质粒,转化大肠杆菌DH5α,进行PCR及酶切鉴定,筛选阳性克隆,进行温控诱导表达,SDS－PAGE检测表达产物,在相对分子质量38000处有－表达条带,经薄层扫描分析目的蛋白带占全菌蛋白的38．4％以上,主要以可溶形式存在。     

一种人新型基因工程干扰素rh-IFNα-m的高效表达、纯化和活性检测

为实现干扰素 (IFNα m)的高表达与纯化 ,研究其抗病毒、抗增殖活性。应用PCR技术将已构建的IFNα m的高表达基因亚克隆到原核表达载体pBV2 2 0上 ,构建表达质粒 pBV2 2 0 /IFNα m ,转化大肠杆菌DH5α进行表达。表达产物经初步检定以包涵体形式存在 ,包涵体进行变性、复性 ,然后经CM Sepharose FF、DEAE Sepharose FF离子交换层析和Sephacryal HR10 0分子筛纯化 ,获得较纯的干扰素IFNα m。以IFNα 1b为对照 ,在VSV Wish系统上采用细胞病变抑制法 ,测定纯品IFNα m的抗病毒活性。在Hela细胞上用MTT法进行抗增殖实验。结果表明包涵体含量占菌体总蛋白 4 0 % ,纯化的目的蛋白IFNα m纯度在 95 % ,比活高达 1 2 6× 10 7IU/mg ,纯化收率34 4 % ,IFNα m抗病毒活性和IFNα 1b相当 (P >0 0 5 ) ,抗增殖活性高于IFNα 1b(P <0 0 1)。     

HIV-1Gag蛋白在大肠杆菌和重组杆状病毒系统中的高效表达及通用型温控原核表达载体的构建

将中国株HIV－1B亚型的gag全基因序列,克隆到杆状病毒表达载体pfastbacI中,构建了重组质粒pfastGag,利用细菌／杆状病毒表达系统筛选重组杆状病毒,在昆虫细胞中高效表达了HIV－1Gag蛋白。通过改造原核表达载体pBV220和pET28,构建了一种新的通用型温控原核表达载体质粒pVV5,该载体携带PrPl串联温控启功子及His—Tag纯化标签,利于目的蛋白表达与纯化。将HIV－1gag基因的1148一1857编码序列,分别插入到pVV5b、pET28b的相应位点,构建了重组表达质粒pEG1b、pEG7b,二者在不同受体菌中,表达重组蛋白的量分别占全菌体蛋白总量的42％和28％。利用IMAC金属螯合层析柱,对包涵体中的重组p24蛋白进行纯化,纯度超过80％;纯化后的重组蛋白可与HIV－1型标准阳性血清发生较强的免疫学反应。     

中国人肥胖基因克隆及其原核表达载体的构建

为了探讨人肥胖（obesity,OB）基因的生理和病理意义,利用逆转录-聚合酶链式．反应（RT-PCR）方法,从中国汉族成人腹膜后脂肪组织总RNA中扩增出肥胖基因编码区序列（cDNA）．定向亚克隆pUC19质粒,克隆的OBcDNA不含信号肽序列并加入了新的起始密码子ATG,序列分析表明,与日本报道的人OBcDNA相比,多出一个谷氨酸密码子CAG．将OBcDNA定向克隆至原核表达载体pBV220,构建了重组OB基因表达质粒pBV220-OB．SDS-PAGE证实pBV220-OB在大肠杆菌中可表达分子量为16.7KD的特异蛋白带．     

HPV 6b L1基因原核表达系统的构建及鉴定

克隆、构建人乳头瘤病毒6b型(HPV6b)L1基因重组质粒,并进行表达和鉴定。用PCR方法,从尖锐湿疣标本中扩增出HPV6b型L1基因,构建重组克隆质粒pblue-HPV6bL1,测序分析其基因变异。将本地株HPV6b型L1基因酶切后连接到原核表达质粒pBAD,构建原核表达系统pBAD-HPV6bL1/Top10,酶切鉴定证明重组质粒的正确性。经L-Arobinose诱导后表达HPV6b型L1蛋白,利用SDS-PAGE对表达产物进行鉴定。经酶切及序列分析鉴定,重组质粒pBAD-HPV6bL1构建成功,诱导后能够表达L1融合蛋白。HPV6bL1重组质粒构建成功,并获得HPV6bL1蛋白,为该蛋白的功能及HPV的基因工程疫苗研究提供了物质基础。     

大肠杆菌邻氨基苯甲酸合成酶编码基因trpED的克隆与表达

目的:通过基因重组的方法获得在体外具有邻氨基苯甲酸合成酶活性的基因trpED,为进一步解除反馈抑制的基因改造寻找靶标。方法:分别构建重组质粒pBV220-trpE和pBV220-trpD;由于trpE和trpD存在翻译偶联现象,将其自大肠杆菌基因组中经PCR扩增得到,构建新的表达质粒pBV220-trpED。结果:SDS-PAGE显示,包含质粒pBV220-trpED的重组菌在相对分子质量约53000(trpE基因表达)和56000(trpD基因表达)处的蛋白表达量明显增多,且邻氨基苯甲酸合成酶活性是对照的3倍。结论:翻译偶联的存在直接影响蛋白活性的发挥;重组质粒pBV220-trpED的获得为进一步的基因改造,以提高色氨酸产量奠定了研究基础。     

Epstein-Barr病毒胸苷激酶在大肠杆菌表达的研究

研究重组EB病毒胸苷激酶(thymidine kinase of Epstein-Barr virus,EBVTK)在大肠杆菌中的表达,将EB病毒的tk基因与原核表达载体pBV220进行重组,构成质粒pBV220/tk,并在大肠杆菌DH5α中获得表达;采用限制性内切酶分析进行重组质粒的鉴定,SDS-PAEG电泳和Western blot反应检测蛋白的表达。结果显示成功地构建了pBV220/tk质粒,并有重组蛋白的表达,该重组蛋白可与鼻咽癌病人血清发生特异性反应。结果表明该重组蛋白可作为抗原应用于鼻咽癌病人血清TKIgA抗体的检测,为重组TK的生产,临床应用提供了实验依据。     

抗克伦特罗单链抗体表达载体的构建与鉴定

为构建克伦特罗(Clenbuterol, CBL)单链抗体(scFv)表达载体, 实现其在大肠杆菌中的表达。以pCANTAB5E- CBL质粒为模板, 扩增CBL的scFv基因, 与pPICZaA载体重组, 然后以重组质粒pPICZaA-scFv为模板扩增scFv及其相连的6 个组氨酸(6×His)片段, 再与载体pBV220连接, 转化大肠杆菌DH5a, 阳性克隆质粒经酶切和PCR鉴定后进行目的片断的序列测定。重组菌经温度诱导表达重组单链抗体, 并通过SDS-PAGE和Western blotting对其鉴定。采用竞争ELISA检测重组单链抗体的抗原结合活性。结果表明重组质粒pBV220-scFv含有插入片段, 与原序列的同源性达99.8%。重组蛋白的分子量接近37 kD, 能够被抗His标签单克隆抗体特异性识别且可被游离的CBL竞争性抑制, IC50值为4.55 ng/mL。这说明我们成功构建了重组质粒pBV220-scFv并实现了其在大肠杆菌中的表达, 为进一步进行CBL免疫法快速检测奠定了一定的基础。     

人血清Q型对氧磷酶在大肠杆菌中的表达

目的:应用大肠杆菌原核表达系统高效表达人血清Q型对氧磷酶(PON1)。方法:从pBlueScript-PON1重组质粒中通过PCR扩增得到了人PON1基因,将其亚克隆至原核表达载体pBV220中,构建了重组表达质粒pBV220-PON1,转化大肠杆菌,获得表达菌株。结果:rhPON1重组蛋白以不溶形式存在于包涵体中。凝胶扫描分析表明,重组蛋白表达量约占菌体总蛋白的18%。包涵体经分离、变性、复性等步骤处理后,产物未显示酶活性。结论:原核表达的rhPON1以包涵体形式存在,实现了人PON1在大肠杆菌中的高效表达。     

肿瘤坏死因子相关凋亡受体(TRAIL)cDNA的克隆及高效表达

为了得到人TRAILcDNA并克隆到pGEM-Tvector。利用PCR技术获得目的基因片段 ,通过原核表载体pBV220构建人TRAIL表达质粒。将所得表达质粒转化宿主菌DH5α ,培养至OD60 0 值到达 0 6时 42℃诱导表达 ,并通过SDS PAGE分析表达结果。经凝胶薄层扫描 ,对pBV TRAILD DH5α工程菌热诱导 5h ,TRAIL衍生物蛋白的表达量最高约占菌体可溶性总蛋白的 31 %。人TRAIL基因 ,通过pBV2 2 0原核表达载体可在大肠杆菌中获得高效表达。     

HIV-1融合蛋白MA4-CA在大肠杆菌中的高效表达

将HIV-1MA4-CA融合基因克隆到高效表达载体pBV220中,将该重组表达载体转化大肠杆菌BL21,进行诱导表达。收集细菌,菌体裂解后进行SDS—PAGE检测。结果表明,成功地构建了含MA4-CA融合基因的表达载体pBV220-MA4-CA,该载体能在大肠杆菌中表达相对分子质量为16000并以包涵体形式存在的融合蛋白,此蛋白经洗涤后能够溶于8mol／L的尿素中。利用硫酸铵沉淀法进行初步纯化后即可得到纯度比较高的MA4-CA融合蛋白,为今后进一步的功能和应用研究打下了良好的基础。     

东亚三角涡虫RhoA基因的原核表达及组织定位

为了表达东亚三角涡虫RhoA蛋白,采用温控表达载体pBV220-IL1,构建了原核表达重组质粒pBV220-IL1-RhoA,转化到E.coli DH5α中,利用42℃热激诱导表达,并进行了分离纯化和Western杂交鉴定,利用荧光免疫组织化学技术检测了在涡虫体内的分布。SDS-PAGE电泳表明诱导表达的融合蛋白约为18 kDa,Western杂交结果显示是目的蛋白,荧光免疫组织化学结果表明RhoA蛋白在东亚三角涡虫神经系统处表达。     

大肠埃希菌trp operon的克隆与表达

色氨酸操纵子所表达酶的高效表达和酶活性的提高,从而构建高产色氨酸菌株.利用PCR的方法从大肠埃希菌基因组中直接克隆色氨酸操纵子,并将其连接到原核表达载体pBV220中,得到重组质粒pBV220-trp operon,转化大肠埃希菌DH5α,温度诱导重组蛋白表达,表达产物经SDS-PAGE分析并用比色法测定其活性.通过凝胶电泳观察PCR扩增产物大小约为7 kb.SDS-PAGE鉴定目的蛋白得到了高效表达,邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性分别比对照提高了3.4倍和2.5倍.成功构建了重组质粒pBV220-trp operon,邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的表达量和表达活性在大肠埃希菌中得到了提高,为高产色氨酸基因工程菌的构建奠定基础.     

C型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆与表达

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了1．2kb的α毒素基因,将纯化的PCR产物与载体pGEM-T连接,转化至受体菌JM109中,经NcoI／EcoRI和BamHI／EcoRI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,重组质粒pXCPAl中含有α毒素全基因。随后用NcoI／EcoRI酶切质粒pXCPAl,回收α毒素基因片段,插入到事先经同样酶切处理的载体pET-28c中相应酶切位点,构建了表达质粒pETXAl,经NcoI／EcoRI和BamHI／EcoRI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,表达质粒含有α毒素基因且基因序列和阅读框架正确。重组菌株BL21(DE3)(pETXAl)表达产物经ELISA检测和SDS-PAGE分析,重组菌株表达的α毒素蛋白能够被α毒素单抗识别,其表达量占菌体总蛋白相对含量的16．28％。     

蓝舌病病毒vp7基因的表达及其产物在c—ELISA中的应用

获得稳定、高效的具有良好抗原性的蓝舌病毒(Bluetongue virus,BTV)vp7基因重组抗原。将BTV编码群特异性抗原VP7的S7基因片段克隆至pMD18-T质粒载体中,构建S7克隆重组质粒,进行核苷酸序列分析。与已报道的多株BTV编码VP7的基因比较后发现,所测定毒株的核苷酸序列与BTV10型的S7基因同源性高达98．7％,推测的氨基酸同源性为99．3％,证实为BTV的S7基因。然后亚克隆插入pBAD/Thio TOPO表达载体,转化LGM194细胞,经抗性培养、PCR、限制性内切酶分析、测序鉴定,筛选获得BTV S7基因片段正向插入、有正确读码框的阳性克隆,成功构建了BTV群特异性抗原VP7的重组表达载体。经L-araboinose诱导表达,可稳定、高效地表达VP7蛋白抗原。SDS-PAGE、ELISA试验表明,表达蛋白为融合蛋白,具有反应原性,分子量约54．5kD,重组蛋白的获得率为1．52mg／g湿菌,其表达产量约占菌体总蛋白的12％左右,相当于93．5mg／L菌液。融合蛋白中含有BTV VP7特异性蛋白抗原,可作为c-ELISA包被抗原,为蓝舌病的免疫血清学诊断试剂的制备和分子生物学研究打下了坚实基础。     

贺氏福氏5型菌外膜蛋白ipa BC基因的高效表达及其免疫保护作用的研究

本文从一次克隆重组质粒pMG488中酶切回收了3．3kb的ipa Bc结构基因,将它在不同的位点插入带有PRPL启动子的载体pBV220中,构建了两种高表达重组质粒pMG501及pMG601。在大肠杆菌DH55a和无毒性福氏5M90TA菌中均获得了b、c多肽的高水平表达,初步的小鼠免疫攻毒试验显示b,c多肽可能有一定的免疫保护作用。     

C型产气荚膜梭菌β2毒素基因的克隆与表达

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了0．72kb的β2毒素基因,将纯化的PER产物与载体pGEM—T连接,转化至受体菌JM109中,经NcoI／Bam HI和Bam HI／Eco RI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,重组质粒pXCPB2中含有陡毒素基因。随后用Nco I／Bam HI酶切质粒pXCPB2,回收β2毒素基因片段,插入到事先经同样酶切处理的载体pET-28c中相应酶切位点,构建了表达质粒pETXB2,经Nco I／Bam HI和Nco I／Hind Ⅲ／Bam HI酶切鉴定及核苷酸序列测定证实,表达质粒含有陡毒素基因且基因序列和阅读框架正确。重组菌株BL21（DE3）（pETXB2）表达产物经ELISA检测和SDS—PAGE分析,重组菌株表达的β2毒素蛋白能够被如毒素抗体识别,其表达量占菌体总蛋白相对含量的13．26％。     

草鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ基因在大肠杆菌中的表达

 为构建草鱼 (Ctenopharyngodonidellus )胰岛素样生长因子 Ⅰ (IGF Ⅰ )大肠杆菌表达质粒 ,对已克隆到的草鱼IGF Ⅰ基因进行改造 .改造后的基因去除了原cDNA的信号肽和E区序列 ,并在基因的两端分别加入起始密码子和终止密码子 .将改造后的编码草鱼IGF Ⅰ成熟肽基因亚克隆到pBV 2 2 0中 ,构建成表达质粒pBVgIGF7.转化大肠杆菌 (Escherichiacoli)进行表达 .SDS PAGE显示 ,含重组表达质粒的菌株经热诱导后表达出一约 7 5kD的特异蛋白 .表达量占菌体总蛋白的2 0 0 3% ,表达产物主要以包涵体形式存在 .重组蛋白经纯化和复性后 ,采用MTT法测定其对草鱼吻端成纤维细胞PSF和草鱼卵巢细胞CO的促增殖作用 .结果表明 ,所获得的重组草鱼IGF Ⅰ具有生物活性