OsEBP-89启动子中应答茉莉素信号的必需DNA区域的分析

水稻OsEBP-89基因的表达受乙烯（ET）、脱落酸（ABA）、茉莉素等激素和干旱、低温等逆境胁迫处理的诱导．本研究中,克隆该基因启动子和预测应答胁迫与激素信号相关顺式作用元件的基础上,通过农杆菌注射法介导的瞬时表达证实了该启动子在烟草叶片中驱动GUS报告基因的表达受茉莉素的诱导．为了进-步确定该启动子中应答茉莉素信号的重要DNA区域,对该启动子进行了-系列的缺失突变,并将相关的缺失启动子片段与GUS报告基因融合．烟草叶片中GUS报告基因瞬时表达分析表明,该启动子中位于-1200bp和-800bp的碱基是该基因应答茉莉素信号的必需DNA区域,其中在-1127bp处有一个G—box元件;结合已有的研究结果,发现应答茉莉素信号的必需DNA区域不同于该基因应答ACC处理的必需DNA区域（在-562bp处存在一个ERE元件）．总之,本研究结果有助于探讨该基因应答不同胁迫信号表达的分子机制．     

水稻几丁质酶基因RCH8创伤诱导转录及启动子功能分析

高等植物几丁质酶基因受病害侵染、真菌激发子、乙烯、机械创伤等因素诱导转录。我们已经测定过水稻(Oryza sativa L.cv.IR 36)Ⅰ类几丁质酶基因RCH 8的DNA序列。为了研究水稻中与防卫反应有关的几丁质酶基因启动子的活性、功能和表达调控,我们以RCH 8几丁质酶基因保守的编码区序列为探针,分别在创伤处理2—24h后提取水稻(Oryza sativa L.cv.IR 36)叶片的总RNA作Northern杂交,发现创伤处理6h可以检测到几丁质酶基因的表达,12h表达水平最高。合成了一个与RCH8翻译起始密码附近反义链DNA序列互补的21-mer的寡核苷酸引物(5'-GCTCTCA-TGGTGGCAATGCAA-3')作引物延伸实验,表明RCH8基因的转录受创伤诱导,RCH8转录起始位点位于翻译起始位点上游第42碱基A。在pUC 19载体质粒中构建了一组5'端不同程度缺失的RCH8基因启动子与GUS报告基因翻译融合的重组质粒,用PEG法转入烟草原生质体中,通过测定GUS酶活性发现RCH8启动子-1016-676之间的DNA序列缺失后表达活力显著下降,缺失到-68碱基处的启动子仅有很低的活力。     

不同调控序列控制下的GUS基因在水稻和毛白杨愈伤组织中的瞬时表达

用CaMV35S启动子、玉米Ubil启动子、TMVΩ增强子(Ω序列)以及拟南芥18S rRNA基因同源序列构建的6种GUS基因表达载体分别转化水稻和毛白杨愈伤组织,研究不同调控序列对外源基因表达的调控作用.结果表明:(1)在水稻中,以独立Ubil启动子驱动下的GUS基因表达水平为最高,CaMV35S启动子附加18SrRNA基因同源序列调控下的GUS基因为最低.而在毛白杨中,则呈相反趋势;(2)在水稻中,CaMV35S-Ubil复合启动子的表达活性比独立CaMV35S启动子提高了近1.5倍.而在毛白杨中,前者比后者的低;(3)Ubil启动子附加Ω序列,使GUS基因在毛白杨中的表达水平提高一倍以上.但CaMV35S-Ubil复合启动子附加Ω序列,对GUS基因在毛白杨及水稻愈伤组织中的表达活性均没有明显的增强作用.     

水稻Xa21基因启动子序列分析及其在不同条件下的表达特征

以水稻品种‘日本晴’(Oryza sativa‘Nipponbare’)为实验材料,根据GenBank上公布的同品种水稻的基因组DNA序列设计1对引物,对水稻Xa21基因启动子进行克隆并测序,通过PCR扩增获得的Xa21基因启动子序列长1 982 bp,其中除包含启动子基本元件外,还包含一些与逆境信号相关的元件(GCC-box、A-box、TC-rich repeats、MBS、LTR和W-box等)。利用GUS组织化学染色和定量分析方法,研究了转基因水稻T1代株系不同器官和发育阶段Xa21基因启动子的表达特异性及其在不同逆境和激素处理条件下的表达特征,结果显示:在转基因水稻的叶、茎和根部均能检测到GUS活性,但根部GUS活性最高,特别是在根尖的中柱区活性最强;随苗龄增长(3叶期、5叶期和8至9叶期)叶片中GUS活性逐渐增加,8至9叶期GUS活性最高;机械损伤和100μmol.L-1茉莉酸甲酯(MeJA)处理可使叶片中GUS活性显著或极显著提高,而干旱、500μmol.L-1水杨酸(SA)和100μmol.L-1脱落酸(ABA)处理则对叶片中GUS活性无明显影响。研究结果表明:外界逆境胁迫对水稻Xa21基因启动子的表达有诱导作用;该启动子的表达受水稻发育阶段的调控并具有一定的器官组织特异性,在根中的表达量最高;其介导的抗病反应依赖于茉莉酸(JA)信号通路。     

桃PpMADS1基因启动子的克隆及功能分析

PpMADS1基因属于一类MADS box 基因,在植物的花发育调控中起着重要的作用。通过Genome Walking的方法从桃基因组中分离了长度为1 814bp的PpMADS1基因启动子片段,序列分析表明,在此启动子上不仅含有TATA box 和CAAT box基本元件,而且含有大量的与光调节有关的调控元件,如GT-1,Sp1和as-2-box,另外存在两个CArG-box元件、一个G-box元件和一个TGA-element,说明该启动子可能受光周期和激素的调控。将该启动子通过5′端缺失,分区段与GUS报告基因连接构建表达载体,并转化拟南芥。GUS组织化学染色分析结果表明,在-197到-454bp有促使GUS在花原基中表达的花原基特异性元件,在-454到-678bp之间存在促使GUS在萼片和花瓣表达的特异性元件,在-678到-978bp存在负调控作用元件,阻遏了GUS基因在花药中的表达。     

水稻OsGSTL1启动子的分离和表达分析

从水稻基因组文库中筛选得到一个水稻GST基因,命名为OsGSTL1.半定量RT-PCR分析表明OsGSTL1基因的表达不受绿磺隆、乙烯利、脱落酸、水杨酸和茉莉酸甲酯的诱导,因此该基因可能与植物抗逆性无关.为了研究OsGSTL1启动子在植物体内的表达特性,将OsGSTL1起始位点5＇端上游不同长度的调控序列与报告基因GUS融合,并在洋葱表皮瞬间表达和拟南芥中稳定表达.研究表明：在洋葱表皮细胞中,160bp及更长的上游调控序列均能启动GUS基因的表达;而在转基因拟南芥中,含有2155 bp的上游序列的PGZ2.1：：GUS具有时空表达的特性,在转基因的早期幼苗中GUS基因在子叶中特异性表达,但在根中没有表达;而在幼苗生长的后期,根、茎、叶中都有少量的表达.但包含1 224 bp的上游序列的PGZ1.2：：GUS却表现为组成型表达的特性.由此推测,OsGSTL1启动子启动的基因表达可能与幼苗的营养代谢相关;而OsGSTL1启动子的时空表达相关元件可能位于OsGSTL1翻译起始位点5＇端上游-2155 bp至-1224 bp范围内.     

棉纤维蔗糖合酶基因SS3上游调控序列的克隆及其表达分析

棉纤维蔗糖合酶基因SS3在棉纤维发育过程中起着重要作用.采用YADE技术克隆了该基因5′上游1717bp的调控区,该调控区含有典型的启动子核心元件TATA box ,以及TATC box、G box、GCN4 -motif、Prolamin box、Skn 1 likemotif、TCA element、HSE和O2 site等各种顺式调控元件和其他一些反应元件.将此序列和报告基因GUS融合在烟草、棉花中表达.组织化学分析结果显示棉花SuSyR序列启动GUS基因在烟草的子房、胎座、种子以及在棉花花蕾与棉铃中表达.在棉花花蕾蕾长为3mm、6mm、9mm和15mm花蕾中表达主要存在于雄蕊及雄蕊管、胎座等器官;在棉铃中,1DPA棉铃的花柱、花药、子房及胚珠中出现了蓝色,6DPA棉铃的子房及胚珠被染成蓝色,在2 0DPA的棉铃中蓝色只出现在胚珠及其纤维中、在胚珠中只有珠心被染成蓝色,在4 0DPA胚珠中只有纤维呈蓝色.研究结果揭示,棉花的SuSyR调控序列启动GUS基因主要在子房、胚珠和纤维等器官和主叶脉、茎微管束等输导组织中表达,在棉花中尤为明显,表明棉纤维蔗糖合酶基因SS3除参与棉花蕾铃发育、纤维素的合成外,还参与了光合产物的运输与分配过程.     

OsBP-5与OsEBP-89两蛋白之间相互作用区域的确定

OsBP-5(MYC类转录因子)与OsEBP-89(AP2/EREBP类转录因子)两个蛋白之间可以相互作用,并能协同调控水稻waxy基因的表达.将OsBP-5与OsEBP-89 cDNA的不同限制性片段分别克隆到酵母双杂交系统的载体上,利用酵母双杂交的方法确定了OsEBP-89中与OsBP-5相互作用的区域位于AP2/EREBP保守域的RAYD元件内;OsBP-5中与OsEBP-89相互作用的区域则有两个区段,它们分别位于Pro68与Val171之间和Leu284与Gly335之间,而不是位于HLH保守域内.酵母系统中的实验还表明,OsEBP-89的3′端部分氨基酸在一定程度上防碍了它与OsBP-5蛋白的相互作用.     

十字花科黑腐病菌Ⅲ型效应物基因avrAC_(Xcc8004)推测的启动子区

【目的】十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc),能侵染所有十字花科植物,引起黑腐病。Xcc通过III型分泌系统(Type III Secretion System,T3SS)将III型效应物(T3SS effector,T3SE)蛋白直接转运到植物细胞内,T3SEs对于病原菌致病性至关重要。许多已鉴定的T3SEs基因的启动子区都存在植物诱导启动子盒(Plant-inducible promoter,PIP-box)和-10 box,但PIP-box及-10 box与经典的启动子-10区及-35区之间的关系如何未见报道,-10 box的序列保守性如何也未见报道。本研究旨在对T3SE基因avrAC Xcc8004推测的启动子区进行研究。【方法】首先,通过5'RACE确定其转录起始位点,接着用Fusion PCR对-10 box TACGTT序列中倒数第二个碱基T进行点突变为A/C/G,即:TACGAT、TACGCT和TACGGT,构建GUS融合报告菌株,定量测定GUS酶活。【结果】5'RACE结果显示avrAC Xcc8004的转录起始位点为A,对比分析得到启动子的-35区位于PIP-box之后8 bp处,而-10区与-10 box重叠;avrAC Xcc8004启动子区的PIP-box和-35区、-10 box的整个模体为:TTCAC-N15-TTCGC-N8-TTGATG-N18-TACGTT。最后,GUS定量测定结果表明,突变为C时(TACGCT)的菌株的GUS酶活最高,突变为G时(TACGGT)的酶活增高最少。在ΔhrpX和ΔhrpG中的GUS酶活均比在Xcc 8004中有显著的降低。【结论】Xcc的T3SE基因PIP-box与-35区前后相衔,-10 box即-10区,-10 box对于avrAC Xcc8004的转录活性有较大的影响,-10 box突变前后avrAC Xcc8004均受HrpG和HrpX正向调控。     

荔枝LcVSP1基因5′调控序列的克隆及功能初步鉴定

利用Genome Walker法获得了荔枝营养贮藏蛋白质Lc VSP1基因的5′调控序列,构建了含有该序列的植物表达载体并转化烟草,通过PCR和GUS染色对转化植株进行了鉴定.序列分析表明,Lc VSP1基因的5′调控序列中除含有真核生物典型的核心启动子区域和保守的TATA box序列外,还发现了一些与真核生物启动子中相似的顺式调控元件.对获得的转基因植株的GUS染色发现,在转基因植株的茎、叶柄和主叶脉呈现蓝色,表明Lc VSP1的5′调控序列可以启动GUS基因的表达,具有启动子的活性,并具有组织特异性.     

Analysis of the essential DNA region for OsEBP-89 promoter in response to methyl jasmonic acid

In rice, the characterization of OsEBP-89 is inducible by various stress- or hormone-stimuli, including ethylene, abscisic acid (ABA), jasmonate acid (JA), drought and cold. Here, we report the investigation of essential DNA region within OsEBP-89 promoter for methyl jasmonic acid (MeJA) induction. PLACE analysis indicates that this promoter sequence contains multiple potential elements in response to various stimuli. First, we fused this promoter with GUS gene and analyzed its expression under MeJA treatment through Agrobacterium infiltration mediating transient expression in tobacco leaves. Our results revealed that this chimeric gene could be inducible by MeJA in tobacco leaves. To further de- termine the crucial sequences responsible for MeJA induction, we generated a series of deletion pro- moters which were fused with GUS reporter gene respectively. The results of transient expression of GUS gene driven by these mutant promoters show that the essential region for MeJA induction is po- sitioned in the region between -1200 and -800 in OsEBP-89 promoter containing a G-box (?1127), which is distinct from the essential region containing ERE (?562) for ACC induction. In all, our finding is helpful in understanding the molecular mechanism of OsEBP-89 expression under different stimuli.     

Analysis of the essential DNA region for OsEBP-89 promoter in response to methyl jasmonic acid

In rice, the characterization of OsEBP-89 is inducible by various stress-or hormone-stimuli, including ethylene, abscisic acid (ABA), jasmonate acid (JA), drought and cold. Here, we report the investigation of essential DNA region within OsEBP-89 promoter for methyl jasmonic acid (MeJA) induction. PLACE analysis indicates that this promoter sequence contains multiple potential elements in response to various stimuli. First, we fused this promoter with GUS gene and analyzed its expression under MeJA treatment through Agrobacterium infiltration mediating transient expression in tobacco leaves. Our results revealed that this chimeric gene could be inducible by MeJA in tobacco leaves. To further determine the crucial sequences responsible for MeJA induction, we generated a series of deletion promoters which were fused with GUS reporter gene respectively. The results of transient expression of GUS gene driven by these mutant promoters show that the essential region for MeJA induction is positioned in the region between −1200 and −800 in OsEBP-89 promoter containing a G-box (−1127), which is distinct from the essential region containing ERE (−562) for ACC induction. In all, our finding is helpful in understanding the molecular mechanism of OsEBP-89 expression under different stimuli. OsEBP-89, essential DNA region, methyl jasmonic acid, transient assay, promoter, tobacco leaves Contributed equally to this work Supported by the National Basic Research Program of China (Grant No. 2006CB101700) and the National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 30671135, 30525034 and 30730060)     

水稻OsBP-73基因表达需要其内含子参与

该实验室以前的研究表明,水稻OsBP-73基因含有2个外显子和1个长度为2 471 bp的内含子.该文报告用OsBP-73基因ATG翻译起始密码子(在第1外显子中)上游序列(1- 818～ 215)与GUS基因构成嵌合质粒pRSSl,将该质粒转化水稻后,在抗性愈伤组织和转基因植株中未能检测到GUS基因的表达.只有用含有完整的内含子及其上游序列(1 818～ 2 844)与GUS基因构成嵌合质粒(p13GNF)时,才能在p13GNF的转基因抗性愈伤组织和植株中检测到GUS基因的表达.实验还证明,单是内含子序列并不能驱动GUS基因在转基因水稻中表达.由此推测:OsBP-73基因的启动子序列驱动基因表达时,需要基因内含子的参与.     

水稻sbe1启动子驱动的反义sbe-GUS融合基因在转基因水稻中的表达

为研究水稻基因启动子对外源基因在转基因水稻中表达的影响,构建了由sbe1启动子引导的反义sbe-GUS融合基因。经农杆菌介导,将不同的融合基因导入水稻中,定量测定转基因水稻植株不同组织中的GUS酶活力。结果表明,sbe1启动子可驱动反义sbe-GUS融合基因在转基因水稻植株的胚乳中高效表达,而在颖壳、胚和茎叶等组织中的表达活性较弱。证实sbe1启动子在驱动外源基因的表达上表现有明显的组织特异性。     

Ac/Ds(GUS)结构介导的水稻启动子捕获系统的建立

构建了基于Activator/Dissociation(β-glucuronidase)[简称Ac/Ds(GUS)]结构的捕获质粒p13B,用于分离水稻基因启动子.以此质粒用衣杆菌介导的方法转化粳稻品种中花11的胚性愈伤组织,对获得的18个独立转化株的T2代植株进行了抗除草剂筛选,从141个抗除草剂转基因植株中用PCR方法检测到其中37株是Ds因子发生了转座的植株,而且这种转座到新位置上的Ds因子是遗传的.初步观察到其中5株的GUS染色呈阳性.     

Developmental regulation of peach ACC oxidase promoter--GUS fusions in transgenic tomato fruits

A genomic DNA sequence (PpACO1) encoding 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase (ACO) from peach (Prunus persica L. Batsch cv. Loring) was isolated. It has four exons interrupted by three introns and 2.9 kb of flanking region 5' of the translational start codon. Previous work with the cDNA demonstrated that accumulation of the peach ACO message correlated with increasing amounts of ethylene synthesized by the fruit as they ripened. To identify regulatory elements in the peach ACC oxidase gene, chimeric fusions between 403, 610, 901, 1319, 2141, and 2919 bp of the 5' flanking region of the PpACO1 sequence and the beta-glucuronidase (GUS) coding sequence were constructed and used to transform tomato (Lycopersicon esculentum [Mill] cv. Pixie). Fruits from the various promoter lines were analysed for GUS expression by histochemical GUS staining, GUS quantitative enzyme activity determination, and measuring the relative amounts of GUS mRNA. Constructs with the smallest promoter of 403 bp had significant GUS expression in fruit, but not in other tissues, indicating the presence of a region that affects tissue-specific expression. An increase in GUS expression was observed with promoters longer than 901 bp, indicating an enhancer region between -1319 and -901. The full-length promoter of 2919 bp directed GUS expression in the green stage of fruit development, and increased GUS expression as fruit matured, indicating a regulatory region between -2919 and -2141 that controls the temporal expression of the gene in fruit. Only the full-length promoter sequence demonstrated responsiveness to ethylene.