超滤过结合密度梯度离心纯化鲍曼不动杆菌噬菌体方法的建立

目的 探讨获得低浓度内毒素和高滴度鲍曼不动杆菌噬菌体的方法,为制备安全的噬菌体生物制剂提供参考.方法 用可截留100 kD以上分子量的超滤离心管浓缩噬菌体裂解液并滤出分子量约为10 kD的内毒素,然后用蔗糖密度梯度离心纯化噬菌体浓缩液;分别测定超滤前、超滤后和纯化后的噬菌体滴度,采用鲎试验测定超滤前后内毒素的浓度,通过SDS-PAGE分析超滤前后和纯化后噬菌体蛋白的纯度.结果 经超滤离心法噬菌体滴度从3.9×1010 PFU/mL提高至1.68×1012PFU/mL,并可去除99.2％的内毒素;超滤过结合密度梯度离心后的SDS-PAGE可清晰呈现7种蛋白,分子量为29～100 kD.结论 超滤过结合密度梯度离心是一种简便、快速浓缩和纯化噬菌体的方法,并可有效地去除裂解液中的内毒素.     

狂犬病疫苗蔗糖密度梯度离心纯化工艺开发

目的:开发冻干人用狂犬病疫苗(鸡胚成纤维细胞)的连续流蔗糖密度梯度离心纯化工艺。方法:分别比较两种不同初始蔗糖浓度和不同上样速度对纯化效果的影响,初步确定纯化工艺;通过多批次实验确定样品收集范围;比较不同浓缩倍数条件下杂质去除和抗原回收情况,确定合适的收获液浓缩比例;比较不同批次样品纯化后的杂质去除率和重复性,判定本纯化工艺的稳定性。结果:选取60%作为初始蔗糖浓度,在上样速度为150～200ml/min时,可以有效地对10倍浓缩的病毒收获液进行纯化;卵清蛋白、牛血清白蛋白和庆大霉素去除率分别达到99%,95%和95%,且工艺具有极好的稳定性。结论:开发的连续流蔗糖密度梯度离心技术可以作为冻干人用狂犬病疫苗(鸡胚成纤维细胞)的产业化纯化工艺。     

菜白蝶的一种新病毒II．病毒的生物物理、血清学性质

用氯仿-丁醇处理和差速超速离心,再经两次蔗糖密度梯度离心,纯化了这株菜白蝶病毒。病毒沉降系数约132S。在氯化铯中的浮力密度为1．39g／cm3。在相同条件下测定,健康菜白蝶幼虫蛋白沉降系数分别为16S、38S、76S,而被病毒感染的死幼虫则为17S、62S、127S。     

柑桔衰退病毒的提纯

从甜橙病株的嫩梢皮组织提纯柑桔衰退病毒(Citrus Tristeza Virus,CTV),冰冻组织按每克鲜组织加入5ml0.1mol/L Tris缓冲液pH8.4(内含0.15％Triton x—100)进行匀浆。经几次差速离心和两次PEG(分子量6,000)沉淀后,将获得的病毒粗提液铺在不连续蔗糖密度梯度液上,HITACHI RPS_(40)T转头30,000r/m离心3小时,收集位于300mg/ml和400mg/ml梯度层之间的分离带,洗脱、浓缩后获得CTV提纯物。提纯的CTV粒子大小为1.000—1,500x12urn,与美国的CTV抗血清起阳性反应。     

小鼠腹水瘤病毒(SRSV)及其核糖核酸的纯化和某些性质的研究

从感染NIH3T3小鼠成纤维细胞上清液中分离小鼠腹水瘤病毒,用蔗糖密度梯度离心法纯化。从新鲜病毒中取小鼠腹水瘤病毒RNA,并用酚-氯仿抽提和蔗糖梯度分离。各组分的沉降系数(S)和分子量通过超速离心凝胶电泳分析测定。SRSV RNA主要由两组分组成,一是沉降系数约60～70S(热处理后约35S),还有少量18S和28S,另一是4～5S。35S组分在体外能指导无细胞蛋白的合成。     

肺炎克雷伯菌Ⅲ型菌毛的提取与鉴定

将表达Ⅲ型菌毛的肺炎克雷伯菌临床分离株Kp7在改良Minka液体培养基上传代培养,使之充分菌毛化,大量收集菌毛生长良好的细菌,利用热洗脱法分离提取菌毛,经硫酸铵沉淀、透析后进行蔗糖密度梯度离心,收集20%~30%梯度中的蛋白带,经SDS-PAGE电泳可见1条大小在20.5 ku的蛋白条带。提纯菌毛保留了甘露糖抵抗血凝特性,并与用Kp7全菌免疫家兔制备的高免血清在Western blot中反应呈阳性,证实其条带为Ⅲ型菌毛主要结构蛋白。     

陕西七纺器蛛和拉土蛛不同组织酯酶同工酶的比较研究

陕西七纺器蛛(Heptathela shaanxiensis),拉土蛛(Latouchia sp.)均于1987年10月采自陕西泾阳。在同条件下采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行了不同组织的酯酶同工酶比较。实验方法酶液的制备:将饥饿10天的两种蜘蛛按常规解剖,分别取各组织置于研钵内,根据样品重量之差异,分别加入40%蔗糖溶液1—3ml,匀浆过滤,离心(3500rpm×15′)。取上清液作酶源,贮存于4℃冰箱备用,点样时加入适量0.1%澳酚蓝作电泳的指示染料。酯酶同工酶的聚丙烯酰胺疑胶电泳分离和染色、脱色:基本参照邱琼华等(1987)的方法。用日本20M光密度计(波长570nm,狭缝0.4cm)扫描…     

用两相法纯化玉米精细胞质膜

纯系玉米(Zea mays L.)708的新鲜花粉经蔗糖溶液等渗温育、低渗胀破,用30％Percoll不连续密度梯度离心,制备大量的生活精细胞。精细胞用French压力室破碎后离心(90000×g,4℃),获得微粒体。随后,用16g的(6.2％Dextran T500/6.2％PEG3350)两相系统加以纯化。一级分离后,上相液(U_1)的K~ 刺激的Mg~(2 )-ATP酶活性稍低于下相液(L_1);对U_1进行二级分离后,U_2的K~ 刺激的Mg~(2 )-ATP酶活性远远高于下相液(U_2L),分离率达到61.1％。膜蛋白质的分离趋势与K~ 刺激的Mg~(2 )-ATP酶相似。选用细胞色素C氧化酶作为线粒体的标志酶,虽只经一级分离,但在U_1中已检测不到该酶活性。精细胞质膜的磷钨酸特异染色电镜观察结果显示,由二级分离所得质膜的纯度达到90％以上。     

慢性蜜蜂麻痹病病毒核酸与蛋白质组分的研究

从自然感染的意大利麻痹病蜂(APis mellifera)头部,经二次差速离心与蔗糖梯度离心获得纯化的慢性蜜蜂麻痹病病毒(CBPV)。纯化的CBPV制备物感染正常蜜蜂,4天后出现典型的麻痹症状,接着死亡,平均死亡率分别为95％与100％。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,二次差速离心初步纯化的病毒制备物含有多条蛋白带,而蔗糖密度梯度纯化的病毒制备物仅含有单一的多肽带。5％、7.5％与10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,均检测出一种病毒蛋白质,分子量大约为24,200道尔顿,而且不同凝胶浓度检测的蛋白质分子量相近。慢性蜜蜂麻痹病病毒核酸也用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,结果表明,凝胶中有5条带,对核酸酶敏感,证明该病毒含有5个单股RNA组分。对慢性蜜蜂麻痹病病毒的基因组结构进行了讨论。     

PEG诱导人类细胞和元麦原生质体融合初步尝试

本实验尝试以PEG诱导Hela细胞与元麦原生质体融合进行了初步观察。 实验方法是将Hela细胞悬液250万/0.25 ml和元麦原生质体悬浮液500万/0.25 ml混合,然后加入0.125 ml PEG溶液(PEG 6,000分子量0.09M,CaCl_2·2 H_2O 10.5 mM,葡萄糖0.25 M,KH_2PO_4·7H_2O 0.7mM,pH 5.5)于37℃孵育30分钟,接着以RPMI-1640培养液洗掉PEG,离心收集细胞培养于小玻瓶中。实验分两组:一组细胞培养在Nagata培养液中,另一组培养在RPMI-1640培养液中。初步观察结果如下:     

CaCl2对小麦叶片中超氧物歧化酶活性的影响

小麦（Triticumaestivum）“沈农78”种子经0.1％HgCl2溶液浸泡8min,蒸馏水冲洗,浸种后放在6层纱布上,于25℃恒温箱中发芽。幼苗长至2cm后,转放在自然光下生长。每日浇蒸馏水,麦苗长出3片叶后（苗高约10cm）以不同浓度（见表1）Cal2溶液进行处理：上午8时用喉头喷雾器喷洒至叶面布满露珠为止。80株麦苗喷用溶液量约2ml。另以等量溶液浇根。两者均以同量的蒸馏水处理为对照。处理1d或连续处理3d、5d。每天晚上8时浇5ml蒸馏水,以保持正常的水分供应。CaCl2处理24h后取材测定。每个处理设3次重复。称取小麦叶片1g,加入预冷的0．05mol…     

一种用于染色体观察的改良绒毛细胞直接制备法

为弥补羊水检查时间过晚之不足,1984年 Simoni利用绒毛标本直接制备法观察染色体获 得成功,此后,即日益为人们所注目。我们改良 了绒毛细胞直接制备方法,以胶原酶代替乙酸 处理,对绒毛细胞直接制备法（简称乙酸法）和 改良法（简称胶原酶法）进行了比较。大致过程 如下： 取妊娠6-7周人流绒毛组织50mg左 右,严格挑选后,生理盐水洗净,移人含最终浓 度0.5,ug/ ml秋水仙素的RPMI 1640培养液中 孵育1小时（pH7.2, 370C),然后分成两份。一 份按乙酸处理法进行制片：(1)去除培养液,加 3m11.5外拘椽酸钠溶液低渗15分钟;(2）加人 数滴3:1的甲醇：冰乙酸预固定10分钟;(3）吸 弃固定液,重复固定巧分钟;(4)吸弃固定液, 加入1m160并乙酸水溶液,处理2分钟,即追加 纯甲醇2ml; (5)吸取细胞悬液于离心管内离心 (1500-1800rpm); (6）冰水滴片,风干,Giemsa 染色。另一份按改良的胶原酶法制备染色体,大 致如下：(1)弃培养液加人15ng/ml胶原酶4ml, 孵育15-20分钟（370C); (2）加人4m1生理盐 水,离心（1000rpm),分钟,弃上清液,经0.75% 氯化钾4 ml低渗20分钟（370C),用甲醇冰醋 酸固定液lml预固定后,依上法离心,弃上清 液;(3）甲醇冰醋酸（3:1)重复固定15分钟,混 匀后自然沉降,吸上层细胞悬液离心,如此重复 二次后,再固定15分钟,气干法制片。28例实 验结果见表1,无论是可数分裂相,还是完整分 裂相出现率,胶原酶法均比乙酸法为高,二者间 有显著差异。     

甘蓝型油菜胞质体大量制备技术的研究

用Ｐｅｒｃｏｌｌ密度梯度离心法和吖啶橙（ＡＯ）结合光照处理两种方法,均从甘蓝型油菜下胚轴原生质体制备到胞质体。在２个Ｐｅｒｃｏｌｌ梯度、３００００ｇ（１８０００ｒ／ｍｉｎ）与１２℃离心６０ｍｉｎ的条件下,获得了含胞质体８０％以上的群体;以含８０、１００、１２０ｍｇ／Ｌ ＡＯ的酶液酶解下胚轴原生质体,纯化后分别给以３ｈ、２ｈ、１ｈ光照（光强度：４０００ｌｘ）可使原生质体几乎不能分裂,但保持５ｄ以上的     

从琼脂糖凝胶中高效回收DNA技术的探讨

用两只离心管制成的凝胶过滤装置,从电泳后的琼脂糖凝胶中回收DNA片段的简易方法。它依次包括以下步骤：凝胶过滤装置的制作、凝胶切割、凝胶低温冷冻、低温高速离心、ddH20洗胶、DNA纯化和回收效果检测等。用此方法回收的DNA片段产率高、质量纯,可直接用于分子生物学实验的后续操作,如载体连接、PCR模板获得、DNA探针制备、基因测序等。其优点是：DNA片段的回收率高（90％以上）,质量好;操作简便,耗时短;回收装置简单,成本低廉,可进行商品化开发。     

家蚕核型多角体病毒及核衣壳的纯化和其结构蛋白的凝胶电泳分析

 用差速离心和蔗糖密度梯度离心提纯了家蚕核型多角体病毒及其核衣壳,并用SDS聚丙烯酰胺凝胶(均一胶和梯度胶)电泳分析了它们的结构蛋白。测量使用游标卡尺,计算使用微型计算机。凝胶用很染色方法染色。 结果表明,家蚕核型多角体病毒长381.2±17.81纳米,直径88.86±9.605纳米;核衣壳长328.9±5.917纳米,直径41.36±1.167纳米。两种凝胶电泳所得数据显示病毒粒子至少含有20组分子量不同的结构多肽,含量较多的是P31、P40、P28和P20。P45和一些小分子多肽看来主要存于囊膜上。P31的分子量与多角体蛋白相同,我们的实验表明它可能是病毒粒子和核衣壳的结构组分。     

新生、成年和老年小鼠大脑皮层突触小体神经递质氨基酸含量的比较研究

用DANS反应-薄膜层析-萤光方法测定了蔗糖密度梯度超离心制备的不同年龄小鼠大脑皮层突触小体中递质氨基酸的含量。实验结果表明:(1)不同年龄小鼠每克皮层组织中突触小体蛋白质含量不同。新生——5.68、成年——21.37、老年——19.14毫克/克脑组织湿重。(2)递质氨基酸含量以毫微克分子/克脑组织湿重表示时,GABA含量在发育期升高,到老年期又降低;牛磺酸含量由新生到老年期持续下降;谷氨酸、天冬氨酸含量在发育期升高,到老年期无明显变化。(3)突触小体中“抑制性”递质氨基酸总量与“兴奋性”递质氨基酸总量的比值(GABA Tau Gly/Glu Asp)随年龄增长而明显降低,成年的比值趋近于1。新——3.39、成年——1.06、老年——0.79。(4)老年小鼠皮层突触小体的蔗糖梯度区带明显分成两层。即除P_2B层外,出现明显的P_2B′层,其GABA、谷氨酸、天冬氨酸含量与P_2B层相比,分别降低24.2%(P<0.05)、50.4%(P<0.001)和44%(P<0.001)。     

新生、成年和老年小鼠大脑皮层突触小体神经递质氨基酸含量的比较研究

用DANS反应-薄膜层析-萤光方法测定了蔗糖密度梯度超离心制备的不同年龄小鼠大脑皮层突触小体中递质氨基酸的含量。实验结果表明:(1)不同年龄小鼠每克皮层组织中突触小体蛋白质含量不同。新生——5.68、成年——21.37、老年——19.14毫克/克脑组织湿重。(2)递质氨基酸含量以毫微克分子/克脑组织湿重表示时,GABA 含量在发育期升高,到老年期又降低;牛磺酸含量由新生到老年期持续下降;谷氨酸、天冬氨酸含量在发育期升高,到老年期无明显变化。(3)突触小体中“抑制性”递质氨基酸总量与“兴奋性”递质氨基酸总量的比值(GABA Tau Gly/Glu Asp)随年龄增长而明显降低,成年的比值趋近于1。新生——3.39、成年——1.06、老年——0.79。(4)老年小鼠皮层突触小体的蔗糖梯度区带明显分成两层。即除P_2B 层外,出现明显的P_2B' 层,其GABA、谷氨酸、天冬氨酸含量与P_B 层相比,分别降低24.2%(P<0.05)、50.4%(P<0.001)和44%(P<0.001)。     

棉铃虫幼虫中肠细胞脂筏的制备及鉴定

脂筏是细胞膜上富含胆固醇、鞘脂类和糖基磷脂酰肌醇锚着蛋白的去垢剂不溶性微结构域,被认为是多种细胞膜孔毒素在细胞表面形成寡聚体的平台。为研究脂筏与Bt毒素在细胞膜上形成寡聚体膜孔的关系,本文对棉铃虫Helicoverpa armigera幼虫中肠脂筏的制备与鉴定方法进行了研究。根据脂筏在低温（4℃）下不溶于去垢剂的特性,采用Triton X-100处理棉铃虫幼虫中肠刷状缘膜囊泡,溶解非脂质筏成分,以OptiPrep为介质进行密度梯度离心,分离去垢剂不溶组分,成功地得到了棉铃虫幼虫中肠上皮细胞的脂筏。再以脂筏的特有化学成分神经节苷脂GM1作为脂筏的标志分子,利用霍乱毒素β亚基能与GM1特异性结合的特性,以辣根过氧化物酶标记的霍乱毒素β亚基用点印迹法化学发光检测神经节苷脂的分布,从而对脂筏进行定性鉴定。结果表明我们建立的脂筏制备方法简便、易行,比传统的蔗糖梯度离心法大大缩短了制备所需时间。     

质粒DNA的人工氯化艳线性梯度分离法

在遗传工程技术中,质粒被广泛用作重组 DNA的载体,有些肠道菌的致病基因位于大质 粒上。要克隆这些基因,先要纯化质粒,迄今 为止,已经有不少精制质粒的方法^[57]。经典的均 一CsCI-EB密度离心法,需长时间的离心,使其 形成Cscl梯度,约40-60小时方能达到纯化 的目的。本法做了一些改进,采用0.6M和6M 两种不同的Cscl溶液,用日立DGF-U梯度 仪配成线性梯度,然后加粗提的质粒DNA和 EB的混合液,以日立RPS-65T水平转头,200C, 48,000rpm（约为160,000g）离心,小时,就能 把粗制pBR322样品中的染色体、开环（oc）和 共价闭合环状（ccc)质粒DNA分开。从而获 得纯的cc。质粒。带定居因子K88ac抗原的毒素 源性大肠杆菌野生型菌株,含有50 Md的大质 粒和一个小质粒,用酸酚法^[7]、两相法^[3]、蔗糖梯 度离心法、均一氯化艳-EB离心法、不连续（或 阶梯梯度）梯度Cscl离心法^[2]琼脂糖凝胶电 泳法^[6]等都难以获得纯的大质粒,用本文的方 法得到较好的效果,这不仅大大缩短了超速离 6时间,节省了氯化艳用量,同时对大小质粒 DNA的纯化均可适用。     

兔的一种新病毒 IlI.兔出血症病毒形态的超微结构和抗原性的研究

1986年春,武汉市第二制药厂(WSPMM)试验用家兔突然口鼻渗出鲜血,几乎全部猝死。作者观察了罹病死亡的症状,认为此病例与黄印尧等所报道的相同。湖北省中医药研究院(HTCMI)也发生此病的流行。作者对这两种不同来源的病料,进行相同的处理,提取病毒粗纯物,回接同种动物,可引起同样典型的发病症状。进一步将死亡兔的肝、睥等脏器组织匀浆。经低速、高速、超速和蔗糖密度梯度离心后制样,电镜观察可见典型的病毒柱子。以上两种病毒粒子制备的抗血清和南京农业大学的兔出血症病毒抗原在双扩散沉淀中,产生典型的沉淀反应,说明三种病毒抗原的一致性。但是湖北株、南京农业大学病毒株抗原和日本细小病毒的抗血清,在双扩散反应时均无沉淀反应。湖北株病毒的形态大小、超微结构、外壳蛋白的 多肽和血清学特性,均不同于标准兔细小病毒,可能是一新的病毒。