重组质粒转染蟑螂对黑胸大蠊浓核病毒的拯救

用Glassmilk法纯化PfDNV dsDNA,在其3′端和PstⅠ切开的pUC119质粒的3′端分别加dG和dC尾,连接、转化、筛选得到分子量为8.7kb的重组质粒.通过酶切证明插入DNA为PfDNV全基因组DNA.利用DEAE-dextran转染技术,将此重组质粒导入黑胸大蠊幼虫体内,此重组质粒能使虫体发病死亡.电镜超薄切片观察发现虫体细胞内存在大量的病毒粒子.同样,在免疫扩散实验中虫体PBS浸出液能与抗PfDNV的抗体产生沉淀线.用重组质粒感染致死的虫体喂食健康黑胸大蠊,也能使其发病死亡,通过电镜可以观察到在细胞内增殖的病毒粒子.     

含荧光素酶基因的黑胸大蠊浓核病毒重组质粒的构建与表达

黑胸大蠊(Periplaneta fuliginosa)是我国分布最广的蟑螂种类.黑胸大蠊浓核病毒(Periplaneta fuliginosa densovirus, PfDNV)是我室1991年在国内首次报道并在国内外第一个分类鉴定的蟑螂细小病毒[1].我们构建了PfDNV全基因组克隆和酶切亚克隆重组质粒,测定并分析了病毒基因组全序列与结构.序列分析表明该病毒基因组具有细小病毒基因组的结构特征,其末端具有反转重复序列(Invert Terminal Repeatant, ITR)和回文结构,这类病毒基因组两端的特殊结构可能是与病毒复制,整合,拯救,包装有关的必需顺式元件[2～5].为了进一步研究黑胸大蠊浓核病毒基因复制及表达机理,尤其是其末端结构在病毒基因复制中的作用,我们将荧光素酶基因插入了PfDNV基因组保留了两个完整的末端结构而其它部分缺失的重组质粒中.将这种重组质粒转染虫体后,在虫体中检测到了荧光素酶的表达,说明在缺失基因组中间部分时,插入的外源基因依然可以复制、表达.本结果证实了PfDNV基因组的末端结构是PfDNV复制的必需结构.这一实验为将外源基因引入病毒基因组,构建基因工程杀虫剂提供了有效的技术途径.现将结果报告如下.     

含荧光素酶基因的黑胸大蠊浓核病毒重组质粒的构建与表达

A luciferase gene has been inserted into the recombinant plasmid PfDNV-pUC119 which contained partly deletion of genome of Periplanete fuliginosa densovirus(PfDNV.)The recombinant plasmid with luciferase gene was co-transfrected with PfDNV-pUC 119 into Periplanele fuliginosa larvae and had a high luciferase gene expression in enteron of the transfected larvae.     

黑胸大蠊浓核病毒分类的相关研究

黑胸大蠊浓核病毒(pfDNV)是在我国首先发现并正式分类鉴定的蟑螂浓核病毒。该病毒属细小病毒科(Parvoviridae),浓核病毒亚科(Densovirinae)。但对该病毒的归属问题却一直没有确定,本文对此予以探讨。pfDNV的最新研究进展包括两个方面：全基因组核苷酸序列的测定,以及利用低温电镜技术和像重构方法对该病毒的三维重构(分辨率23A)。在此基础上,本文将pfDNV与其它病毒在基因组结构和三维结构方面进行了全面的对比分析,其结果并不支持目前对pfDNV的分类,因此建议对该病毒重新进行分类。     

黑胸大蠊浓核病毒NS2蛋白亚细胞定位

黑胸大蠊浓核病毒(Periplaneta fuliginosa densonucleosis virus,PfDNV)是胡远扬等人在国内首次报道,并在国内外第一个正式分类鉴定的蟑螂浓核病毒[1],ICTV第八次会议正式将其独立列为一个属:Pefudensovirus.     

黑胸大蠊浓核病毒磷脂酶A2功能区的克隆及其表达

通过RT-PCR扩增获得PfDNV结构蛋白基因VP1含磷脂酶A2(PLA2)功能区片段,将其连接到pMD18-T载体上并亚克隆到原核表达载体pET28a和pET26b,构建阅读框架正确的重组表达载体pET28a-PLA和pET26b-PLA,转化大肠杆菌BL21-codonplus(DE3)-RIL,经IPTG诱导,SDS-PAGE显示得到了目的融合蛋白,以抗组氨酸的单克隆抗体对经Ni-NTA亲和层析柱纯化的目的蛋白进行了westernblot鉴定,结果表明成功表达PfDNV结构蛋白PLA2,对于研究该酶的生物学特性及其在病毒对细胞侵染过程中的功能奠定了基础。     

黑胸大蠊浓核病毒磷脂酶A2功能区的克隆及其表达

通过RT-PCR扩增获得PfDNV结构蛋白基因VP1含磷脂酶A2(PL A2)功能区片段,将其连接到pMD18-T载体上并亚克隆到原核表达载体pET28a和pET26b,构建阅读框架正确的重组表达载体pET28a-PLA和pET26b-PLA,转化大肠杆菌BL21-codonplus(DE3)-RIL,经IPTG诱导,SDS-PAGE显示得到了目的融合蛋白,以抗组氨酸的单克隆抗体对经Ni-NTA亲和层析柱纯化的目的蛋白进行了western blot鉴定,结果表明成功表达PfDNV结构蛋白PLA2,对于研究该酶的生物学特性及其在病毒对细胞侵染过程中的功能奠定了基础.     

黑胸大蠊浓核病毒NS2蛋白的表达、抗体制备及亚细胞定位

ns2是黑胸大蠊浓核病毒的一个非结构基因, 所编码的蛋白质大小为30 kD, 是一个功能未知的基因。为了对该基因进行深入的功能研究, 从感染了黑胸大蠊浓核病毒的蟑螂的后肠组织中通过RT-PCR得到ns2基因编码序列, 将其构建于原核表达载体pET-28a, 转化大肠杆菌BL21(DE3) 获得融合表达产物。此融合蛋白经分离纯化后, 免疫新西兰大白兔, 制备其多克隆抗体。采用Western印迹技术, 用该抗体检测ns2基因的真核表达产物, 证明该抗体有较好的针对NS2蛋白的专一性, 可用于对NS2结构和功能的研究。同时, 将此编码序列克隆至果蝇细胞表达载体pAC, 得到重组质粒后转染果蝇S2细胞表达重组蛋白, 通过共聚焦显微镜用该抗体检测该蛋白在S2细胞中的亚细胞定位, 发现NS2蛋白主要定位于细胞质, 核内仅有少量分布。     

黑胸大蠊的生物学

黑胸大蠊(Periplaneta fuliginosa Serville)是我国室内蠊(俗称蟑螂)的重要种,属蠊目、螊科、大蠊属。此虫分布极广,为害甚烈,不但啃食、污染和咬损室内的各种食品、衣物、书籍、皮革等,还携带传播人、畜疾病的痢疾杆菌、副伤寒杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌等种致病菌和蛔虫卵、钩虫卵等多种寄生虫卵,是必须防治的室内害虫。作者于1985年以来,对黑胸大蠊的生物学特性进行了初步研究,现总结如下。形态特征 (一)成虫大型,黑褐色,有较强的光泽。雌虫体长2.8-3.3cm、体宽1.2-1.5cm,前翅长2.1-2.3cm。肛上板中线隆起成脊,后缘呈三角形切口,形成左右两片,各片后端纯圆,切口顶端尖锐。下生殖板大型,中线隆起如船底。雄体长2.7-3.3cm、宽1.1-     

黑胸大蠊（Periplaneta fuliginosa）病毒的分离及某些特性

从黑胸大蠊(Periplaneta fuliginosa)自然罹病的虫尸中分离得到一株非包涵体病毒。将病毒悬液均匀拌入无菌饲料并供食154～169日龄黑胸大蠊健康若虫时,能使其感染、发病,死亡率可达98％以上。在电子显微镜下观察时,病毒为球形二十面体颗粒,直径约23nm。病毒悬液具有典型核蛋白紫外吸收光谱。病毒用DNase和RNase处理并经吖啶橙染色、二苯胺和苔黑酚试验及甲醛反应证明:该病毒含有单链DNA。以上特性与细小病毒科的特征有点类似。     

Pathogenicity of diatraea saccharalis Densovirus to Host Insets and Characterization of its Viral Genome

Pathogenicity of the Diatraea saccharalis densovirus (DsDNV) was tested on its host larvae. The results showed that up to 4 days after inoculation, no larvae mortality was observed and the infected larvae started to exhibit the infection symptoms from the fourth day. After 5 days of infection, the cumulative mortality of infected larvae increased significantly and reached 60% after 12 days and 100% after 21 days of infection, whereas that of the control group was only 10% and 20%, respectively, after same periods of infection, suggesting that the high mortality of infected larvae groups was due to the high pathogenicity of DsDNV. The size of the DsDNA was determined by Electron microscopy visualization of viral DNA molecules and gel electrophoresis of both native and endonuclease digested DNA fragments. The total length of the native DsDNA was about 5.95 kb. The DsDNV DNA was digested with 16 restriction enzymes and a restriction map of those enzymes was constructed with 41 restriction sites. Comparison of the restriction map of the DsDNV genome with those of the genomes ofJunonia coenia densovirus (JcDNV) and Galleria mellonella densovirus (GmDNV) indicated that the three densovirus genomes were found to share many identical restriction sites. Thus, most of the restriction sites of the following endonucleases Bam H I, Hha I, Xba I, Cla I, Asp 700, Spe I, Nco I and Bcl I, were found to be conserved among the three densovirus genomes. Symmetrical cleavage sites mapped at the both ends of the genome suggested the presence of inverted terminal repeats (ITRs) whose size was estimated to be about 500 bp. The similar genome size, almost identical restriction sites and presence of an ITR of about 500 bp for these three densoviruses suggested that they belong to the same group of ambisense densoviruses.