盐地碱蓬过氧化氢酶基因的克隆及盐胁迫下的表达分析

过氧化氢酶是清除H2O2的重要酶类.从400 mmol/L NaCl处理的盐地碱蓬(Suaeda salsa(L.)Pall)地上部分的cDNA文库中克隆了两个编码过氧化氢酶的cDNA(Sscat1和Sscat2),其中Sscat1(1.7kb)是一个全长cDNA克隆,编码一个492个氨基酸的开放阅读框架,而Sscat2(1.1kb)是一个cDNA片段.据编码Sscat1 3＇端的287个氨基酸的cDNA序列与Sscat2的cDNA序列进行的BLAST同源性分析表明,Sscat1和Sscat2在核苷酸水平的一致性为71.9%,在氨基酸水平上的一致性为75%.Southem杂交表明,Sscat1在盐地碱蓬基因组中为多拷贝基因,Sscat2则为一个单拷贝基因.Northern杂交结果表明在盐胁迫条件下Sscat1和Sscat2的表达存在差异:400 mmol/L NaCl处理48h的盐地碱蓬根中的Sscat1和Sscat2 mRNA水平比对照显著提高,但是在叶中仅Sscatl受盐诱导表达.不同盐处理时间下的表达分析也证实,在盐地碱蓬叶中仅Sscat1受盐诱导表达.这说明Sscat1和Sscat2在盐地碱蓬中是差异调控的.生理分析表明过氧化氢酶的活性在盐胁迫条件下显著提高.     

盐地碱蓬的化学成分研究

采用硅胶、聚酰胺、Sephadex LH-20等色谱方法从盐地碱蓬乙醇提取液中分离得到6个化合物,分别鉴定为β-谷甾醇(1)、胡萝卜苷(2)、没食子酸(3)、槲皮素(4)、槲皮素-3-O--β-D-吡喃葡萄糖苷(5)和苯甲醇-β-D-吡喃糖苷(6).以上化合物均为首次从碱蓬属植物中分离得到.     

盐地碱蓬过氧化氢酶基因的克隆及盐胁迫下的表达分析

过氧化氢酶是清除H2O2的重要酶类,从400mmol/LNaCl处理的盐地碱蓬（Suaeda salsa(L.)Pall)地上部分的cDNA文库中克隆了两个编码过氧化氢酶的cDNA(Sscat1和Sscat2)。其中Sscatl(1.7kb)是一个全长cDNA克隆,编码一个492个氨基酸的开放阅读框架。而Sscat2(1.1kb)是一个cDNA片段。据编码Sscatl3′端的287个氨基酸的cDNA序列与Sscat2的cDNA序列进行的BLAST同源性分析表明,Sscat1和Sscat2在核苷酸水平的一致性则为一个单拷贝基因。Northern杂交结果表明在盐胁迫条件下Sscat1和Sscat2的表达存在差异;400mmol/LNaCl处理48h的盐地碱蓬根中的Sscat1和Sscat2mRNA水平比对照显著提高,但是在叶中仅Sscat1受盐诱导表达,不同盐处理时间下的表达分析也证实。在盐地碱蓬叶中仅Sscat1受盐诱导表达。这说明Sscat1和Sscat2在盐地碱蓬中是差异调控的,生理分析表明过氧化氢酶的活性在盐胁迫条件下显著提高。     

盐地碱蓬(Suaeda salsa)中SsINPS基因的分子克隆及表达特性分析

肌醇 1 磷酸 (I 1 P)合成酶 (EC5 .5 .1 .4,INPS)是肌醇生物合成中的关键酶 ,催化葡萄糖 6 磷酸 (G 6 P)到I 1 P的反应。从该实验室已构建的NaCl40 0mmol/L处理的盐地碱蓬 (Suaedasal sa)cDNA文库中克隆了肌醇 1 磷酸合成酶的全长cDNA (S .salsamyo inositol 1 phosphatesynthase,SsINPS) ,基因注册号为AF43 3 879。SsINPS全长约 1 986bp ,含有开放式阅读框架 1 5 3 0bp ,3′和 5′的非翻译区分别为 1 3 9bp和 3 1 7bp ;推导的氨基酸序列全长 5 1 0个氨基酸残基 ,分子量约为 5 6 .7kD ,pI值为 5 .3 5。BLAST同源性分析表明 ,该cDNA与已报告的冰叶日中花 (Mesembryanthemumcrys tallinum)的INPS基因同源性最高 ,其中 ,核苷酸水平的同源性为 91 % ,氨基酸水平上的同源性为84%。以SsINPS全长cDNA为探针进行的South ern杂交结果表明 ,SsINPS基因在盐地碱蓬基因组中只有一个拷贝 ;Northern结果表明 ,在盐处理(40 0mmol/L的NaCl)下 ,SsINPS在叶中的表达量有显著的增加。从而说明SsINPS在盐胁迫下是上升调节的     

真盐生植物盐地碱蓬资源特征与利用开发研究进展

盐地碱蓬为藜科碱蓬属一年生真盐生植物,能适应特殊的盐碱生境,具有典型的摄盐性和集积特征及种子二型性.本研究简要介绍了盐地碱蓬的生物学特性,重点概述了盐地碱蓬在盐碱地、重金属污染、石油污染、水体污染等生态价值,系统地综述了在食用蔬菜、黄酮类和多糖类、食用油和生物柴油、色素、膳食纤维、植物盐和植物碱、新型饲料和饲料添加剂、...     

盐地碱蓬耐盐相关基因克隆研究进展

盐地碱蓬是一种生长于盐碱地和海滨沙滩的盐生植物,富含氨基酸、维生素、矿物质等,极具开发价值。由于其具有很强的耐盐性,人们日益重视其耐盐机理的研究。目前对其耐盐机理的研究已经进入到耐盐基因的克隆、结构分析、功能研究等方面。综述了近年来盐地碱蓬与耐盐相关的基因克隆、结构及功能分析等方面的研究进展。     

盐地碱蓬基因工程研究进展

盐地碱蓬(Suaeda salsa)是一种典型的抗逆性强的真盐生植物,且营养丰富、含有多种功能 成分,蕴涵着巨大的生态、经济和社会效益,特别是在植物耐盐基因工程的研究利用方面更显示 出了广阔的应用前景和巨大的利用价值,因而近年来日益为人们所重视。目前对盐地碱蓬抗逆 特别是抗盐机制的研究已从生理水平深入到了生化及分子水平,并由此带动了其耐盐基因工程 的研究;另一方面,对其保健和药用功效的研究也取得了一定进展。以盐地碱蓬抗盐机制及其基 因工程研究为重点对以上方面的成果进行了综述。     

盐地碱蓬化学成分及其开发利用的研究进展

综述了盐地碱蓬的化学成分、药理作用及开发利用等方面的研究进展,并提出了在以后的化学研究中应该重点关注的一些问题。     

盐地碱蓬内生中度嗜盐菌

植物内生菌已经成为我国微生物领域研究的热点之一[1],对植物内生细菌的研究不仅丰富了内生菌的生理类群及数量,而且探索了内生菌与植物的相互关系;同时也发现了一些新分类地位的菌株。目前,关于植物内生极端微生物的研究较少,本刊2010年第2期刊登了崔春晓、夏志洁等发表的文章"盐地碱蓬内生中度嗜盐菌的分离与系统发育多样性分析"[2],作者根据盐地碱蓬内生境高盐的特点,从中不仅     

盐地碱蓬(Suaeda salsa)APX 基因的克隆及盐胁迫下的表达

从盐地碱蓬 (Suaedasalsa)中克隆了抗坏血酸过氧化物酶 (ascorbateperoxidase ,APX)的全长cDNA(SsAPX) ,基因注册号为AY0 34 893。SsAPX全长 1.1kb ,推导的氨基酸序列长为 2 5 0个氨基酸残基。BLAST同源性分析表明 ,该cDNA与已报告的菠菜(Spinaciaoleracea)细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因同源性最高 ,在核苷酸水平上一致性为 87% ,在氨基酸水平上一致性为 89%。Southern杂交表明APX基因在盐地碱蓬基因组中只有 1个拷贝。盐 (NaCl 40 0mmol/L)处理不同时间后的Northern杂交分析表明盐地碱蓬中SsAPX基因在盐胁迫下表达量增加 ,而且在盐胁迫下抗坏血酸过氧化物酶的活性也显著地增加 ,说明该基因受盐诱导。推测抗坏血酸过氧化物酶可能在保护盐地碱蓬免受氧化损伤的过程中起到一定作用     

盐地碱蓬叶片液泡膜H^＋—ATPase B亚基的克隆及盐胁迫下表达分析

植物液泡膜H^ -ATPase在建立跨液泡膜质子梯度、促进液泡Na^ 区域化、提高植物耐盐性方面发挥着重要作用。本实验从盐生植物盐地碱蓬(Suaeda salsa L.)cDNA文库分离到碱蓬叶片液泡膜H^ -ATPase B亚基cDNA克隆。测序表明该基因长达1974bp,开放阅读框有1470bp编码489个氨基酸,含有一个保守的ATP结合位点,其蛋白分子量约为54．29kD。Northern及Western印迹表明盐地碱蓬液泡膜H^ -ATPase B亚基表达明显受NaCl胁迫诱导,并且在NaCl胁迫下,B亚基在转录及翻译水平上与液泡膜H^ -ATPase c亚基存在协同作用。盐胁迫下,盐地碱蓬液泡H^ -ATPase B亚基与c亚基的协同表达增加了液泡H^ -ATPase的数量,从而提高了液泡H^ -ATPase活性,为碱蓬叶片液泡Na^ 区域化提供了动力,最终提高了碱蓬植株的耐盐性。     

盐胁迫下盐地碱蓬叶片液泡膜H+-ATPase H 亚基的克隆与表达分析

利用EST随机挑取克隆测序的方法从盐地碱蓬叶片cDNA文库中分离得到了盐地碱蓬V-H -ATPase H亚基cDNA序列,并进行了H、c亚基基因表达及V-H -ATPase活性分析.结果表明,H亚基基因全长1 969 bp,包括100 bp的5′-非编码区和471 bp的3′-非编码区.开放阅读框为1 398 bp,编码465个氨基酸残基,分子量约52.8 kD.N orthern杂交分析表明盐胁迫明显诱导了H亚基表达,而且盐胁迫下H、c亚基及V-H -ATPase活性存在协同作用.这些结果表明盐胁迫下H和c亚基基因上调及V-H -ATPase活性的增加为N a 区隔化到液泡中提供了质子驱动力.     

双萤光素酶共表达载体构建及特性研究

利用来源于TaV的自剪切多肽2A的编码序列构建一种分泌型萤光素酶Gluc和非分泌型萤光素酶Fluc共表达的载体,对其体内外表达及活体成像特点进行研究。采用重叠PCR技术获得Gluc-2A-Fluc片段,克隆入表达质粒pAAV2neoCAG中,获得重组质粒pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc。将重组质粒瞬时转染BHK-21细胞,24h后在细胞上清液和细胞裂解液中均能检测到Gluc和Fluc的表达,其中Gluc98%以上分布在上清液中,而Fluc98%以上存在于细胞中,随时间延长Gluc活性在上清液中逐步增加,而细胞内Fluc活性则保持相对平稳。用水动力法经小鼠尾静脉注射pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc质粒DNA,通过尾静脉微量采血(2.5μl/次)即可实时地监测体内Gluc的表达情况。活体成像结果显示,注射Gluc的底物腔肠素时小鼠明显表现为全身显像,显像在10min内迅速衰减;而注射Fluc的底物D-Luciferin时显像主要集中在肝脏,显像在30min内都比较稳定。本研究设计和构建的pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc质粒实现了分泌型和非分泌型萤光素酶的共表达,既可以在不裂解细胞或处死动物的情况下直接在细胞培养上清或血液中动态检测Gluc的活性,又可以利用活体成像技术准确定位Fluc表达部位,比单一的萤光素酶报告载体在细胞标记和体内示踪研究方面更具优越性。     

NaCl和Na2CO3对盐地碱蓬胁迫效应的比较

在相同的Na 浓度(如100 mmol/L)下,NaCl处理促进碱蓬植株干重增加,提高根系活力,而Na2CO3处理导致植株干重减少,根系活力降低;与NaCl胁迫相比,Na2CO3胁迫下叶片内Na 含量上升和K 含量下降幅度更大,叶肉细胞质Na 含量和叶内脯氨酸含量增加幅度更大,而V-H -ATPase(液泡膜H -ATPase)和V-H -PPase (液泡膜H -PPase)增加幅度较少;与NaCl胁迫不同,Na2CO3胁迫下SOD(超氧化物歧化酶)活性不是增加,而是降低,与此相一致,MDA(丙二醛)含量大幅度增加.上述结果表明,碱蓬对Na2CO3胁迫的抗性低于对NaCl的抗性,这可能与Na2CO3胁迫引起的Na 、K 离子严重失衡、活性氧清除能力降低有关.     

盐地碱蓬叶片液泡膜H+-ATPase B亚基的克隆及盐胁迫下表达分析

植物液泡膜H -ATPase在建立跨液泡膜质子梯度、促进液泡Na 区域化、提高植物耐盐性方面发挥着重要作用.本实验从盐生植物盐地碱蓬(Suaeda salsa L.)cDNA文库分离到碱蓬叶片液泡膜H -ATPase B亚基cDNA克隆.测序表明该基因长达1 974 bp,开放阅读框有1 470 bp编码489个氨基酸,含有一个保守的ATP结合位点,其蛋白分子量约为54.29 kD.Northem及Western印迹表明盐地碱蓬液泡膜H -ATPase B亚基表达明显受NaCl胁迫诱导,并且在NaCl胁迫下,B亚基在转录及翻译水平上与液泡膜H -ATPase c亚基存在协同作用.盐胁迫下,盐地碱蓬液泡H -ATPase B亚基与c亚基的协同表达增加了液泡H -ATPase的数量,从而提高了液泡H -ATPase活性,为碱蓬叶片液泡Na 区域化提供了动力,最终提高了碱蓬植株的耐盐性.     

拟南芥AtNHX5基因的cDNA克隆及其正义、反义表达载体的构建

采用RT-PCR方法从拟南芥品种Landsberg的实生苗叶片中克隆AtNHX5基因的cDNA,核酸序列表明该基因编码区为1 554 bp,编码538个氨基酸.与GenBank发表的序列(AF490589)相比,有三处碱基不同,分别为850 bp处的G(GenBank的为A)、904 bp处的T(A)、985处的G(A).将该基因分别正向或反向置于CaMV35S启动子之后,可构建正义、反义表达载体.     

影响农杆菌转化效率的植物因子H2A1基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

拟南芥组蛋白H2A1是影响农杆菌T-DNA整合到宿主基因组的关键因素之一。与其它H2A组蛋白一样,它含有1个保守的H2A结构域。本研究利用PCP技术从拟南芥中成功扩增到H2A1基因组序列的全长。产物纯化后克隆到pBI121(Kmr),从而构建了H2A1的植物表达载体pBI121-H2A1。PCR和DNA测序证实载体构建成功。最后用电击法将该重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404菌株中形成工程菌。此表达载体的构建为进一步研究H2A1的功能和提高外源基因在植物中稳定表达水平奠定了基础。     

转录因子DREB1A基因的克隆与Gateway克隆技术构建植物表达载体

目的:研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用,并探讨利用Gateway克隆技术构建植物表达载体的方法。方法:根据GenBank中登录的DREB1A基因的全长mRNA序列设计引物,克隆了拟南芥的转录因子DREBIA基因。根据Gateway克隆技术的要求,设计含有attB接头的引物,利用高保真的PlatinumpfxDNA聚合酶,通过PCR方法在克隆基因的两端加上B序列。通过BP反应将包含有attB接头的PCR产物克隆到含有attP的donor载体上以产生Entry克隆,通过LR反应将已经重组入Entry载体的DREB1A基因再克隆到pH2GW7双元载体。结果:对重组载体pH2GW7-DREB1A的鉴定结果表明成功构建了DREB1A基因的植物表达载体。结论:利用Gateway克隆技术构建植物表达载体简便易行,该结果为遗传转化研究奠定了基础。