胰高血糖素样肽-1类似物活性检测的CHO细胞模型构建

该文构建了一种胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)类似物活性检测的细胞模型,为GLP-1类似物的药物筛选提供了一种简单可靠的评价方法。真核表达质粒pc DNA3.1/h GLP-1R转染至中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO),经单克隆筛选和遗传霉素(G418)压力筛选最终筛选出6株单克隆菌株。流式细胞仪检测GLP-1受体(glucagon-like peptide-1 receptor,GLP-1R)的表达量,最终筛选获得1株高表达的细胞模型(CHO/pc DNA3.1/h GLP-1R)。RT-PCR结果显示,该细胞模型转录h GLP-1R基因;流式细胞仪检测结果和激光共聚焦结果显示,细胞模型的膜表面有h GLP-1R蛋白的表达。连续传代10次,细胞膜表面的h GLP-1R蛋白表达没有变化。构建的细胞模型活性检测结果显示,该细胞模型可以很好地用于GLP-1类似物的活性检测。综上所述,该细胞模型为GLP-1类似物的活性检测建立了一种方便可靠的体外活性检测方法。     

GFP荧光标记GLP-1受体细胞系的建立

为建立胰高血糖素样肽1受体(glucagon-like peptide 1 receptor,GLP-1R)药物筛选模型,真核表达载体pCMV6/GFP/GLP-1R构建好后,转染至U2OS细胞,转染后的细胞经G418筛选获得单克隆细胞株。该细胞株经Western-blot和GLP-1类似物检测,结果表明GLP-1R在该细胞株高表达并对GLP-1类似物有着高灵敏度与特异性的反应,可以用于GLP-1受体激动剂的筛选。     

人GLP-1R基因转染BHK细胞及重组细胞的应用

为了构建表达人胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)基因的BHK细胞株,并利用该重组细胞对GLP-1等相关肽进行活性测定,首先通过酶切、连接方式将人GLP-1R基因克隆至真核表达载体pCDNA3.(1 )中,然后用脂质体转染法将重组质粒转染至BHK-21细胞,转染后的细胞经G418加压筛选、细胞有限稀释等方法获得克隆细胞株。经过该细胞株RT-PCR验证,结果证实目的基因已整合至BHK-21细胞基因组中,并获得成功转录和表达。活性检测实验表明该重组细胞株经过GLP-1的刺激后,其细胞中的cAMP含量得到明显提升。该细胞株的构建为GLP-1及相关肽的活性测定奠定了基础。     

胰高血糖素样肽1或其类似物体外生物活性检测方法的建立

目的:通过对不同活性检测方法的综合比较,筛选最适的胰高血糖素样肽1(GLP-1)或其类似物的体外活性检测方法,为GLP-1类似物的体外生物活性检测奠定基础。方法:以GLP-1作为阳性药物,用MTT方法检测其对RIN-m-5F、MIN6细胞增殖的影响;用ELISA方法检测其对INS-1、MIN6细胞胰岛素分泌量的影响;用ELISA方法检测其对BHK-GLP-1R细胞cAMP分泌水平的影响。通过对上述方法的综合比较,筛选出最适的活性检测方法。结果:GLP-1对细胞增殖的影响实验结果并不显著,对胰岛素分泌量影响的实验效果明显,对cAMP分泌水平的实验无明显效果。结论:ELISA检测GLP-1或其类似物对MIN6细胞胰岛素分泌量实验可用于GLP-1或其类似物的体外活性检测。     

稳定表达GLP-1类似物的CHO细胞株的构建及培养工艺研究

胰高血糖素样肽-1(Glucagon like peptide-1,GLP-1)是一种治疗II型糖尿病的潜在药物,针对其在体内半衰期短和在酵母中表达的批次间不稳定等问题,课题组前期对其进行改造,成功利用p MH3载体在中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞中表达人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)融合蛋白NGGH[6×His-tag+Ek+2×GLP-1(A2G)+HSA]。现利用新型载体pcDNA3.1,构建含融合蛋白的真核表达质粒pcDNA3.1/NGGH,经电击转染转入CHO细胞中。G418抗性压力筛选后利用一种新型的细胞成像系统高效快速地筛选出高表达单克隆株。表达的目的蛋白经WB(Western blot)验证显示,产物具有GLP-1和HSA的双抗原性。经悬浮驯化稳定后,通过批次筛选得到一株稳定的高表达细胞株,产量为58mg/L。利用5L AP20激流式生物反应器扩大培养重组细胞,对p H和溶氧控制条件进行了优化。结果显示,在p H6.8~7.4,溶氧(dissolved oxygen,DO)两相控制的条件下,蛋白质最终表达量可达148mg/L。     

重组人胰高血糖素样肽-1类似物的分离纯化和鉴定

将合成的人胰高血糖素样肽-1类似物基因插入到原核表达质粒pGEX-4T-3中,构建成rhGLP-1类似物与谷胱甘肽巯基转移酶（glutathione-S-transferases,GST）的融合表达载体pGEX-rhGLP-1类似物,转化大肠杆菌BL21（DE3）获得重组菌株。IPTG诱导表达的菌体经高压均质机破碎后,离心收集包涵体,经尿素变性、Glutathione-Sepharose 4B亲和层析、肠激酶酶切、SP-Sepharose FF层析和反相层析RP-C18脱盐后冻干,得到纯度大于96%的rhGLP-1类似物,经质谱测定,分子量与理论值一致。生物学活性分析表明,rhGLP-1类似物具有促进表达有GLP-1受体的HEK293细胞cAMP增加的活性。     

利用GAP启动子在毕赤酵母中表达与纯化GLP-1类似物

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)能提高II型糖尿病患者β胰腺细胞的胰岛素分泌量并能促进β胰腺细胞增殖,是潜在的糖尿病治疗药物。设计一种GLP-1类似物AGGH,即GLP-1(A2G)的二联体与人血清白蛋白(HSA)的N端连接,并在融合蛋白GGH前添加一个丙氨酸(A)。PCR获得融合基因aggh,将融合基因连接到p GAPZαA质粒中。在酵母中利用甘油醛三磷酸脱氢酶(GAP)启动子组成型表达外源蛋白AGGH。研究结果显示:筛选获得表达重组菌株,基因组PCR和western-blot验证正确;以葡萄糖为最优碳源培养下,表达量达到68 mg/L;5 L发酵罐中,发酵52 h蛋白产量最高达238 mg/L。蛋白经四步纯化后,获得纯度为95.8%的AGGH融合蛋白。与利用醇氧化酶1(AOX1)启动子表达的AGGH比较,发现两者产量和活性没有明显差异。但是,GAP启动子表达获得AGGH融合蛋白更加方便,且发酵时间减少了27.8%(20 h)。     

B族G蛋白偶联受体PAC1可调控表达体系的建立

PAC1是神经肽垂体腺苷酸环化酶激活多肽(Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide,PACAP)的特异受体,属于B族G蛋白偶联受体,介导PACAP的神经递质、神经调质、神经保护、抗神经损伤及调控神经再生等功能,PAC1高表达和神经损伤、肿瘤等生理病理过程密切相关。为了深入了解PAC1的功能,构建PAC1可调控表达的细胞系,通过优化的四环素控制表达系统实现PAC1在中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞的强力霉素(doxycycline,Dox)依赖的可控表达。首先通过双酶切将编码PAC1和增强型黄色荧光蛋白(EYFP,enhanced yellow fluorescent protein)的融和基因PAC1-EYFP克隆到pTRE-Tight载体上,获得重组载体pTRE-PAC1-EYFP;基因测序鉴定正确后将新型的四环素调节元件载体pTet-on advanced和反应元件载体pTRE-PAC1-EYFP分别转入CHO细胞中,G418和潮霉素(Hygromycin)双抗筛选阳性克隆PAC1-Tet-CHO,使用梯度浓度四环素类似物强力霉素Dox诱导PAC1-EYFP表达,48 h后检测受体表达水平,并通过MTT法检测不同PAC1表达水平的细胞增殖活性。荧光检测和Western印迹结果显示,成功获得了具有良好诱导性的Dox依赖的PAC1可控表达的细胞系,这些细胞株在传10代后仍能稳定地可控表达PAC1。MTT结果显示PAC1表达水平越高,细胞增殖活性越强。成功所构建的Dox依赖的PAC1可控表达细胞系,为PAC1的生物学功能的深入研究奠定了基础。     

重组胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白的纯化及活性研究

利用构建的重组菌株Pichia pastoris GS115/GLP-1/HSA,在10L发酵罐中表达了胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白(GLP-1/HSA),表达量为63.6mg/L。发酵液经中空纤维柱浓缩、疏水层析、阴离子交换层析和凝胶过滤分离纯化,获得了较高纯度的GLP-1/HSA,经HPLC分析纯度达95.8%。进一步的体内活性分析结果表明,GLP-1/HSA不仅具有天然GLP-1的生物活性,而且在给药后4h仍能发挥显著性降血糖作用。以上结果表明,利用Pichia pastoris分泌型表达系统和建立的分离纯化方法,能获得大量较高纯度的GLP-1/HSA,为进一步研究和开发能够用于糖尿病临床治疗的长效GLP-1类似物奠定了基础。     

APRT缺陷型CHO细胞系的建立及其重组蛋白表达能力评价北大核心CSCD

中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞是生产复杂重组药物蛋白的首选宿主细胞,腺嘌呤磷酸核糖转移酶(adenine phosphoribosyltransferase,APRT)催化腺嘌呤与磷酸核糖缩合形成腺苷一磷酸,是嘌呤生物合成步骤中的关键酶。采用基因编辑技术敲除CHO细胞中aprt基因,验证获得的APRT缺陷型CHO细胞系的生物学特性;构建两种真核表达载体:对照载体(含有目的基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和弱化载体(含有启动子和起始密码子突变的aprt弱化表达盒及EGFP),分别转染APRT缺陷型和野生型CHO细胞并筛选获得稳定转染的细胞池;重组CHO细胞传代培养60代并用流式细胞术检测EGFP表达的平均荧光强度,并比较不同实验组重组蛋白EGFP的表达稳定性。PCR扩增和测序结果表明,CHO细胞aprt基因成功敲除;获得的APRT缺陷型CHO细胞系在细胞形态、生长增殖、倍增时间等生物学特性方面与野生CHO细胞无显著差异。目的蛋白瞬时表达结果表明,与野生型CHO细胞相比,转染对照载体和弱化载体的APRT缺陷型CHO细胞系中EGFP的表达分别提高了42%±6%和56%±9%;特别是长期传代培养时,转染弱化载体的APRT缺陷型细胞中EGFP表达量显著高于野生型CHO细胞(P<0.05);构建的基于APRT缺陷型CHO细胞系能够明显提高重组蛋白的长期表达稳定性。研究结果为建立高效稳定的CHO细胞表达系统提供了一种有效的细胞工程策略。     

用于筛选抑制丙型肝炎病毒内部核糖体进入位点活性药物的整合型细胞药物筛选模型的构建和评价

目的：构建一个能用于筛选抑制丙型肝炎病毒内部核糖体进入位点（HCV—IRES）活性药物的整合型细胞药筛模型。方法：构建携带HCV 5＇-UTR调控报告基因分泌型碱性磷酸酶（SEAP）基因的质粒pHCV5’-SEAP和用作筛选标记的pNeo^R,线性化后共转染于Huh-7细胞中,经G418筛选后得到抗性细胞克隆,进行SEAP定量检测筛选后,得到能用于筛选抑制HCV-IRES活性药物的整合型细胞药筛模型;连续培养24代,用MTT法测细胞相对活力评价该药筛模型的生长稳定性,用SEAP定量检测法评价该药筛模型的SEAP表达稳定性,用反义寡聚核苷酸抑制试验评价模型的药筛灵敏度。结果：G418筛选后得到26个抗性细胞克隆;对其中5个抗性细胞克隆进行SEAP定量检测筛选后,得到3个能表达SEAP的阳性细胞克隆;连续培养24代过程中,该药筛模型的生长稳定性大干80％,SEAP表达稳定性达95％。结论：构建的细胞模型具有良好的稳定性和药筛灵敏度,符合作为药物筛选模型的要求。     

GLP-1-IgG4-Fc融合蛋白的表达与鉴定

将合成的人胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)突变体基因与IgG4抗体的Fc部分进行融合获得GLP-1-IgG4-Fc片段,获得的基因片段与pXC17.4载体进行连接,用电转化方法将线性化质粒稳定转染CHO-K1细胞,通过Clone Pix 2筛选出高表达细胞株,产量达1.5g/L。收集培养上清并经Protein A和Source 30Q纯化,得到的GLP-1-IgG4-Fc融合蛋白,SDS-PAGE纯度高于95%,高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)纯度和毛细管区域凝胶电泳(capillary zone electrophoresis,CZE)纯度均不低于80%,尺寸排阻层析(size-exclusion chromatography,SEC)纯度高于99%。经质谱和肽图谱测定,分子量与理论值一致,肽图谱序列与对照品高度一致。生物学活性分析表明,GLP-1-IgG4-Fc融合蛋白具有促进表达有GLP-1受体的HEK293细胞分泌环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,c AMP)的活性,并且该活性与对照品高度相似。     

M1胆碱受体选择性别构激动剂的虚拟筛选和体外活性研究

目的:M1毒蕈碱型乙酰胆碱受体(M1受体)在改善学习和记忆等高级认知功能障碍中起重要作用,本文利用计算机辅助药物设计和高表达各M受体亚型的CHO细胞(Chinese hamster ovary cell,中国仓鼠卵巢细胞),以期筛选获得新型M1受体选择性别构激动剂。方法:通过计算机辅助药物设计方法,对已知具有M1受体选择性作用别构激动剂与M1受体的晶体结构进行对接,确定活性对接口袋,据此进行化合物库虚拟筛选;利用高表达各M受体亚型的CHO细胞,对化合物进行体外活性检测。结果:虚拟筛选得到184个化合物,其中,体外实验显示化合物AJ-292和AG-205-6对M1受体有明显的激动效果,而对M3、M5受体则无影响。结论:综合利用虚拟筛选、结构分析以及特异性活性分析,筛选出具有M1受体高选择性激动作用的化合物AJ-292和AG-205-6,为设计开发新型的M1选择性别构激动剂奠定了基础。     

长效GLP-1-IgG2σ Fc融合蛋白的真核表达与生物活性鉴定

目的:在真核细胞中融合表达胰高血糖素样肽1(GLP-1),纯化后探究产物的生物学活性。方法:通过预留酶切位点将合成的GLP-1-Ig G2σFc融合蛋白表达序列连入表达载体质粒,用电转方法将线性化质粒稳定转染CHO-K1细胞,通过亚克隆筛选出蛋白高表达细胞株;收集高表达细胞株培养上清并初步纯化,采用口服葡萄糖耐量试验(OGTT)探究GLP-1融合蛋白降低血糖的生物学活性。结果:经过一轮亚克隆,筛选得到的细胞株的GLP-1融合蛋白产量达1 g/L,OGTT实验结果表明GLP-1融合蛋白具有降血糖生物活性。结论:GLP-1变体和Ig G2σ的Fc段连接是一种可行的融合蛋白形式,融合蛋白具有GLP-1受体激动剂的降糖作用,并且细胞株的筛选方式和初步纯化方法也具有可行性,为后续的体内、外活性研究和纯化方法确定提供了基础。     

人α防御素2真核表达载体的构建及表达

目的:构建人α防御素2(α-HNP2)真核表达载体pc DNA3.1/myc-His(+)/α-HNP2,并实现其在CHO细胞中的表达,初步鉴定表达蛋白的抑菌活性。方法:以PBMC细胞总RNA为模板,利用RT-PCR法,扩增得到α-HNP2基因,构建真核表达载体pc DNA3.1/myc-His(+)/α-HNP2,脂质体法转染CHO细胞,G418筛选稳定表达的阳性克隆。用RT-PCR和Western blot检测α-HNP2蛋白的表达,同时检测表达产物的抑菌活性。结果:经PCR、酶切和DNA测序分析表明重组载体构建成功,并在CHO细胞中表达融合蛋白,琼脂平板扩散实验结果表明融合蛋白在大肠杆菌平板上形成明显抑菌圈。结论:CHO细胞中表达有活性的融合蛋白α-HNP2,为进一步的实验研究奠定了基础。     

过表达热休克蛋白70提高CHO细胞表达抗体的能力

通过在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中过表达热休克蛋白70以提高其表达抗体的能力。首先从中国仓鼠基因组DNA中扩取HSP70基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1-HSP70,再将重组质粒稳定转染到CHO/dhfr-细胞中,筛选获得稳定的细胞系,运用RT-qPCR检测和Western blot分析HSP70基因的过表达。在过表达HSP70的CHO细胞组和对照细胞组(转染空载体pcDNA3.1的CHO细胞组)中分别转染表达抗-HBs的质粒,应用ELISA检测两组细胞表达抗-HBs的能力。RT-qPCR结果显示实验组CHO细胞中HSP70基因的表达量明显高于对照组细胞;ELISA检测结果表明过表达HSP70的CHO细胞组抗-HBs表达量高于对照组细胞(P<0.05)。研究揭示HSP70能有效促进细胞内分泌性蛋白的表达。     

重组胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白的纯化及活性研究

利用构建的重组菌株Pichia pastoris GS115/GLP-1/HSA,在10L发酵罐中表达了胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白融合蛋白（GLP-1/HSA）,表达量为63.6mg/L。发酵液经中空纤维柱浓缩、疏水层析、阴离子交换层析和凝胶过滤分离纯化,获得了较高纯度的GLP-1/HSA,经HPLC分析纯度达95.8%。进一步的体内活性分析结果表明,GLP-1/HSA不仅具有天然GLP-1的生物活性,而且在给药后4 h仍能发挥显著性降血糖作用。以上结果表明,利用Pichia pastoris分泌型表达系统和建立的分离纯化方法,能获得大量较高纯度的GLP-1/HSA,为进一步研究和开发能够用于糖尿病临床治疗的长效GLP-1类似物奠定了基础。     

治疗糖尿病的短肽药物GLP-1在毕赤酵母中的分泌表达

利用毕赤酵母表达治疗糖尿病的短肽药物GLP-1(胰高血糖素样肽-1)。以pUC18GLP-1 为模板进行PCR,将获得的GLP-1基因片段克隆到pMD18T-vector上,然后将SmaI和NotI双酶切获得的基因小片段插入到表达载体pPIC9上,完成表达载体pPIC9GLP-1的构建,SacI线性化重组质粒,通过醋酸锂转化法转化毕赤酵母GS115感受态细胞,成功构建了能够分泌抗二肽酶Ⅳ降解的长效促胰岛素激素的毕赤酵母工程菌株。结果表明毕赤酵母6号菌株的GLP-1分泌表达产量最高可达 100．00 mg／L．实现了GLP-1在毕赤酵母中的表达,为进一步开发治疗糖尿病新型短肽药物的研究奠定了基础。     

趋化因子受体 CCR5 亲合短肽的筛选

趋化因子受体 5 (CCR5) 是 HIV-1 与宿主细胞结合的辅助因子之一,其功能缺失或被 CCR5 拮抗剂封闭则会阻止 HIV-1 感染细胞 . 为得到与 CCR5 特异结合的肽类拮抗剂,采用噬菌体展示技术,以稳定表达 CCR5 的 CHO 细胞 (CHO/CCR5) 作为靶标,通过噬菌体随机 12 肽库筛选与 CCR5 特异结合的多肽;经过四轮筛选后,挑选 20 个阳性噬菌体克隆进行测序,从中得到 11 个含有 AFDWTFVPSLIL 序列的小分子肽 . 含该序列的噬菌体能与抗人 CCR5 单抗 (2D7) 竞争性结合 CCR5 ,且合成肽 AFDWTFVPSLIL 对趋化因子 RANTES 与 CHO/CCR5 的结合具有明显的抑制作用,初步证明该小肽与 CCR5 具有特异性结合作用 .     

GLP-1合成与分泌的分子机制及其影响因素北大核心CSCD

肠促胰素之一的胰高血糖素样肽(GLP-1)是胰高血糖素原基因在肠道L细胞中编码的产物。研究发现GLP-1具有抑制摄食、刺激胰岛素分泌从而降低餐后血糖等重要生物学功能,而GLP-1类似物和受体激动剂等已作为糖尿病治疗主要药物用于临床。本文总结近年关于GLP-1合成与分泌的研究进展,简要介绍胰高血糖素原基因转录、翻译后修饰及其相关调控机制,并从营养物质、激素、自主神经系统、机体生理状态和病理状态等方面,介绍影响GLP-1水平的一些主要因素。