CRISPR/Cas9方法失活白念珠菌CaMIT1基因及其突变株表型分析

目的构建白念珠菌CaMIT1基因突变株,研究CaMIT1基因在白念珠菌中的功能。方法本文采用CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)/Cas9这种新的方法构建CaMIT1失活突变株,并通过倍比稀释的方法初步研究CaMIT1的功能。结果成功获得了CaMIT1基因的纯合子失活突变株,表型实验结果显示该基因突变株对钙离子、锂离子、十二烷基磺酸钠、克霉唑、酮康唑、Anidualafungin敏感,对刚果红耐受。结论 CaMIT1与白念珠菌的细胞质膜和细胞壁完整性以及钙离子的稳态相关。     

在钙离子敏感性方面与RCH1遗传互作的酿酒酵母基因的筛选

酿酒酵母ScRCH1是白念珠菌CaRCH1的同功基因,作为人体溶质转运蛋白SLC10A7的同源蛋白,两者都是细胞质膜上钙离子内流的抑制因子。为了研究酿酒酵母RCH1与基因组中其他基因之间的遗传互作,利用合成遗传阵列(Synthetic Genetic Array,SGA)方法构建了RCH1分别与其他非必需基因之间的双基因缺失株文库。钙离子表型筛选表明RCH1与17个基因之间存在遗传互作,其中4个基因BUD9、THR1、RAS2和CPR7在钙离子敏感性方面的功能以前没有报道过。这些结果为深入研究Rch1对钙离子稳态的调控提供了参考。     

酿酒酵母中与钙离子稳态调控因子ScRCH1细胞质膜定位相关的转录因子基因的筛选检测

酿酒酵母细胞中ymr034c基因与白念珠菌的Carch1基因同源,CaRCH1与白念珠菌对钙离子、锂离子和硝唑类药物的耐受性相关。因此,把ymr034c命名为Scrch1。前期研究结果显示,在胞外高钙离子胁迫条件下,ScRCH1定位于细胞质膜上。为了研究Scrch1基因表达的调控机理,通过荧光显微镜技术对酵母细胞基因组中编码转录因子的223个单基因缺失菌株进行了筛选,分别检测了ScRCH1-GFP融合蛋白在它们中的亚细胞定位情况。结果发现,钙离子处理后,ngg1、hal9、crz1、ada2和swi6五个转录因子基因的缺失造成ScRCH1-GFP没有细胞质膜定位,而ino2基因的缺失导致ScRCH1-GFP在不经钙离子处理的条件下即定位到细胞质膜上。     

白念珠菌CaSPO75基因的敲除与功能研究

酿酒酵母中ScCsc1是一个最近鉴定的钙离子通透性压力门控阳离子通道蛋白,参与调控胞内离子稳态。ScSpo75是ScCsc1的一个同源蛋白,可能参与孢子壁的装配过程。在白念珠菌中存在一个与ScSPO75同源的基因CaSPO75,其功能尚不清楚,因此采用SAT1-flipper方法敲除CaSPO75的两个等位基因以研究其功能。通过表型筛选,发现该基因的缺失导致白念珠菌对特比萘芬(Teb)、荧光增白剂(CFW)、氯化锰和氯化锌耐受,对酮康唑(KCZ)敏感。因此,CaSPO75基因可能参与白念珠菌耐药性和细胞壁压力反应的调控,以及胞内锰离子和锌离子稳态的调控。     

白念珠菌细胞内钙离子稳态和钙离子/钙调磷酸酯酶信号途径的调控机理研究进展

钙离子稳态和钙离子/钙调磷酸酯酶信号途径在真核细胞中高度保守。与最简单的模式真核生物(酿酒酵母菌)一样,人体病原真菌白念珠菌的细胞中存在各种钙通道、钙泵和钙交换器以及完整的钙离子/钙调磷酸酯酶信号途径成员,它们在维持白念珠菌胞内钙离子稳态以及应答外界环境压力、耐药性、形态发生和致病性等方面有着至关重要的作用。对白念珠菌钙离子稳态和钙离子/钙调磷酸酯酶信号途径调控机理的认知,有助于了解其致病过程和耐药机理,同时可以为发现和开发新的抗真菌药物提供研究基础。该文结合所在实验室相关研究工作对这一领域的最新研究进展作了综述。     

酿酒酵母细胞中钙离子信号传导途径的研究进展

酿酒酵母（SaccharomycescP增v括fdP）细胞可以通过ca2＋／钙调磷酸酶信号途径来应对许多外界环境胁迫。在交配信息素、盐或者其他环境压力存在的条件下,钙离子会通过细胞质膜上的未鉴定的钙转运蛋白x和M或者由Cchl和Midl组成的钙通道进入细胞质。胞质内钙离子浓度的增加会激活细胞质里的钙调磷酸酶（calcineurin）。钙调磷酸酶的一个非常重要的作用是去磷酸化细胞质内的转录因子Crzl,造成它快速地从细胞质转移到细胞核,从而诱导包括液泡膜上钙泵蛋白基因PMCl以及内质网膜和高尔基体膜上钙泵蛋白基因尸脚,在内的目标基因的表达。这两个钙泵蛋白和液泡膜上的Ca2＋／H＋交换蛋白Vcxl一起作用,将细胞质内的钙离子浓度控制在50～200nmol／L的正常生理浓度内．使细胞能够正常生长。该综述主要论述了酿酒酵母细胞内Ca2＋／钙调磷酸酶信号途径的最新研究进展。     

白念珠菌钙稳态系统及钙信号途径的研究进展

白念珠菌是临床重要的条件致病菌,其胞内的钙稳态及钙信号途径与宿主侵染、压力应答等诸多生理过程紧密相关。研究该菌的钙稳态系统及钙信号调控网络,对明确白念珠菌的侵染机制与耐药机理,以及开发具有新靶点的抗真菌药物具有重要意义。本文对这些内容的研究进展进行了综述。     

白念珠菌CaGDT1基因的功能研究

人类跨膜蛋白TMEM165与酿酒酵母Sc Gdt1均属于阳离子/钙离子交换器家族的成员,在本研究中,通过序列比对在白念珠菌中发现了Sc GDT1的同源基因Ca GDT1,表型互补实验显示Ca GDT1基因的表达能够抑制Sc GDT1基因缺失所造成的钙离子敏感性,证明Ca GDT1是Sc GDT1的同功基因。此外,通过同源重组原理敲除了Ca GDT1的2个等位基因。表型筛选结果表明gdt1/gdt1缺失株对钙离子、细胞壁和内质网3种胁迫均不敏感,而对酮康唑和特比萘芬2种抗真菌药物具有耐受性。     

抑癌基因P16在肺癌中的研究进展

抑癌基因P16与细胞周期调控密切相关,其主要作用是参与细胞周期过程,它通过细胞周期与其它癌基因及肿瘤抑制基因相互作用成为正常细胞增殖的调控因子。P16基因主要通过基因缺失、点突变及甲基化而失活,已证实该基因的失活与多种肿瘤的形成与转移密切相关。通过各种分子生物学技术检测出它在肿瘤中的表达,将有助于判断肿瘤的恶性程度、浸润深度及预后,为制定合理的治疗方案提供依据。P16是已知的抑癌基因中唯一通过直接抑制细胞周期而抑制细胞生长的基因,在肿瘤治疗方面有很大的应用前景。P16基因突变在人类恶性肿瘤中普遍存在,因此,有关p16基因的研究已经成为当前分子生物学和分子遗传学研究的重要课题。本文就p16基因的分子生物学特性及它与肺癌的关系作一综述。     

酿酒酵母中钙信号途径对crz1调控基因表达的影响

该文通过对酿酒酵母细胞中120个钙离子敏感性基因的启动子进行序列分析发现,24个基因的启动子上含有转录因子Crz1的结合位点(GNG GC[T/G]CA或GNG GCT G)。该研究检测了钙信号途径对24个基因表达和细胞定位的影响。实验结果表明,钙信号途径通过转录因子Crz1诱导19个基因的特异性表达及其编码蛋白的细胞定位。结果发现,5个基因的功能与代谢相关(TPS1、PHO86、ERG3、ARG82和AKR1)、5个基因的功能与离子稳态相关(CSG2、PMC1、VMA10、MNR2和VAM2)、4个基因的功能与蛋白质分选相关(PEP3、VPS36、VPS27和VPS4)以及5个基因的功能与转录相关(DEP1、IMP2′、THP1、SGF29和ROX3)。该文的研究结果为研究酿酒酵母细胞中钙离子稳态调控机制提供了理论基础。     

白念珠菌CaPPE1的克隆及其在酿酒酵母形态发生中的功能研究

白念珠菌的致病性与其形态转变相关,白念珠菌的形态转换受各种外界信号和细胞内信号转导途径的调控.转录因子Flo8在酿酒酵母形态发生中起重要作用,我们将白念珠菌基因组文库导入flo8缺失株中,筛选能够校正flo8缺失株侵入生长缺陷的基因,分离得到一个与酿酒酵母蛋白磷酸酯酶甲基酯酶PPE1同源的基因,命名为CaPPE1.CaPPE1的基因编码区全长1083bp,推测编码一个361氨基酸的蛋白.在单倍体酿酒酵母中,CaPPE1基因的表达可以部分回复flo8缺失株的侵入生长缺陷,但是在MAPK途径缺失株中不能进行侵入生长.在双倍体酿酒酵母中,CaPPE1基因的表达可以部分激活MAPK途径成员缺失株的菌丝生长缺陷,但却只能在flo8缺失株中产生微弱的激活作用.结果表明CaPpe1在酿酒酵母的假菌丝生长和侵入生长中参与的信号转导途径不同.     

白念珠菌SIM1基因敲除与功能研究

目的构建白念珠菌SIM1基因缺失菌,初步考察SIM1基因的功能。方法采用同源重组的方法构建SIM1基因双臂缺失菌,通过测定生长曲线、菌丝诱导、黏附上皮细胞等实验考察SIM1基因缺失菌表型。结果成功构建SIM1基因缺失菌,SIM1基因缺失后没有显著影响白念珠菌生长繁殖、菌丝及被膜形成,但白念珠菌对Caco-2细胞和KB细胞的黏附能力显著下降,对部分药物的敏感性增加。结论白念珠菌SIM1基因缺失导致细胞壁成分改变,并影响白念珠菌对宿主的黏附。     

碱性pH条件下白念珠菌钙离子通道CCH1和MID1基因对钙内流的影响及Crz1p转录因子对其的调控作用

白念珠菌Candida albicans对环境pH的适应能力与其致病性有密切关系,钙信号转导途径介导许多环境压力的应答并伴随胞内钙离子浓度的瞬间变化。通过构建钙通道基因CCH1和MID1的缺失突变株,在碱性pH条件下,研究其对胞内钙内流的影响以及转录因子Crz1p对CCH1和MID1基因的调控作用。使用二步法PCR介导的基因敲除技术构建cch1Δ/Δ和mid1Δ/Δ突变菌株,利用流式细胞术比较野生型和突变型菌株在碱性pH条件刺激下胞内钙的瞬间变化,进一步构建pPHO89-LacZ重组质粒并利用β-半乳糖苷     

p16^INK4失活与肿瘤的发生

p16~(INK4)位于人类染色体9p2.1,其编码的蛋白为细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4)的抑制因子,直接调控细胞增殖周期。至今已在许多肿瘤发现有p16~(INK4)的缺失或失活,p16~(INK4)是一种多肿瘤抑制基因(Munltiple Tumor Sup-pressor Ⅰ,MTS_1),在不少肿瘤中其缺失或失活高达80％,是一种可以与p53基因相匹敌的肿瘤抑制基因。     

抑癌蛋白p33(ING1)对肿瘤作用的研究进展

p33(ING1)是生长抑制基因(ING1)编码的重要抑癌蛋白,具有抑制细胞生长﹑促进细胞老化﹑维持基因组稳定性、作用于细胞周期调控点等作用,其失活与肿瘤的发生、发展密切相关。本文就近年来有关p33(ING1)的结构、功能及其在肿瘤中的失活机制、临床应用前景等方面的研究进展进行了概述。     

钙敏感受体在骨代谢中的研究进展

钙敏感受体感受细胞外的钙离子水平,调控一系列激素的释放以维持机体的钙稳态。钙稳态的调节过程与骨代谢相偶联,钙敏感受体通过直接或间接对破骨和成骨细胞的调控,动员或者抑制骨钙入血。虽然钙敏感受体已被证实调控骨代谢,但是详尽的调控机制仍在不断探究中。目前认为细胞外的高钙水平会激活钙敏感受体,抑制甲状旁腺激素分泌并促进降钙素释放,进而破骨细胞被抑制,成骨细胞动员,增加了骨质合成。本文就近年来关于钙敏感受体调控骨代谢的研究进展作一综述,为促进钙敏感受体及相关作用因子治疗骨代谢疾病的研究提供参考。     

白念珠菌CaPPEl的克隆及其在酿酒酵母形态发生中的功能研究

白念珠菌的致病性与其形态转变相关,白念珠菌的形态转换受各种外界信号和细胞内信号转导途径的调控。转录因子Flo8在酿酒酵母形态发生中起重要作用,我们将白念珠菌基因组文库导入flo8缺失株中,筛选能够校正flo8缺失株侵入生长缺陷的基因,分离得到一个与酿酒酵母蛋白磷酸酯酶甲基酯酶PPEl同源的基因,命名为CaPPEl。CaPPEl的基因编码区全长1083bp,推测编码一个361氨基酸的蛋白。在单倍体酿酒酵母中,CaPPEl基因的表达可以部分回复flo8缺失株的侵入生长缺陷,但是在MAPK途径缺失株中不能进行侵入生长。在双倍体酿酒酵母中,CaPPEl基因的表达可以部分激活MAPK途径成员缺失株的菌丝生长缺陷,但却只能在flo8缺失株中产生微弱的激活作用。结果表明CaPpel在酿酒酵母的假菌丝生长和侵入生长中参与的信号转导途径不同。     

白念珠菌CaCSC1基因的敲除和功能研究

目的构建白念珠菌CaCSC1基因的基因缺失株,并初步探究它的功能。方法设计长引物,通过PCR直接扩增出带有SAT1flipper的CaCSC1基因敲除盒,转化到野生型白念珠菌菌株CAI4,并通过PCR鉴定出基因型正确的转化子,得到CaCSC1的基因缺失株。最后,通过倍比稀释的方法进行表型筛选。结果成功得到CaCSC1基因的缺失菌株。基因缺失菌株对酮康唑(Ketoconazole)敏感,对Zn2+、Mn2+和荧光增白剂(Calcofluor white)表现出耐受性。结论 CaCsc1蛋白参与对锌离子和锰离子的稳态调控,和细胞膜和细胞壁的完整性也相关。     

酿酒酵母细胞基因组中与转录因子Rim101亚细胞定位相关的磷酸酶和激酶基因的筛选

Rim101是一个具有锌指结构的转录因子,在调控酿酒酵母细胞耐受碱性和高盐环境、钙离子稳态、细胞分裂以及硒毒性方面起作用。前人研究结果显示,细胞周期依赖性激酶基因PHO85的缺失,导致Rim101蛋白在细胞核内积累。为了探索Rim101亚细胞定位的新调节因子,通过荧光显微镜技术对酿酒酵母细胞基因组中编码磷酸酶的73个非必需基因缺失株和编码激酶的139个非必需基因缺失株进行了筛选,发现编码磷脂酰肌醇磷酸(Ptd Ins P)的磷酸酶Sac1调控Rim101的亚细胞定位。     

白色念珠菌CaBEM1基因的克隆及其在酿酒酵母丝状生长中的作用

白色念珠菌在不同的生长条件下能发生显著的形态变化 ,这种变化由多种调控因子与信号转导途径所调控。酿酒酵母的G1期细胞周期蛋白Cln1和Cln2参与其形态发生 ,cln1/cln1、cln2 /cln2双缺失株不能形成菌丝。把白色念珠菌基因组文库导入cln1/cln1、cln2 /cln2缺失株 ,筛选能校正菌丝形成缺陷的基因 ,分离得到白色念珠菌中的CaBEM 1基因。从核苷酸序列推导 ,CaBEM1编码一种 6 32个氨基酸的蛋白质 ,氨基酸序列分析表明在其N端有 2个SH3结构域 ,中部有 1个PX结构域 ,C端有 1个PB1结构域 ;CaBem1的氨基酸序列与酿酒酵母的Bem1同源性达 38% ,与裂殖酵母的Scd2同源性达 32 %。在酿酒酵母的缺失株中异源表达CaBEM1,能够部分校正它们在氮源缺乏条件下的菌丝形成缺陷。这种菌丝形成的校正作用绕过MAPK途径和cAMP/PKA途径 ,表明CaBem1在菌丝形成中的作用可能位于这两条信号转导途径的下游