模拟微重力诱导的细胞微丝变化影响COL1A1启动子活性

细胞骨架系统是细胞内的重力感受系统。已知微重力导致的细胞形态、功能、信号传导等多种变化均与细胞骨架系统变化有关,但微重力对相关基因调控的影响知之甚少。本研究以构建的基因工程细胞株（EGFP-ROS）为对象,以回转器模拟微重力效应,利用增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein,EGFP）荧光半定量和细胞微丝荧光染色分析技术,探讨回转模拟微重力条件下,细胞微丝系统对Ⅰ型胶原α1链基因（collagen type Ialpha chain 1 gene,COL1A1）启动子活性的影响。空间飞行和回转模拟微重力后,细胞微丝解聚、张力纤维减少,表明微重力可降低细胞微丝结构的有序性,诱导细胞骨架重排。适合剂量的细胞松弛素B处理EGFP-ROS细胞诱导微丝骨架解聚,同时导致COL1A1启动子活性增加,细胞荧光强度增强,并呈现剂量依赖性。因此,一定程度的细胞微丝系统破坏将导致COL1A1启动子活性的增强,证明细胞微丝骨架系统参与了微重力对COL1A1启动子活性调节,且在微重力信号传导中起重要作用。     

Surfactin对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡及细胞骨架的影响

以体外培养的人乳腺癌细胞株MCF-7为研究对象,探讨surfactin对肿瘤细胞增殖、凋亡及细胞骨架的影响。MTT实验表明,surfactin能抑制MCF-7的增殖,并且呈现出浓度和时间的依赖关系,作用48h时的IC50是27.3μmol/L。AO/EB荧光染色法及流式细胞术检测发现,surfactin可诱导MCF-7发生典型的凋亡形态学改变和G2/M期阻滞。免疫荧光和免疫印迹结果表明,surfactin显著抑制了细胞内vimentin的表达,诱导了α-tubulin的解聚和重排,使细胞的骨架系统发生了剧烈的变化。可见,surfactin具有抑制MCF-7细胞增殖,诱导细胞凋亡的作用,其机制可能与细胞骨架蛋白的表达水平有关。     

新型鬼臼毒素衍生物诱导人肺腺癌A549细胞凋亡及其机制研究

目的探讨新型鬼臼毒素衍生物10Ⅲg诱导人肺腺癌细胞A549细胞凋亡及其调控机制。方法采用四甲基偶氮唑蓝（MTr）比色法、流式细胞术测定细胞周期细胞凋亡率,DNA琼脂糖凝胶电泳和微管蛋白组化染色,Western印迹法检测凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表达。结果新型鬼臼毒素衍生物10m。对A549细胞增殖具有明显的剂量和时间依赖性抑制作用,细胞周期分析显示S期细胞数明显增多,出现G2／M期阻滞;10Ⅲg作用48h后DNA电泳可见明显的梯状条带;10Ⅲg能破坏A549细胞的细胞骨架,与依托泊苷相比有明显促进微管解聚现象;10Ⅲg浓度为10^-6mol/L时能显著促进Bax、Caspase-3蛋白的表达。结论新型鬼臼毒素衍生物10Ⅲg通过诱导A549细胞发生G2／M期阻滞而抑制其增殖,其机制可能与抑制细胞微管解聚及诱导细胞凋亡有关。     

p38信号通路参与LPS诱导的Raw264.7细胞骨架重构

应用免疫荧光标记、基因转染等方法,观察脂多糖（LPS）刺激对单核细胞系Raw264.7细胞骨架的影响,探讨p38家族不同亚型对LPS诱导的细胞骨架蛋白微管蛋白与肌动蛋白变化的调控作用结果显示,未受LPS刺激的细胞富含微管蛋白,微管蛋白交联形成辐射状的交联丝网,丝网在细胞中分布均匀;LPS刺激后,微管蛋白募集在细胞膜、核膜周围;p38α、p38β、p38γ亚型的特异性抑制剂FHPI对LPS诱导的微管蛋白募集无影响,而p38无活性突变体p38δ(AF)的基因转染,可抑制LPS诱导的细胞骨架微管蛋白的募集;肌动蛋白在静息的细胞内主要存在于细胞膜周围,LPS作用后,肌动蛋白在细胞中形成广泛分布的辐射状应激纤维;p38上游激酶活性诱变体MKK6b基因转染可诱导Raw细胞形成类似的应激纤维,而p38γ(AF)的基因转染,可抑制LPS诱导的细胞应激纤维的形成.上述结果表明,p38δ可能参与了LPS诱导的微管蛋白的重构;而LPS诱导Raw细胞应激纤维的形成,可能是通过p38γ蛋白激酶而发挥作用.     

P38在LPS诱导大鼠雪旺氏(Schwann) 细胞TNF-α表达中的作用

应用免疫荧光标记、基因转染等方法,观察脂多糖（LPS）刺激对单核细胞系Raw264.7细胞骨架的影响,探讨p38家族不同亚型对LPS诱导的细胞骨架蛋白微管蛋白与肌动蛋白变化的调控作用结果显示,未受LPS刺激的细胞富含微管蛋白,微管蛋白交联形成辐射状的交联丝网,丝网在细胞中分布均匀;LPS刺激后,微管蛋白募集在细胞膜、核膜周围;p38α、p38β、p38γ亚型的特异性抑制剂FHPI对LPS诱导的微管蛋白募集无影响,而p38无活性突变体p38δ(AF)的基因转染,可抑制LPS诱导的细胞骨架微管蛋白的募集;肌动蛋白在静息的细胞内主要存在于细胞膜周围,LPS作用后,肌动蛋白在细胞中形成广泛分布的辐射状应激纤维;p38上游激酶活性诱变体MKK6b基因转染可诱导Raw细胞形成类似的应激纤维,而p38γ(AF)的基因转染,可抑制LPS诱导的细胞应激纤维的形成.上述结果表明,p38δ可能参与了LPS诱导的微管蛋白的重构;而LPS诱导Raw细胞应激纤维的形成,可能是通过p38γ蛋白激酶而发挥作用.     

Leukamenin E诱导人宫颈癌HeLa细胞胞质骨架重排和迁移抑制的研究

为了探索对映-贝壳杉烷二萜leukamenin E对细胞骨架和细胞迁移的影响,该文采用MTT法、吉姆萨染色、流式细胞术及免疫荧光技术研究了leukamenin E诱导HeLa细胞的3种胞质骨架重排,细胞迁移抑制及可能的作用机制.结果 显示,0.4～1.0μmol/L的leukamenin E可导致G1期阻滞,抑制细胞增...     

丁酸钠对人胃癌和食道癌细胞的生物学效应

5mM丁酸钠可使人胃癌MGc803细胞形态发生改变,细胞变长,出现胞浆突起,趋向于成纤维细胞形态的变化,使食道癌ECa109细胞的核/质比下降。同时能抑制细胞增殖,使细胞生长率下降,丁酸钠对细胞增殖的抑制作用是随其浓度的增加而增强的,具有剂量依赖关系。丁酸钠可促进人胃癌MGc803细胞胞质中微管和食道癌ECa109细胞内中等纤维的组装,这种变化对丁酸钠处理后细胞形态的改变有关。丁酸钠可使细胞阻断于G_1期。??对3’,5’-cAMP—PDE(cAMP-磷酸二酯酶)活力具有强的抑制作用,并提高细胞内cAMP水平,从而抑制细胞增殖。这些结果表明丁酸钠对人胃癌MGc803和食道癌ECa109细胞具有一定的诱导分化作用。     

肺炎链球菌触发人肺Ⅱ型上皮细胞F-actin细胞骨架重排与TPK信号转导的相关性研究

目的:通过体外实验,研究Streptococcus pneumoniae(S.pn)是否通过肺Ⅱ型上皮细胞(A549)酪氨酸蛋白激酶(TPK)信号转导途径触发微丝肌动蛋白(Filamentous actin,F-actin)细胞骨架重排,进而导致S.pn对A549细胞的侵袭.方法:采用F-actin特异性FITC-phalloidin荧光染料,观察S.pn作用A549细胞前后的F-actin细胞骨架重排情况,依照重排百分率得分标准以(%)表示;用F-actin细胞骨架重排抑制剂细胞松驰素D预处理A549细胞,观察S.pn对A549细胞的侵袭率;使用TPK信号转导抑制剂Genistein预处理A549细胞,观察其与F-actin细胞骨架重排百分率间是否存在剂量依赖关系.结果:S.pn作用A549细胞后,经FITC-phalloidin荧光染色,F-actin细胞骨架呈块状、丝状聚集;F-actin细胞骨架重排抑制剂细胞松驰素D可明显降低S.pn对A549细胞的侵袭率,在其浓度为0.25μg/ml时,未得到可测的细菌数;TPK信号转导途径抑制剂可部分抑制A549细胞F-actin细胞骨架重排,并与F-actin细胞骨架重排百分率间存在量效关系,其相关系数分别为rTpK=-0.91(P＜0.05).结论:上述结果提示S.pn可通过TPK细胞信号转导途径触发A549细胞F-actin细胞骨架重排,进而导致S.pn侵袭A549细胞.     

稳定转染NOR1抑制5-8F细胞片状伪足形成和Wnt信号通路

细胞骨架是真核细胞中的蛋白纤维网络结构,不仅与保持细胞形态结构有关,而且影响细胞黏附和细胞运动．NOR1是从鼻咽癌中克隆得到的新基因,在鼻咽癌组织和细胞系中表达下调．本研究建立了NOR1稳定表达的鼻咽癌5-8F细胞系．过表达NOR1引起高转移性鼻咽癌5-8F细胞形态改变,抑制片状伪足形成、细胞表面积缩小、细胞聚集性增强．扫描电镜检测发现,NOR1抑制了5-8F细胞膜微绒毛的数量,引起细胞膜表面改变．细胞骨架染色发现,NOR1过表达导致5-8F细胞actin骨架连续性破坏,应力纤维增加．Realtime RT-PCR检测发现,NOR1引起5-8F细胞Wnt/β-catenin信号通路分子Wnt5A受体FZD5、FZD7表达下调,抑制了β-catenin蛋白入核．提示NOR1抑制Wnt/β-catenin信号通路激活,破坏细胞骨架连续性,抑制细胞膜微绒毛与伪足形成．     

靶向微管抗肿瘤药物研究进展

微管由微管蛋白组成,在细胞分裂、细胞内物质运输、信号传递、维持细胞形态等过程中起着重要作用.一些干扰微管功能的化合物可使细胞停滞在有丝分裂期而抑制细胞增殖.相对于正常细胞,肿瘤细胞有丝分裂异常频繁,以微管作为抗肿瘤的靶点已成为研究热点.作用于微管的微管蛋白抑制剂通过抑制微管蛋白的聚合促进微管解聚或者抑制微管解聚促进微管蛋白聚合来破坏微管动态平衡、干扰肿瘤细胞纺锤体形成、阻断细胞分裂、抑制肿瘤增殖,现就微管蛋白抑制剂的研究进展作一综述.     

竹红菌甲素对体外培养细胞光敏作用的实验研究

本文用免疫荧光细胞化学、流式荧光分析等方法研究了光敏剂H_A对培养的HeLa细胞的光敏化作用。结果表明,H_A光敏化作用使细胞形态发生变化,细胞表面微绒毛丧失,细胞增殖受到抑制,上述变化随光照剂量增加而加剧,其中对肿瘤细胞的抑制作用较正常二倍体细胞更大,细胞群体中G_1期细胞下降,S期细胞增多。H_A的光敏化作用还使胞质微管变稀疏,微管中心的亮荧光近乎消失。以上实验说明,H_A的光敏作用对培养细胞的作用引起细胞膜、细胞骨架的损伤,使细胞周期部分阻断于S期,从而抑制了细胞的增殖。     

钙信号转导途径介导肺炎链球菌侵袭人肺Ⅱ型上皮细胞

用Factin 特异性FITCphalloidin荧光染料,观察肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）作用A549细胞前后的Factin细胞骨架重排情况;用细胞松弛素D预处理A49细胞,观察肺炎链球菌对A549细胞的侵袭率;使用Datrolene预处理A549细胞,观察其与Factin细胞骨架重排百分率间是否存在剂量依赖关系;用Fura2/AM荧光探针负载A549细胞后测定肺炎链球菌粘附A549细胞后的胞内Ca2+浓度。结果发现肺炎链球菌作用A549细胞后,Factin细胞骨架呈块状、丝状聚集;而松弛素D可明显降低肺炎链球菌对A549细胞的侵袭率;肺炎链球菌粘附A549细胞后胞内Ca2+高于对照;Datrolene可部分抑制A549细胞Factin细胞骨架重排,且与Factin细胞骨架重排百分率间存在量效关系。以上结果提示肺炎链球菌可通过Ca2+细胞信号转导途径触发A549细胞Factin细胞骨架重排,进而导致肺炎链球菌侵袭A549细胞。     

RhoA蛋白和cAMP对人前列腺癌细胞株PC-3形态的影响(简报)

小G蛋白RhoA是细胞内信号转导的重要成分,参与对细胞的多种功能活动的调控。溶血磷脂酸(lysophosphatidicacid,LPA)与多种细胞的G蛋白偶连受体结合而发挥作用,除刺激细胞增殖外,还通过活化RhoA,诱导细胞骨架改变。cAMP是经典的第二信使,其下游激酶PKA可抑制RhoA活性,因此,cAMP在许多细胞活动中对RhoA有拮抗作用。本实验采用人前列腺癌细胞株PC-3,以绿色荧光蛋白(GreenFluorescentProtein,GFP)分别和不同RhoA结构(野生型RhoA、RhoA63L和RhoA188A)的cDNA共同转染细胞,在显微镜下(200倍视野)观察记录未转染细胞和转染细胞在LPA和cAMP作用下的形态变化,研究RhoA和cAMP/PKA介导的信号转导在调控癌细胞形态改变中的作用。     

肺炎链球菌触发肺Ⅱ型上皮细胞F-actin细胞骨架重排

目的：通过体外实验,研究肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae,S.pn)是否可触发肺Ⅱ型上皮细胞（A549）信号转导途径触发微丝肌动蛋白（filamentous actin,F-actin)细胞骨架重排,进而侵袭A549细胞,并初步分析触发A549细胞F-actin细胞骨架重排的细菌亚组分。方法：采用F-actin特异性FITC-phalloidin荧光染料,观察S.pn作用A549细胞前后的F-actin细胞骨架重排情况,依照重排百分率得分标准以（%）表示;用F-actin细胞骨架重排抑制剂细胞松弛素D预处理A549细胞,观察S.pn对A549细胞侵袭的改变情况;用变溶菌素提取S.pn细胞壁以观察其对F-actin细胞骨架重排的影响。结果：S.pn作用A549细胞后,经FITC-phalloidin荧光染色,F-actin细胞骨架呈黄绿色块状聚集,对照细胞呈现均匀黄绿色荧光外观;F-actin细胞骨架重排抑制剂细胞松弛素D可明显降低S.pn对A549细胞的侵袭,在其浓度为0.25μg/ml时,未得到可测的细菌数;S.pn细胞壁作用A549细胞后,经FITC-phalloidn荧光染色,F-actin细胞骨架呈黄绿色块状聚集,二者存在剂量依赖性。结论：S.pn及其细胞壁亚组分可触发A549细胞F-actin细胞骨架重排,进而侵袭A549细胞。     

野艾蒿挥发油对HeLa癌细胞形态与结构的影响

采用MTT法检测细胞活力,用倒置显微镜、荧光显微镜和扫描电子显微镜观察细胞形态与结构的变化,用激光共聚焦显微镜观察细胞微管的分布,从而研究了野艾蒿挥发油对HeLa人宫颈癌细胞形态与结构的影响。结果表明:(1)野艾蒿挥发油对HeLa癌细胞的增殖有明显的抑制作用,呈剂量和时间依赖性。(2)野艾蒿挥发油处理HeLa癌细胞24h后,100、200μg/mL实验组细胞体积缩小,核染色质凝集、微绒毛消失、细胞表面有泡状突起,微管解聚,呈现典型的凋亡特征;400μg/mL实验组细胞膜破裂、胞浆内含物外泄,呈明显的坏死特征。(3)野艾蒿挥发油具有抑制HeLa癌细胞增殖的作用,低、中浓度的野艾蒿挥发油诱导细胞凋亡,而高浓度的野艾蒿挥发油引起细胞坏死。     

钙调蛋白结合蛋白通过调节细胞骨架稳定性影响肿瘤细胞运动能力

轻链钙调蛋白结合蛋白（light-chain Caldesmon,l-CaD）是一种重要的肌动蛋白结合蛋白,普遍存在于众多非肌肉细胞中。体外研究证明,l-CaD能通过与肌动蛋白的结合起到促进原肌动蛋白（G-actin）聚合、稳定肌动蛋白纤维（F-actin）结构的作用。在磷酸化作用下,l-CaD能从肌动蛋白纤维上脱离并促进肌动蛋白纤维的解聚。该研究拟考察l-CaD在细胞内对细胞肌动蛋白骨架的调节作用,阐明l-CaD对细胞运动能力的影响,作者将天然低表达l-CaD的人源性乳腺癌细胞MCF-7作为细胞模型,在MCF-7胞内以基因转染的方式高表达外源野生型l-CaD及其磷酸化突变株A1234-CaD（不可磷酸化CaD）、D1234-CaD（完全磷酸化CaD）。首先,通过激光共聚焦扫描,探讨了l-CaD对细胞骨架重排的调节;其次,通过细胞迁移transwell阵列,检测了l-CaD对细胞迁移能力的影响;最后,在单细胞层次上测定了细胞基底牵张力、胰酶刺激下的细胞基底脱附能力,并进一步检测了l-CaD对细胞迁移子过程中细胞伸张、收缩的影响。研究结果显示,l-CaD在胞内对细胞骨架的形成有显著的调控作用。非磷酸化l-CaD主要富集在细胞骨架上,增强了细胞骨架的强度,导致细胞基底牵张力以及对胰酶的耐受性增强,但对细胞的迁移能力有显著的抑制作用;磷酸化l-CaD跟细胞骨架结合能力很弱,对细胞的运动能力没有显著影响。通过磷酸化,l-CaD起到了一个“蛋白开关”的作用,通过控制细胞骨架的解聚、重排来调节细胞的运动能力。     

Dnd1的蛋白亚细胞定位及其对HeLa细胞增殖的抑制作用

小鼠睾丸生殖细胞瘤易感基因Dnd1编码的蛋白是一个在进化中保守的RNA结合蛋白.为探讨小鼠Dnd1的蛋白亚细胞定位和对细胞增殖的影响及其机制, 利用生物信息学技术, 采用组合的亚细胞定位分析软件对Dnd1进行真核生物亚细胞定位预测; 利用融合绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)定位的方法, 通过构建pEGFP-Dnd1重组质粒, 将重组质粒pEGFP-Dnd1转染HeLa细胞和GC-1细胞, 在荧光显微镜下观察Dnd1的蛋白亚细胞定位; 用MTT法和流式细胞技术测定Dnd1过表达对HeLa细胞的增殖能力的影响和细胞周期的改变; 在HeLa细胞系中检测Dnd1对AP-1转录活性的影响. 结果表明: ① 生物信息学预测Dnd1主要在细胞核表达, 在细胞质中也有少量表达; 荧光显微镜下观察发现,Dnd1蛋白主要定位在细胞核, 在细胞质中也有少量分布; ② Dnd1基因在HeLa细胞系中的过表达抑制细胞增殖和诱导细胞周期G1期阻滞;③ Dnd1抑制AP-1的转录活性,从而抑制AP-1介导的转录是Dnd1抑制细胞增殖的可能机制.本研究初步明确了Dnd1的蛋白亚细胞定位及其对HeLa细胞的生长抑制作用, 这为进一步研究Dnd1基因的功能建立基础.     

原核生物微管蛋白家族研究进展

自从1992年确定细菌分裂的关键蛋白Fts Z属于微管蛋白家族以来,越来越多的细菌细胞骨架蛋白被发现。原核生物中的微管同源蛋白主要有Fts Z、Cet Z、Tub Z和Btub A/B等。它们与微管蛋白具有相似的三级结构,可以结合鸟嘌呤-5′-三磷酸(Guanosine triphosphate,GTP)自聚合成不同的线状原丝纤维结构:单线状原丝纤维、双螺旋纤维结构或聚集成束状结构,在细菌细胞分裂、维持细胞形态、质粒分离等诸多重要生理功能中起着重要作用。     

溴化乙锭诱导无线粒体DNA宫颈癌HeLa细胞系的构建和鉴定

[目的]构建和鉴定由溴化乙锭(EB)诱导的无线粒体DNA(mtDNA)宫颈癌ρ~0HeLa细胞系,探讨mtDNA与宫颈癌发生的关系。[方法]采用含50ng/ml溴化乙锭、100μg/ml丙酮酸钠和50μg/ml尿嘧啶核苷的高糖DMEM完全培养基中传代培养HeLa细胞。低剂量EB连续诱导60d后,采用营养缺陷鉴定、PCR和WesternBlot鉴定无mtDNA的ρ~0HeLa细胞系;采用透射电子显微镜观察ρ~0HeLa细胞内线粒体形态变化;采用CCK8法测定ρ~0HeLa细胞增殖曲线。[结果]经溴化乙锭诱导60d,可以培养出具有尿嘧啶核苷依赖性的无mtDNA宫颈癌HeLa细胞系。普通PCR和qPCR结果均显示,低剂量EB诱导60d的ρ~0HeLa细胞中mtDNA完全缺失。WesternBlot结果显示,HeLa细胞中能表达核编码的NDUFA9蛋白,也能表达线粒体编码MT-ND1蛋白。而ρ~0HeLa细胞中已无MT-ND1蛋白表达,但核编码的NDUFA9蛋白能够正常表达。透射电子显微镜观察显示,ρ~0HeLa细胞内部分出现空泡改变,线粒体嵴被破坏。CCK8细胞增殖实验结果显示,ρ~0HeLa细胞系生长速度显著低于正常HeLa细胞系,且差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]无mtDNA的宫颈癌HeLa细胞系的建立,为后续研究mtDNA突变和线粒体功能在宫颈癌发生发展中的作用及机制奠定了基础。     

钙调素抑制剂——三氟拉嗪对肿瘤细胞增殖和微管组装的影响

本文用钙调素抑制剂——三氟拉嗪处理人胃癌MGC-803细胞,用免疫荧光细胞化学方法,放射免疫法和速流荧光分析等方法研究了钙调素对细胞增殖,环核苷酸代谢及微管组装,有丝分裂等细胞功能的调节作用。实验结果表明,TFP明显地抑制了人胃癌细胞的增殖,这种抑制增殖的作用,具有剂量和时间依赖关系,细胞群体中G_1期细胞增多,S期细胞下降,DNA合成明显地受到抑制。TFP处理的胃癌细胞仅在短时间内(5'-30')cAMP含量升高,cGMP浓度降低,cAMP/ ??cGMP比值比对照组高4.4倍,但此后环核苷酸含量又很快恢复到对照组水平。本实验还观察到TFP处理后的MGC-803细胞胞质铺展,细胞形态的改变与胞质微管的分布有密切联系,实验结果表明TFP加强了人胃癌细胞MTOC对微管的组装能力,使微管分布得到恢复,微管纤维呈放射状延伸到细胞边缘,充满胞浆,使细胞呈现出展平的多边形,趋向于正常上皮细胞形态的变化,本实验结果表明TFP抑制癌细胞增殖及使微管组装加强可能是通过对CaM活性的抑制作用。此结果有助于说明转化细胞内钙调素的变化,可能是与转化细胞增殖失控和胞质微管消退有关。