利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建CDH1基因敲除的人乳腺癌MCF-7稳定细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建CDH1基因缺失的人乳腺癌MCF-7稳定细胞系。方法:根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计能特异性针对CDH1基因的sgRNA,以lentiCRISPR v2质粒为骨架构建能表达此sgRNA和Cas9蛋白的重组质粒。测序鉴定后,将重组质粒与逆转录病毒包装质粒VSVG、PAX2在氯化钙介导下共同转入HEK293T细胞进行病毒包装,转染48 h后收集病毒上清,直接感染人乳腺癌MCF-7细胞。采用嘌呤霉素筛选CDH1缺失的乳腺癌MCF-7细胞,通过DNA测序、Western印迹及免疫荧光染色实验验证获得的MCF-7细胞。结果:构建了靶向CDH1的CRISPR/Cas9质粒;DNA测序和Western印迹实验结果表明获得了稳定敲除CDH1的人乳腺癌MCF-7细胞。免疫荧光染色结果显示,相比对照组,稳定敲除CDH1的MCF-7细胞中已无法明显观察到E-钙黏蛋白的表达分布。结论:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了CDH1基因缺失的MCF7细胞系,为进一步研究CDH1在肿瘤免疫治疗中的作用提供了基础。     

敲除ESR1基因对人乳腺癌细胞侵袭能力的影响

目的:建立CRISPR/Cas9系统用于敲除人源雌激素受体α(ERα)基因(ESR1),并利用此细胞模型初步检测ESR1基因对乳腺癌细胞侵袭能力的影响。方法:设计一个靶向人源ESR1基因第2外显子的单向导RNA(sg RNA),分别克隆表达载体后,通过慢病毒转入人乳腺癌细胞株MCF-7,Western印迹检测MCF-7中ESR1基因的敲除效果,通过Transwell、反向侵袭试验观察ESR1基因敲除后对细胞侵袭能力的影响。结果:测序结果显示靶向ESR1基因CRISPR/Cas9重组质粒构建成功;Western印迹显示Cas9-ERα组的MCF-7细胞内ERα表达水平较对照组显著降低;Tanswell、反向侵袭试验证实ESR1基因敲除能够促进乳腺癌细胞的侵袭能力。结论:通过CRISPR/Cas9系统获得了靶向ESR1基因的重组质粒,构建的重组质粒能有效敲除ESR1基因;ERα能够抑制乳腺癌细胞的侵袭能力。     

应用CRISPR/Cas9系统构建MTHFD1基因敲除的HEK-293细胞系

目的:利用成簇的、规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建亚甲基四氢叶酸脱氢酶1(methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 1, MTHFD1))基因敲除人胚肾(HEK-293)稳定细胞系。方法:利用在线软件筛选出评分最高的3条针对MTHFD1基因的单向导RNA (sg RNA),然后合成sg RNA序列并将其插入到含有GFP标签的质粒中;重组质粒转染HEK-293细胞后通过流式细胞仪分选出已被转入sg RNA的单细胞,通过测序确认单克隆细胞系中MTHFD1的DNA序列突变状态;最后应用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(real-time quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-q PCR)和蛋白质印迹(Western blot)方法检测单克隆细胞中MTHFD1的m RNA和蛋白表达水平。结果:重组载体中含有正确的sg RNA序列;测序结果显示该细胞系中MTHFD1基因发生了单个碱基插入突变和6个碱基的缺失突变;RT-qPCR结果显示单克隆细胞系中MTHFD1在m RNA水平显著降低;Western blot检测成功构建MTHFD1蛋白缺失的HEK-293细胞。结论:本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建的MTHFD1敲除HEK-293细胞系。     

基于CRISPR/Cas9基因编辑系统构建敲除TSPAN4基因的非小细胞肺癌细胞系

利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除TSPAN4基因,构建TSPAN4基因稳定敲除的非小细胞肺癌A549细胞株,并检测其对A549细胞迁移、侵袭能力的影响,为后期探讨迁移体在非小细胞肺癌转移过程中的作用提供实验基础。以质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro(px459)为载体,与设计好的引物连接后得到敲除载体px459-sgRNA-TSPAN4。以jetPRIME?为转染试剂,将构建好的质粒转染至A549细胞系,嘌呤霉素筛选单克隆细胞株并使用Western blot实验鉴定A549细胞系中TSPAN4基因的敲除效果,细胞划痕实验和Transwell实验检测敲除TSPAN4基因对A549细胞迁移、侵袭能力的影响。该研究成功构建了TSPAN4基因编辑质粒px459-sgRNA-TSPAN4。Western blot结果显示敲除TSPAN4基因能够显著降低A549细胞株中TSPAN4蛋白表达量;敲除TSPAN4基因对A549细胞迁移、侵袭能力的影响在统计学上无显著性差异,降低了N-cadherin的表达,对E-cadherin表达的影响不大。以上研究表明,使用CRISPR/Cas9...     

利用CRISPR/Cas9n系统敲除人源SNF5基因

目的:建立敲除人源基因组中SNF5基因的CRISPR/Cas9n系统。方法:设计一对靶向人源SNF5基因第1个外显子的sg RNA,分别克隆至p X461、p X462表达载体后,转入人胚肾293T细胞,通过Western印迹检测细胞株中SNF5基因的敲除效果。结果:测序证明构建的靶向SNF5基因CRISPR/Cas9n重组质粒与设计吻合。Western印迹结果显示,重组质粒p X461-h SNF5sg RNA转染293T细胞后24 h,细胞内SNF5表达水平明显降低;重组质粒p X462-h SNF5sg RNA转染293T细胞后48 h,细胞内SNF5表达水平显著降低。结论:通过CRISPR/Cas9n系统获得了靶向SNF5基因的重组质粒,构建的重组质粒能有效敲除SNF5基因的表达。     

基于CRISPR/Cas9系统的人成神经瘤SK-N-SH细胞CAPNS1基因的靶向敲除

利用CRISPR/Cas9技术靶向构建CAPNS1基因敲除人成神经瘤细胞SK-N-SH细胞系。在NCBI数据库查找人CAPNS1基因,获得该基因CDS区,根据CRISPR/Cas9敲除靶位点设计原则即g RNA设计原则,设计3条sg RNAs,以p GK1.1为载体,构建人CAPNS1基因敲除载体,并运用共转染的方法转染到SK-N-SH细胞,构建CAPNS1基因敲除SK-N-SH细胞系。结果发现,菌落PCR筛选均能扩增出100 bp大小的片段,单克隆为阳性,DNA测序显示sg RNA序列正确插入质粒,序列比对结果正确;质粒转染SK-N-SH细胞后,制备单克隆,CruiserTMEnzyme酶切后疑似为阳性克隆,进一步的单克隆测序结果显示CAPNS1基因敲除SK-N-SH细胞系构建成功;此外,在CAPNS1-/-组,CAPNS1蛋白及calpain1和calpain2蛋白水平明显降低。以上结果表明CAPNS1基因敲除SK-N-SH细胞系构建成功。     

建立CRISPR/Cas9慢病毒系统高效敲除人源AIP1基因

旨在构建AIP1基因CRISPR/Cas9敲除体系,获得高效、稳定、永久性AIP1敲除的人胚肾细胞株(293T)。针对AIP1的外显子设计3个20 bp的sg RNA(sp1、sp2和sp3)。与PX458载体连接,构建PX458-sg RNA敲除表达载体。T7E1实验评估敲除效率。将敲除效率最高的sg RNA与lenti CRISPRv2慢病毒载体连接,构建lenti CRISPRv2-sg RNA敲除表达载体,将阳性重组质粒导入病毒包装细胞293T中,收集病毒上清液转染293T细胞。对敲除成功的293T细胞通过有限稀释法构建敲除AIP1基因的稳定细胞株。Western blot测定转染后293T细胞中AIP1蛋白的表达量。结果显示,测序证实AIP1的3个靶序列分别正确插入PX458表达载体中,T7E1实验证实AIP1sg RNAsp2靶向敲除效率最高;成功构建lenti CRISPRv2-sg RNAsp2 AIP1敲除表达载体,并包装病毒,感染293T细胞;Western blot证实获得稳定的AIP1基因表达缺失的293T细胞株。建立了能稳定敲除AIP1基因的CRISPR/Cas9慢病毒系统,成功获得AIP1敲除的293T稳定细胞株。     

基于CRISPR/Cas9技术的GATA-1基因敲除K562细胞系的构建

GATA-1(GATA binding protein-1)在造血分化过程是最重要的转录调控因子,在红细胞和巨核细胞中特异性高表达,并通过调节相关基因的转录在红系和巨核系造血细胞的分化发育过程中发挥重要作用。该研究采用CRISPR/Cas9技术将K562细胞中的GATA-1基因敲除,建立了GATA-1基因敲除K562细胞株。首先,设计了4个CRISPR的靶向位点,利用p GL3-U6-sg RNA-PGKpuromycin质粒构建了4个导向RNA(single guide RNA,sg RNA)载体。利用电穿孔的方法将sg RNA载体与Cas9载体p ST1374-NLS-fl ag-linker-Cas9共转K562细胞。转染48 h,经定点PCR和T7EN1内切酶酶切鉴定后,采用细胞有限稀释法嘌呤霉素筛选,定点测序和Western blot检测结果显示,成功构建了GATA-1基因敲除K562细胞株,命名为K562-KO GATA-1。使用联苯胺染色和流式细胞术的方法检测血型糖蛋白A(glycophorin A,CD235a)发现,与正常K562细胞相比,K562-KO GATA-1细胞株经Hemin诱导红系分化明显受到抑制。综上,该研究建立了敲除GATA-1的K562细胞系,可用于后续的造血分化相关研究。     

利用CRISPR/Cas9技术构建CREB基因敲除细胞系并探讨CREB对APP基因表达的调控作用

环磷腺苷效应元件结合蛋白(c AMP responsive element-binding protein,CREB)是重要的核转录因子,有研究表明,在阿尔茨海默病患者中,CREB的表达降低,但CREB对于淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的作用机制尚不清楚。该研究通过设计sg RNA序列并合成相应的寡核苷酸,将其克隆到p X459质粒中,构建CREB基因敲除的CRISPR/Cas9二合一表达载体。将构建成功的载体转染到HT22细胞中,通过TA克隆测序和T7E1酶切分析来验证sg RNA的活性。将构建的载体转染到HT22细胞中,用嘌呤霉素进行药物筛选,构建稳定的CREB基因敲除的细胞系。CREB对APP基因表达的调控作用通过检测其在正常HT22细胞和CREB基因敲除的HT22细胞系中的表达情况来进行确认。结果显示,成功构建了CRISPR/Cas9技术对CREB基因进行敲除的二合一表达载体,所设计的sg RNA的插入序列和开放阅读框架完全正确,经过酶切分析和序列测定,所构建的载体与实验设计相一致。CREB基因敲除的HT22细胞系其敲除效率达到90%以上。通过Western blot分析检测CREB对APP表达的影响,结果发现,当CREB基因敲除后,APP表达增加,而过表达CREB时,则APP蛋白质表达水平下降。这提示,CREB对APP的表达有下调作用,具体的机制还将继续研究。     

基于CRISPR/Cas9技术敲除SAMHD1肝癌细胞系的构建及对增殖的影响

运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,建立SAMHD1基因敲除的Huh7细胞系,并检测敲除SAMHD1基因后对人肝癌细胞Huh7细胞增殖的影响.针对SAMHD1基因作用的功能区域,设计靶向SAMHD1的小向导sgRNA(Small Guide RNA).构建lentiCRISPRv2-SAMHDl-gRNA重组质粒转化后测序.筛选稳定敲除SAMHD1的稳定细胞系并测序鉴定.采用克隆形成实验分析基因SAMHD1敲除后肝癌细胞Huh7细胞的增殖能力.测序结果显示lentiCRISPRv2-SAMHDl-gRNA载体构建成功.Western blot结果和测序结果表明成功构建敲除SAMHD1的Huh7稳定细胞系.克隆形成实验结果表明,相对于Huh7-WT细胞,Huh7-KO SA-MHD1的细胞增殖能力增强(P＜0.01).成功构建基于CRISPR/Cas9技术敲除SAMHD1基因的Huh7细胞系,SAMHD1的表达缺失促进肝癌细胞的增殖.     

利用CRISPR/Cas9技术构建VPS34基因敲除的A549/293T细胞系

该研究利用CRISPR/Cas9策略构建敲除VPS34基因的A549/293T细胞系,并初步将其用于自噬功能研究。应用在线工具设计了针对VPS34基因的3条sgRNA,并克隆至pX459载体。将重组质粒转染A549/293T细胞,嘌呤霉素初步筛选,通过PCR后测序和Western blot技术检测发现, sgRNA-1的敲除效果最好。将转染sgRNA-1的两种细胞单克隆化, PCR测序发现,存在碱基缺失, Western blot结果显示,对应的单克隆也未检测到VPS34蛋白,可见成功获得了VPS34敲除的A549/293T细胞系。由于VPS34参与自噬起始,实验结果显示, VPS34敲除后, LC3-I向LC3-II转化显著被抑制,自噬底物P62大量累积。结果表明,该方法成功获得稳定敲除VPS34基因的A549/293T细胞系,且细胞中的自噬被显著抑制。同时,敲除VPS34能够降低人肺癌A549细胞的生长速率。该实验利用CRISPR/Cas9系统首次获得稳定敲除VPS34基因的哺乳动物细胞A549/293T细胞系,为后续自噬功能研究提供有力工具。     

利用CRISPR/Cas9技术构建大鼠L2细胞α-ENaC基因敲除稳定细胞株

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建大鼠L2细胞α-ENaC基因敲除的细胞株,研究α-ENaC基因对细胞增殖的影响。构建敲除α-ENaC基因的CRISPR/Cas9表达载体和筛选报告载体,通过转染和嘌呤霉素筛选获得单克隆细胞株,Western Blot、测序确定突变的细胞株,CCK-8检测突变细胞株的增殖活力。成功构建靶向α-ENaC基因第一外显子的CRISPR/Cas9表达载体和筛选报告载体,嘌呤霉素筛选后,挑选8个单细胞克隆中有两个单细胞克隆α-ENaC蛋白表达下降,一个单细胞克隆α-ENaC蛋白不再表达,测序结果显示3个单细胞克隆分别为2个单等位基因突变和1个双等位基因突变,且未发现脱靶现象。突变细胞株的增殖活力降低,其中双等位基因突变细胞株增殖活力降低更为显著。因此,利用CRISPR/Cas9结合SSA-RPG报告载体成功获得了α-ENaC基因敲除的L2细胞株,α-ENaC与细胞增殖有关。     

利用CRISPR/Cas9技术建立诱导性敲除MEIS1基因的HEK293T细胞株

CRISPR/Cas9是新一代基因组编辑技术,可简便快捷地在哺乳动物细胞对基因进行敲除、敲入。但常规的CRISPR/Cas9表达系统直接转染效果差、病毒包装效率低,极大地限制了CRISPR/Cas9系统的广泛使用。该研究应用Tet-on系统,建立了Dox诱导Cas9表达的293T细胞株,命名为293T-i Cas9。MEIS1(myeloid ectropic viral integration site 1)是TALE(three amino acid loop extension)同源域家族的转录因子,其在白血病发生发展、胚胎造血系统发育及神经系统发育中有重要作用,但其作用机制仍未完全明确。将靶向MEIS1 Exon3的sg MEIS1表达载体转入293T-iCas9,SURVEYOR实验和Western blot检测结果表明,sg MEIS1有效地指导Cas9进行基因组编辑。最终经测序和Western blot结果证明,成功建立了MEIS1敲除细胞株,这为研究MEIS1的功能提供了重要的工具。     

CRISPR/Cas9慢病毒系统敲除胰岛β细胞PKA C-α的研究

利用CRISPR/cas9系统建立稳定敲除PKA C-α基因的INS-1细胞株,研究PKA C-α在胰岛β细胞中的功能。设计2个长25 bp且分别靶向PKA C-α基因的exon 5和exon 7的sgRNA,将其克隆至LentiCRISPRv2-sgRNA质粒并转染至293T细胞中制备sgRNA-Cas9慢病毒,慢病毒感染INS-1细胞,嘌呤霉素筛选出阳性细胞并采用有限稀释法筛选单克隆细胞,Western blotting印记法检测单克隆细胞中PKA C-α蛋白的表达水平,测序确认单克隆细胞中PKA C-α基因的突变位点。WB实验证实靶向Exon 5的sgRNA可成功敲除PKA C-α基因,得到稳定敲除PKA C-α基因的细胞株,测序结果表明该细胞株的PKA C-α基因发生1 bp碱基插入突变,并且敲除PKA C-α基因的INS-1细胞胰岛素分泌能力下降。本实验利用CRISPR/Cas9系统成功敲除INS-1细胞中的PKA C-α基因,为研究PKA C-α在胰岛β细胞中的功能奠定了基础。     

运用CRISPR/Cas9技术敲除人源黏着斑蛋白基因

目的:建立CRISPR/Cas9n系统,用于敲除人源黏着斑蛋白(VCL)基因。方法:设计一个靶向人源VCL基因第3个外显子的单向导RNA(sgRNA),分别克隆表达载体后,通过慢病毒转入人MDA-MB-231细胞,通过PCR及Western印迹检测细胞株中VCL基因的敲除效果。结果:测序结果显示靶向VCL基因CRISPR/Cas9重组质粒构建成功;PCR产物测序结果表明本次设计的Cas9/sgRNA能够对VCL基因进行编辑敲除;Western印迹显示Cas9-VCL组的MDA-MB-231细胞内VCL表达水平较对照组显著降低。结论:通过CRISPR/Cas9系统获得了靶向VCL基因的重组质粒,构建的重组质粒能有效敲除VCL。     

利用CRISPR/Cas9技术构建FHL1基因敲除的HepG2稳定细胞株及其功能鉴定

目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除人肝癌细胞HepG2中的四个半LIM结构域蛋白1(FHL1)基因,构建FHL1基因敲除的HepG2稳定细胞株。方法:根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计特异性识别FHL1基因第三外显子相关序列的上下游小向导RNA,构建真核重组表达质粒,测序鉴定后,将重组质粒包装慢病毒感染HepG2细胞,用嘌呤霉素抗性筛选稳定敲除FHL1基因的细胞株,用免疫印迹法鉴定HepG2细胞中FHL1基因的敲除效果,利用生长曲线实验和划痕实验检测基因敲除对细胞生长和迁移的影响。结果:筛选出敲除FHL1基因的HepG2细胞株,且FHL1基因敲除显著促进细胞的增殖和迁移。结论:利用CRISPR/Cas9技术获得了内源FHL1基因敲除细胞株,初步实验提示敲除FHL1基因可以促进肝癌细胞增殖和迁移,为后续研究FHL1在肝癌中的功能奠定了基础。     

利用CRISPR/Cas9技术构建AEG-1基因敲除U251细胞系并探讨其转移行为的特点

星形胶质细胞上调基因-1(astrocyte elevated gene-1,AEG-1)在多种肿瘤中过表达,参与肿瘤的形成、转移等过程。本实验利用CRISPR/Cas9技术敲除AEG-1基因并研究其在胶质瘤细胞转移过程中的作用。首先设计构建sgRNA/Cas9二合一表达载体并转染到人胶质瘤U251细胞中,通过TA克隆测序鉴定sgRNA的活性;然后筛选建立稳定的AEG-1敲除U251细胞系,并利用Western blot实验检测AEG-1的敲除效率;最后利用Transwell小室、划痕实验评价AEG-1敲除后对肿瘤细胞迁移能力的影响。结果显示,成功构建靶向敲除AEG-1基因的sgRNA/Cas9二合一表达载体,所构建的载体与实验设计相一致,通过TA克隆测序鉴定sgRNA有活性;成功建立稳定的AEG-1敲除U251细胞系,Western blot实验结果表明敲除效率高达98%; Transwell小室实验、划痕实验结果表明AEG-1敲除U251细胞系的转移能力明显降低。     

利用CRISPR/Cas9技术构建敲除MEIS2基因的HEK293T人胚肾细胞系

CRISPR/Cas9系统作为一种新型的基因组编辑技术,利用人工设计的向导RNA(singleguide RNA,sg RNA)介导外源表达的Cas9蛋白与基因组靶点特异性结合以实现对基因组DNA的特异性切割,切割后的基因组DNA通过非同源末端连接或同源重组的方式进行修复,从而实现基因的敲除、敲入等。MEIS2属于一类高度保守的同源盒转录因子MEIS家族,研究发现,MEIS2广泛参与胚胎的早期发育及肿瘤的发生发展,但其发挥作用的机制目前还不是很清楚。该研究针对MEIS2基因作用的功能域,设计两个靶向MEIS2基因Exon3和Exon8的sg RNA,通过SURVEYOR分析及Western blot检测,确认了所设计sg RNA的有效性。进一步通过细胞分选及Western blot检测筛选出稳定敲除MEIS2基因的HEK293T细胞株。最后,通过序列测定确认MEIS2发生了移码突变。综上所述,该研究利用CRISPR/Cas9技术成功建立了完全敲除MEIS2的HEK293T细胞株,为研究MEIS2的功能和作用机制提供了有效工具。     

利用CRISPR/Cas9技术建立敲除JAK2基因K562细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9技术对K562细胞系JAK2基因进行编辑,构建JAK2基因敲除的K562细胞系。方法:使用CRISPR在线设计工具,针对JAK2基因设计sgRNA,构建Cas9-sgRNA共表达质粒。使用第二代慢病毒包装系统包装慢病毒并感染K562细胞,提取细胞基因组DNA,Sanger测序和TA克隆检测基因编辑活性。无限稀释法将编辑阳性的细胞接种于96孔板并扩培得到单克隆细胞株,提取基因组DNA,Sanger测序和TA克隆分析敲除JAK2单克隆细胞的基因型。结果:成功构建靶向敲除JAK2基因的lentiCRISPRv2-sgRNA3-1质粒。优化方案得到低细胞毒性高转染效率的感染K562细胞慢病毒量。CRISPR/Cas9系统成功在JAK2基因sgRNA3-1识别位点发挥基因组编辑活性,获得纯合敲除JAK2基因细胞株K562-JAK2~(-/-)(两个等位分别发生移码突变,预期编码没有功能的JAK2蛋白)。结论:CRIAPR/Cas9系统通过慢病毒感染方式获得JAK2基因纯合敲除的K562细胞株,该细胞模型可用于研究在慢性髓系白血病中JAK2基因的作用,为构建K562敲除其他基因细胞系提供实验依据,为探究造血分化机制的研究奠定实验基础。     

基于CRISPR/Cas9技术构建CELF6基因敲除细胞系并探讨CELF6与p53基因的关系

目的:构建CELF6基因敲除细胞系并探讨CELF6与p53基因之间的关系。方法:CRISPR/Cas9双载体慢病毒系统通过两个慢病毒载体分别向细胞中导入Cas9蛋白和sg RNA序列表达框,从而实现对CELF6基因的敲除。通过Surveyor(错配酶法)检测sg RNA活性并利用Western blot(蛋白质免疫印迹)检测CELF6的敲除效率。进一步利用CCK-8试剂盒检测敲除CELF6和过表达CELF6对细胞增殖的影响。利用公开可用的癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析CELF6在多种肿瘤组织中的表达情况。结果:CELF6基因敲除的HCT116细胞系成功构建。Western blot检测发现CELF6基因敲除的细胞系中p53、p-RB蛋白的表达水平显著下调,而CELF6过表达的细胞中p53、p-RB蛋白的表达水平明显上调。CCK-8实验结果显示敲除CELF6基因后,细胞增殖活性显著增强;而过表达CELF6后,细胞的增殖活性受到明显抑制。生物信息学分析发现CELF6在结肠癌、胶质母细胞瘤、子宫内膜癌、肾嫌色细胞癌、乳腺癌、甲状腺癌等肿瘤组织中显著低表达。结论:推测CELF6是一种新的潜在肿瘤抑制基因,其可能在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用。