全反式维甲酸调控自噬促进肝祖细胞成熟分化的作用研究

该研究探讨全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)体外诱导小鼠胚胎肝祖细胞HP14-19细胞成熟分化及ATRA对细胞自噬水平的调控作用。应用1μmol/L ATRA处理小鼠胚胎肝祖细胞HP14-19细胞,不同时间点进行荧光素酶报告基因检测ALB-Gluc活性,Real-time PCR检测肝细胞相关标志基因的表达,吲哚菁绿(indocyanine green,ICG)及过碘酸–希夫(periodicacid-schiff,PAS)染色检测细胞的成熟功能;透射电镜观察自噬体及细胞连接,ptf LC3质粒转染细胞,激光共聚焦显微镜观察自噬流,Western blot检测自噬相关标志蛋白质水平等综合分析自噬的变化情况。结果显示,与对照组相比,ATRA可显著增强HP14-19细胞ALB-Gluc活性,抑制肝前体细胞标志DLK和AFP的表达,促进成熟肝细胞标志ALB、CK18、TAT和Apo B的表达,ICG及PAS染色阳性细胞数显著增多(P0.05);透射电镜结果可见ATRA诱导组出现大量自噬体和自噬溶酶体,同时细胞间紧密连接增多,并且自噬相关标志蛋白质Beclin1、LC3-II、RAB7水平增高,P62水平无显著变化,LC3-II/LC3-I的比值明显增加(P0.05);激光共聚焦显微镜可见ATRA组细胞质内黄色斑点的自噬体及红色斑点的自噬溶酶体均较对照组明显增多,自噬抑制剂3-MA和Baflomycin可抑制ATRA诱导的HP14-19细胞的ICG摄取和糖原合成功能。综上所述,ATRA可能通过调节细胞自噬水平有效诱导小鼠胚胎肝祖细胞的分化成熟。     

骨形态发生蛋白9定向诱导多潜能干细胞成骨分化

为确认和评价骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9, BMP9)定向诱导多潜能干细胞成骨分化的能力,以鼠间充质干细胞C3H10、小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)和骨髓基质细胞(bone marrow stromal cell, BMSC)三种多潜能干细胞为目标细胞,用重组腺病毒的方法将BMP9导入细胞,通过荧光素酶报告基因实验、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)定量测定、钙盐沉积实验、real time PCR、动物实验和组织化学染色等方法,观察BMP9对于多潜能干细胞成骨分化的定向诱导作用．结果提示,BMP9能诱导C3H10、MEFs和BMSC细胞ALP的表达,且具有剂量依赖性．BMP9在体外能够促进C3H10细胞和MEFs细胞的钙盐沉积．经BMP9刺激后,C3H10细胞成骨相关基因ALP、Runx2、骨桥素(osteopontin, OPN)和骨钙素(osteocalcin, OC)的mRNA水平均增加．荧光素酶报告基因实验证实,BMP9可以活化Smad和成骨关键基因Runx2．动物实验和组织化学染色检查显示,BMP9可以诱导C3H10细胞在裸鼠皮下异位成骨,因此,BMP9具有定向诱导多潜能干细胞成骨分化的能力．     

BMP9通过ALK1/2信号通路诱导肝祖细胞成熟分化的作用研究

该研究探讨了骨形态发生蛋白9(BMP9)通过ALK1/2信号通路诱导肝祖细胞成熟分化的作用。通过腺病毒介导siALK1和siALK2感染肝祖细胞14-19(hepatic progenitor cell 14-19,HP14-19),Real-time PCR及Western blot分别检测ALK1及ALK2的表达,荧光素酶报告基因检测ALB-Gluc活性,Real-time PCR检测肝脏相关基因AFP、ALB、CK18、ApoB的mRNA水平表达,PAS染色和ICG摄取实验检测肝细胞的代谢及糖原合成功能。结果显示,腺病毒介导的siALK1和siALK2可特异性抑制HP14-19细胞内ALK1和ALK2的表达,BMP9可诱导HP14-19的成熟分化,细胞形态呈现多角形铺路石样,ALB-Gluc读数显著增加,肝干细胞标志物AFP下调,成熟肝细胞标志物ALB、CK18及ApoB表达显著上调,ICG和PAS染色阳性细胞数增多,Ad-siALK1和Ad-siALK2组,肝细胞标志物表达下降,解毒代谢及糖原合成能力下降。总之,BMP9可通过ALK1/2信号通路诱导肝祖细胞成熟分化。     

低浓度血清促进胚胎肝祖细胞诱导分化

为了探讨不同血清浓度诱导培养条件下对体外诱导胚胎肝祖细胞成熟分化的影响。本研究选用含有10%FBS、5%FBS、2%FBS的DMEM/HGF/FGF4肝细胞培养基体外诱导胚胎肝祖细胞的成熟分化,分别于诱导后0d、3d、6d、9d、12dALB-GLuc检测细胞白蛋白的合成水平,细胞计数检测细胞的成长曲线。RT-PCR检测肝细胞相关标志DLK、AFP、CK18,免疫荧光检测ALB、UGT1A的表达情况。ICG摄取和尿素氮检测肝细胞成熟功能。诱导后第三天,ALB-GLuc开始增高,于第9天达高峰,2%FBS组ALB-GLuc读数最高。生长曲线显示低血清浓度下细胞的增殖速度明显慢于高血清浓度。RT-PCR和免疫荧光结果显示诱导后第9天,3个诱导组DLK、AFP表达低于无诱导组,CK18、ALB、UGT1A均高于无诱导组,2%FBS组差异最显著。3个诱导组的肝细胞ICG摄取能力明显增高,2%FBS组ICG阳性细胞数为(60.2±9.0)%,明显高于5%FBS(45.0±3.6)%及10%FBS组(35.2±2.9)%,诱导后肝细胞的尿素合成功能增强,尤其是2%FBS组。低浓度血清培养条件能更好的诱导胚胎肝祖细胞的体外成熟分化。     

骨形态发生蛋白诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的研究进展

目前从骨髓中成功分离、鉴定BMSCs的方法较为成熟。新发现一些物质能诱导BMSCs向成骨细胞分化因子,其中对BMP研究较多。其机制可能是通过结合Ⅰ、Ⅱ型BMP受体后激活Smad信号通路诱导成骨。其诱导方法主要包括直接应用天然BMP或者将BMP及其协同基因转入BMSCs,通过靶细胞的持续表达BMP促进新骨形成。本文将近10年BMP诱导BMSCs向成骨分化的研究现状及发展趋势做一综述。     

全反式维甲酸体外诱导P19细胞向心肌方向分化

目的探讨不同浓度全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,atRA)诱导P19细胞向心肌分化的效力。方法细胞分成P19细胞组,2nm/L atRA诱导组,5nm/L atRA诱导组,8nm/L atRA诱导组。各组细胞经过诱导、聚集培养、聚集体贴壁培养10天后,RT-PCR检测GATA-4,α-肌球蛋白重链(α-myosin heavychain,α-MHC)的mRNA表达,免疫荧光双标检测α-sarcomeric actin和cTnT蛋白共表达,Western blot检测cTnT的蛋白表达。结果 atRA可诱导聚集P19细胞表达GA-TA-4、a-MHC mRNA;α-sarcomeric actin和cTnT的表达和共表达增加;5nm/L atRA组,8nm/L atRA组GATA-4、a-MHCmRNA的表达量显著高于P19细胞组;5nm/L atRA组,8nm/L atRA组两种蛋白的表达和共表达量显著高于P19细胞组,以5nm/L atRA组最高,显著高于其它组。结论 atRA可诱导聚集P19细胞向心肌分化,其中5nm/L atRA组效果最好。     

全反式维甲酸诱导胃腺癌细胞周期阻滞的作用机制

目的:研究全反式维甲酸(all trans retinoic acid,ATRA)对人胃腺癌细胞(SGC-7901)细胞周期阻滞的诱导作用并探讨其机制.方法:采用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法检测ATRA对SGC-7901增殖的抑制;流式细胞术检测细胞周期,Western blot方法检测不同浓度ATRA处理后的SGC-7901细胞中Akt、P-Akt(Ser473)、P-Akt(Thr308)、p-GSK-3β(Ser9)和cyclin D1的表达情况.结果:10.9～10.5mol/L的ATRA作用SGC-7901细胞48 h,能显著抑制细胞增殖,其抑制率分别为10.2%±0.5%、15.3%±0.5%、17.0%±0.7%、28.4%±1.0%和36.9%±0.7%;G1期细胞比率随着ATRA浓度的增加而增加,呈明显的G1期阻滞;Western blot检测显示ATRA对细胞中Akt蛋白的表达没有明显影响,两种p-Akt蛋白的表达显著下调,ATRA显著降低细胞中cyclin D1和p-GSK-3β的表达.结论:ATRA可能通过抑制磷酸化Akt蛋白表达而减少p-GSK-3β的表达,从而减少cyclin D1的表达量,进而诱导SGC-7901细胞发生G1期阻滞.     

骨形态发生蛋白2介导甲状旁腺素促进成骨细胞分化的实验研究

目的 探讨骨形态发生蛋白2(BMP2)在甲状旁腺素(PTH)促进成骨细胞分化过程中的重要介导作用.方法培养MC3T3-E1细胞,分为4组:1)盐水对照组;2)PTH组;3)6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[1,5-a]嘧啶 (Dorsomorphin) 组;4) PTH+Dorsomorphin组.Real-time PCR法和Westernblot方法检测细胞BMP2、BMP2下游基因和成骨因子的表达,碱性磷酸酶(ALP)染色方法检测细胞ALP的活性;双荧光素酶报告基因检测方法检测12xSBE-OC荧光素酶的活性.结果:PTH组BMP-2、成骨因子的表达及其12xSBE-OC荧光素酶的活性,明显高于盐水对照组.Dorsomorphin组和PTH+Dorsomorphin组BMP-2、BMP-2下游基因和成骨因子的表达,均明显低于盐水对照组;但其表达于两组间无明显差别.结论 BMP2介导PTH促进成骨细胞的分化,PTH可通过上调BMP2的表达,提高其功能,促进成骨细胞的成熟分化.     

阻断ERK1/2激酶可增强骨形态发生蛋白9诱导的间充质干细胞成骨分化

骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)具有很强的诱导间充质干细胞定向成骨分化的能力.但对于其所涉及的相关分子机理了解并不深入.利用BMP9重组腺病毒感染间充质干细胞,Western blot检测ERK1/2激酶的磷酸化,ERK1/2的特异性抑制剂PD98059阻断ERK1/2活性,或以RNA干扰抑制ERK1/2表达,通过体外细胞实验和体内动物实验,初步分析和揭示ERK1/2对于BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化的调控作用及其可能机制.结果发现:BMP9可以促进ERK1/2激酶的磷酸化,ERK1/2抑制剂PD98059可增强由BMP9诱导的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)表达和钙盐沉积,并促进由BMP9诱导的Runx2基因的表达和转录活性,以及Smad经典途径的活化;而RNA干扰导致ERK1/2基因沉默同样也可进一步促进BMP9诱导的ALP活性和钙盐沉积,并促进BMP9诱导的间充质干细胞在裸鼠皮下异位成骨.因此,BMP9可以促进ERK1/2蛋白激酶的活化,而阻断ERK1/2蛋白激酶可进一步增强BMP9诱导的成骨分化,ERK1/2极可能对于BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化起着负向调控作用.     

骨形态发生蛋白9通过JNKs激酶途径调控间充质干细胞成骨分化

前期研究发现骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)除了通过经典Smad途径外,也可通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPKs)中的p38激酶途径调控间充质干细胞成骨分化．本研究继续探讨MAPKs的重要成员c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases,JNKs)对于BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的调控作用．利用BMP9重组腺病毒感染间充质干细胞,通过体外细胞实验和体内动物实验,初步分析BMP9是否可通过JNKs激酶途径调控间充质干细胞成骨分化．结果表明：BMP9可通过促进JNKs激酶磷酸化而导致其活化;JNKs抑制剂SP600125可抑制由BMP9诱导的间充质干细胞的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、骨桥蛋白(osteocpontin,OPN)和骨钙素(osteocalcin,OCN)表达以及钙盐沉积;利用抑制剂SP600125抑制JNKs激酶活性后,BMP9诱导Runx2的表达和转录活性,以及Smad经典途径的激活也相应受到抑制;RNA干扰导致JNKs基因沉默同样也可抑制BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化以及裸鼠皮下异位成骨．因此,BMP9可通过活化JNKs激酶途径,从而调控间充质干细胞成骨分化．     

维甲酸促进小鼠F9细胞中STAT1的反式激活作用

维甲酸能促进肿瘤细胞的凋亡,诱导体外胚胎干细胞的分化,但作用机制的不明使其应用受到极大限制.因此,更多更全面地了解维甲酸的作用机制具有重要意义.本文构建了信号传导与转录激活因子（STAT1和STAT3）的真核表达载体 ,通过免疫荧光染色、电泳迁移率实验以及双荧光素酶报告基因检测系统证明, 维甲酸诱导可以激活转录因子STAT1促使其进入细胞核,并且增强STAT1蛋白与靶基因启动子的结合能力,从而发挥基因表达调控作用.本文结合后续的STAT1功能分析,试图建立起一种“维甲酸-转录因子-靶基因”的研究模式,有助于维甲酸作用机制的全面、系统的研究.这为临床上使用维甲酸作为抗肿瘤药提供理论基础,同时也为胚胎干细胞多能性调控机制研究提供新思路.     

骨形态发生蛋白9基因敲除小鼠的构建

目的运用CRISR/Cas9技术敲除小鼠基因组中Bmp9基因片段,构建Bmp9基因敲除小鼠。方法根据Bmp9基因的外显子序列,设计一段sgRNA并合成。sgRNA体外转录后和Cas9mRNA混合后显微注射受精卵细胞,注射后的受精卵细胞移植至受体动物获得子代小鼠。提取子代小鼠基因组DNA测序鉴定其基因型。基因型鉴定正确的小鼠与野生型交配后筛选纯合子小鼠。同时取纯合子小鼠心脏、肝、脾、肺、肾,匀浆后提取总RNA和总蛋白,通过qPCR、WB和免疫组化检测BMP9在各组织中的表达。结果设计并合成20bp的sgRNA并进行体外转录,显微注射并回植后得到基因突变小鼠,连续交配后得F2代纯合子。测序结果显示,突变小鼠存在两种基因型,一种为5bp缺失突变,另一种为13bp缺失并伴有1bp插入突变。与野生型C57BL/6相比,qPCR、WB和免疫组化结果均表明基因敲除小鼠肝中BMP9表达显著降低。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建出了BMP9基因敲除小鼠。     

骨形态发生蛋白9诱导成骨相关TGFβⅡ型受体的鉴定分析

前期研究发现骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)具有较强的诱导骨形成的能力,但目前对其诱导骨形成相关的分子机制了解甚少．采用重组腺病毒的方法成功构建显性负性突变的转化生长因子(TGF)βⅡ型受体的腺病毒,将其与BMP9共同导入靶细胞,通过体外细胞实验和体内动物实验,初步鉴定分析与BMP9诱导成骨密切相关的TGFβⅡ型受体．体外细胞实验发现：三种显性负性突变的TGFβⅡ型受体,即dnBMPRⅡ、dnActRⅡ和dnActRⅡB在体外能抑制由BMP9诱导的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)表达和钙盐沉积,并可抑制BMP9诱导的Smad信号途径的激活．动物实验也显示,dnBMPRⅡ、dnActRⅡ和dnActRⅡB可抑制BMP9诱导的异位成骨,提示相应的野生型TGFβⅡ型受体即BMPRⅡ、ActRⅡ和ActRⅡB很可能与BMP9诱导成骨有关．而靶细胞中均只表达BMPRⅡ和ActRⅡ,并不表达ActRⅡB.随后,采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)对BMPRⅡ和ActRⅡ进行基因沉默,结果发现BMPRⅡ和ActRⅡ的表达受到抑制后,由BMP9诱导的荧光素酶活性和ALP活性也相应受到抑制．因此,BMPRⅡ和ActRⅡ是与BMP9诱导成骨分化相关的TGFβⅡ型受体．     

骨形态发生蛋白在多器官组织分化发育中的作用及研究进展

骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic proteins,BMPs)是一种多功能蛋白,是转化生长因子TGF-β超家族成员,参与骨器官发生、形成与再生的过程,同时对神经系统、造血系统的分化发育也有调控作用.目前,BMPs的研究已经涉及发育生物学、遗传学等多个领域,并在临床上具有广泛的应用前景.基于相关研究近状,对BMPs的分子结构特征及其在多器官组织分化发育中的作用进行分析,为进一步研究BMPs的体内活性及临床应用提供了理论借鉴和参考.     

重组人骨形态发生蛋白－2成熟肽在大肠杆菌中的表达及其诱导成骨活性

报告了人骨形态发生蛋白－２（ＢＭＰ－２）成熟肽的基因克隆,及其在大肠杆菌中的表达。用ＡｆｌⅡ酶剪除ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ中的信号肽及前肽部分的序列,将编码成熟肽的ｃＤＮＡ３′端０．３６ｋｂ基因片段克隆于大肠杆菌表达载体ｐＭＸ－１质粒的ＡＴＧ下游,受控于ＰＬＰＲ启动子。重组子以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主细胞进行温度诱导表达。工程菌经４２℃６ｈ诱导后,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一条新蛋白带,分子量约为１２ｋＤ,约占菌体总蛋白的２０％。主要以包涵体形式存在的表达产物经初步纯化后,可获得纯度较高的重组人骨形态发生蛋白－２成熟肽（ｒｈＢＭＰ－２ｍ）。小鼠肌肉植入试验发现。ｒｈＢＭＰ－２ｍ植入后的不同时间,在局部出现间质细胞的聚集和增生、软骨细胞及软骨基质的生成和硬质骨的形成,证明ｒｈＢＭＰ－２ｍ具有明显的诱导新骨形成的作用。     

骨形态发生蛋白在脂肪生成中的作用

骨形态发生蛋白（bone morphogenesis proteins, BMP）是一类多功能生长因子,除BMP1外都属于转化生长因子β（transforming growth factor beta, TGFβ）超家族的成员. 近年来,越来越多的研究表明,BMP在脂肪生成过程中也起着重要的作用. 本文综述了BMP在诱导间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）、脂肪前体细胞系和胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESC）生成脂肪细胞的过程中的作用及信号通路方面的研究进展.这些结果将有助于了解不同部位脂肪沉积的调控机制以及一些脂肪过多疾病（如肥胖症）的产生原因     

全反式维甲酸抑制血管平滑肌增殖的作用机制

血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMC）的增殖是动脉粥样硬化等血管增生性疾病的重要病理特征。因此,抑制VSMC增殖及促进其分化的药物均有望用于动脉粥样硬化的治疗。全反式维甲酸（ATRA）是具有广泛生物学效应的维生素A类物质。研究证实ATRA可与VSMC中存在的维甲酸类受体结合,调控VSMC从低分化的合成型转变为成熟的收缩袁型,进而防止其过度增殖。     

全反式维甲酸抑制猪脂肪间充质干细胞的成脂分化

分离培养猪脂肪间充质干细胞（adipose mesenchymal stem cells, AMSCs）,流式细胞仪鉴定其表面标记.利用MTT比色检测不同浓度的全反式维甲酸（all trans retinoic acid, ATRA）对猪AMSCs增殖的影响;光学显微镜下观察猪AMSCs向脂肪细胞分化的形态学变化;油红O染色提取法分析不同浓度ATRA对猪AMSCs成脂分化的影响;RT PCR检测脂肪细胞分化标志基因LPL和aP2 mRNA的变化.MTT比色结果显示,生理浓度（1×10^－9～1×10^－8 mol/L）和药理浓度（1×10^－7～1×10^－5 mol/L）ATRA对猪AMSCs增殖均没有影响.油红O染色提取法结果表明,除1×10^－7　mol/L ATRA对猪AMSCs成脂分化没有影响外,生理浓度（1×10^－9～1×10^－8 mol/L）和其它药理浓度（1×10^－6～1×10^－5 mol/L）ATRA均显著抑制猪AMSCs成脂分化（P<0.05）.RT-PCR检测显示,ATRA显著抑制脂肪细胞分化标志基因LPL和aP2 mRNA表达（P<0.05）.     

全反式维甲酸抑制肝癌细胞β-连环素的表达

 全反式维甲酸 (ATRA)是人肝癌细胞株SMMC 772 1的分化诱导剂 ,刺激细胞向正常方向分化 .为了研究ATRA诱导细胞分化的机制是否与 β 连环素 ( β catenin)有关 ,用终浓度为 1 0 μmol LATRA刺激SMMC 772 1 ,发现胞浆内β 连环素明显降低 .进一步实验证实 ,ATRA下调胞浆内β 连环素和诱导β 连环素的mRNA降低有关 .同时 ,ATRA处理基本不会对E 钙粘附素 β 连环素中的β 连环素的量产生影响 ,但能增强细胞凝聚力 .结果提示 ,ATRA对两种形式的 β 连环素的调节机制是不一样的 ,ATRA诱导细胞分化的机制和β 连环素有关 .