蚯蚓体内一种纤溶酶原激活剂(e-PA)对ATEE的降解

赤子爱胜蚓（Ｅｉｓｅｎｉａｆｅｔｉｄａ）体内的一种纤溶酶原激活剂（ｅ－ＰＡ）能够降解人工合成底物Ｎ－乙酰－Ｌ－酪氨酸乙酯（ＡＴＥＥ）,该降解反应的最适ｐＨ为８．５,而且在０．２ｍｏｌ／ＬＮａ２ＨＰＯ４中的活性要强于在０．０５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）中．分别测定了ｅ－ＰＡ的大小亚基及全酶在０．２ｍｏｌ／ＬＮａ２ＨＰＯ４与０．０５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）两种体系中的Ｋｍ和Ｋｃａｔ．结果表明,在０．２ｍｏｌ／ＬＮａ２ＨＰＯ４中,全酶的ＡＴＥＥ活性远远高于大小亚基单独的ＡＴＥＥ活性,而在０．０５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）中则没有这种现象．从蛋白质结构的角度对这一结果作了解释．用不同抑制剂和ｅ－ＰＡ作用,结果表明,ｐｅｐｓｔａｔｉｎ,Ｅ－６４和ＥＤＴＡ对ｅ－ＰＡ的ＡＴＥＥ活性都有不同程度的抑制,这一点与ｅ－ＰＡ的ＢＡＥＥ活性不同．     

大肠杆菌精氨酰－tRNA合成酶的变种ArgRS306KR的纯化和基本性质

本文从含ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ基因ａｒｇｓ３０６ＫＲ的ｐＵＣ１８重组质粒的大肠杆菌ＴＧ１转化子中经ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ和Ｂｌｕｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ两步柱层析,得到电泳一条带的ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ。纯酶的比活为２７９０单位／毫克。该酶氨酰化和ＡＴＰ～ＰＰｉ交换活力的最适ｐＨ分别为ｐＨ８．３和ｐＨ７．５。氨酰化活力对ＡＴＰ、Ａｒｇ和ｔＲＮＡ的Ｋｍ分别为２．６ｍｍｏｌ／Ｌ、１４．０μｍｏｌ／Ｌ和５．０μｍｏｌ／Ｌ：Ｖｍａｘ为７６３０单位／毫克;ｋｏａｔ为９Ｓ－１。ＡＴＰ～ＰＰｉ交换活力对ＡＴＰ和Ａｒｇ的Ｋｍ分别为８．３ｍｍｏｌ／Ｌ和９９μｍｏｌ／Ｌ;Ｖｍａｘ为１６３２０单位／毫克;ｋｃａｔ为１８Ｓ－１。     

蚯蚓纤溶酶原激活剂(e-PA)小亚基活性中心的酶学性质及CD光谱的研究

蚯蚓纤溶酶原激活剂（ｅ－ＰＡ）具有多种底物特异性．对构成其的小亚基的活性中心的研究有利于阐述ｅ－ＰＡ的结构与功能的关系．利用胰蛋白酶的特异性抑制剂ＴＬＣＫ（Ｎ－α－ｐ－ｔｏｓｙｌ－Ｌ－ｌｙｓｉｎｅｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌｋｅｔｏｎｅ）对小亚基进行抑制活性的研究,结果表明ＴＬＣＫ对酶促反应的抑制曲线与可逆抑制曲线相似,但在抑制剂存在下的最大反应速度与抑制剂不存在时的最大反应速度不同．结合小亚基在ＴＬＣＫ存在下的ＣＤ光谱变化,证明了小亚基分子表面存在两个活性位点,这两个活性位点对ＴＬＣＫ的敏感性不同,从而造成ＴＬＣＫ抑制行为的异常．推测不同的活性结构对应于不同的底物特异性．     

柑叶片蔗糖酶的分离纯化及其部分性质的研究

柑（Ｃｉｔｒｕｓｒｅｔｉｃｕｌａｔａ Ｂｌａｎｃｏ）幼叶中存在高活性的酸性蔗糖酶。经硫酸铵盐析、ＤＥＡＥ－琼脂糖离子交换层析、ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００ 凝胶层析纯化,活性回收率６．４％ ,纯化倍数１７９．２ 倍。纯化的酶经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单一蛋白带,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示１ 条蛋白带,其亚基分子量４０ ｋＤ。用ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００ 凝胶层析法测得分子量为８０ ｋＤ。推测该酶由两个相同亚基构成。以蔗糖为底物测定该酶的表观Ｋｍ 为１．６×１０－ ２ ｍ ｏｌ·Ｌ－ １,Ｖｍ ａｘ为１００ ｍ ｇ 还原糖·ｍ ｇ－ １蛋白质·ｈ－ １。最适ｐＨ ５．０,酸碱稳定区在ｐＨ ４．５—５．５ 之间。最适温度５５℃     

甘薯叶片蔗糖酶的分离纯化及其部分性质

纯化酶经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单一蛋白带,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示一条蛋自带,其亚基分子量为３９．８ｋＤ。用ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００凝胶过滤测得全酶的分子量为７９．４ｋＤ,该酶由两个相同亚基组成。其表观Ｋｍ为１２ｍｍｏｌ／Ｌ,Ｖｍａｘ为９９．５ｍｇ还原糖ｍｇ－１ｐｒｏｔｅｉｎｈ－１。     

大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶的变种ArgRS306KR的纯化…

本文从含ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ基因ａｒｇｓ３０６ＫＲ的ｐＵＣ１８重组质粒的大肠杆菌ＴＧ１转化子中经ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｃｅｌ和Ｂｌｕｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ两步柱层析,得到电泳一条带的ＡｒｇＲＳ３０６ＫＲ。纯酶的比活为２７９０单位／毫克。该酶氨酰化和ＡＴＰ－ＰＰｉ交换活力的最适ＰＨ分别为ＰＨ８．３和ＰＨ７．５。氨酰化活力对ＡＴＰ、Ａｒｇ和ｔＲＮＡ的Ｋｍ分别２．６ｍｍｏｌ／Ｌ、１４．０μｍｏｌ／Ｌ和５．     

甘薯叶片蔗糖酶的分离纯化及其部分性质

纯化酶经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单一蛋白带,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示一条蛋白带,其亚基分子量为３９．８ｋＤ。用Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－２００凝胶过滤测得全酶的分子量为７９．４ｋＤ,该酶由两个相同亚基组成。其表观Ｋｍ为１２ｍｍｏｌ／Ｌ,Ｖｍａｘ为９９．５ｍｇ还原糖ｍｇ＾－１ｐｒｏｔｅｉｎ ｈ＾－１。     

尿激酶抗人交联纤维蛋白-D-二聚体单抗化学偶合体的制备

利用双功能试剂Ｎ－琥珀酰亚胺－３（２－二硫吡啶）丙酸酯（ＳＰＤＰ）作交联剂,合成了尿激酶（ＵＫ）－抗人交联纤维蛋白降解物Ｄ－二聚体单抗（ＭＡ－ＨＩＤ１）化学偶合体（ＵＫＭＡ－ＨＩＤ１）,并用苯甲脒－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ及人交联纤维蛋白降解物Ｄ－二聚体－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和柱纯化,获得偶合体产物．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ呈现一条带,其分子量约为２０００００．纤维蛋白平板法测活结果显示,偶合体中酶比活为５３０００ＩＵ／ｍｇ尿激酶蛋白,与偶联前的５４３００ＩＵ／ｍｇ蛋白相仿．ＥＬＩＳＡ测试显示,偶合体对人交联纤维蛋白降解物Ｄ－二聚体有免疫反应性,并且与偶联前的抗Ｄ－二聚体单抗对此抗原的反应性相当     

盐生杜氏藻生油—3—磷酸脱氢酶的分离化及其特性的研究

利用ＰＥＧ分级,ＤＥＡＥ离子交换层析,Ｂｈｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ拟亲和层析,ＭｏｎｏＱ离子交换层析等手段,分离纯化直二氏藻甘油三磷酸（Ｇ－３－Ｐ）脱氢酶（ＥＣ１．１．１．８）得到比活为１２．６ｕ／ｍｇ的电泳纯的酶,并对此酶的生化特性进行了研究。４－２０％非变性聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳测得全酶分子量约为２７０ｋＤ,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明该酶只有一种分子量约为６５ｋＤ的亚基,据此推测该酶应为同四聚体。酶     

慈菇（Sagittaria safittifolia）α－半乳糖苷酶的纯化与性质

以对硝基苯糖苷基为底物,测定了慈菇的１２种糖苷酶,其中α－甘露糖苷酶、α－和β－半乳糖苷酶活力较高;经硫酸铵分级沉淀,ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１５０分子筛层析,ＣｏｎＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析,ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ离子交换层析,从慈菇抽提液纯化了α－半乳糖苷酶。纯化酶的比活提高１０７２倍,活力回收１５．６％,在圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上均显示１条蛋白质带,在α－半乳糖苷酶浓度为１５０ｍＵ／ｍｌ的溶液中测不到其他糖苷酶的活力。慈菇α－半乳糖苷酶的分子量用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００凝胶过滤柱测定或在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上测定均为６０ｋＤ,酶反应的最适ｐＨ在５．８附近,最适温度为６０℃。该酶分解对硝基苯基－α－半乳糖苷的Ｋ＿ｍ值为３．７×１０￣（－４）ｍｏｌ／Ｌ,Ｖ＿ｍ值为２．１×１０￣（－４）ｍｏｌ／Ｌ。银离子、汞离子显著抑制酶活力,Ｄ－半乳糖和密二糖均竞争性地抑制该酶水解对硝基苯基α－Ｄ－半乳糖苷的活力,根据Ｄｉｘｏｎ作图求得其Ｋ＿ｉ值分别为０．９２×１０￣（－３）ｍｏｌ／Ｌ和１．９８×１０￣（－３）ｍｏｌ／Ｌ。２－脱氧－Ｄ－半乳糖和Ｌ－岩藻糖为酶活力的非竞争性抑制剂。化学修饰     

噬菌体RB69 DNA聚合酶的表达、分离纯化和其聚合反应的稳态动力学研究

噬菌体ＲＢ６９外切酶活性缺失的ＤＮＡ 聚合酶突变体（Ｄ２２２Ａ／Ｄ３２７Ａ）在大肠杆菌细胞中表达,表达量达细胞蛋白总量的６９％ ．表达后经ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦａｓｔＦｌｏｗ , Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｑ 和ＨＴＰ三步分离纯化,纯度可达９９％ 以上．随后测定了该酶利用５种ｄＮＴＰ为底物进行聚合反应的酶促动力学常数（Ｋｍ 和Ｋｃａｔ）,结果表明该酶利用ｄＵＴＰ的能力与利用ｄＴＴＰ的能力相近,Ｋｍ （ｄＴＴＰ）和Ｋｍ（ｄＵＴＰ）均较高于其它３种脱氧核苷酸的Ｋｍ （ｄＡＴＰ, ｄＣＴＰ, ｄＧＴＰ）,推测其Ｋｍ 值的差异主要来源于Ｔ／Ｕ 碱基本身,而并非全部由ＧＣ碱基配对与ＡＴ碱基配对之间的氢键作用力的强弱差别所决定．     

小麦返白系返白期间Rubisco变化研究

以小麦返白系和对照矮变１号为材料,选用返白系三个特殊的时期,返白初期、全白期、复绿初期,对其叶片可溶性蛋白进行了Ｎａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥ和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ的研究。结果表明：随着叶片白化,核酮糖１．５－二磷酸羧化酶／加氧酶（Ｒｕｂｉｓｃｏ）全酶谱带逐渐变小,全白叶全酶谱带消失,随着复绿全酶谱带又出现,并逐渐恢复。而且Ｒｕｂｉｓｃｏ大、小亚基（ＬＳ、ＳＳ）谱带减少幅度差异很大,大亚基减少远远大于小亚基。     

青霉素酰化酶活性中心的定点突变

对Ｅ．ｃｏｌｅ ＡＴＣＣ １１１０５的青霉素酰化酶（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｇ ａｃｙｌａｓｅ,ＰＧＡ）活性中心的Ｓｅｒ２９０分别进行了定点突变和和化学修饰,将活性中心的Ｓｅｒ２９０改变成Ｃｙｓ或Ｓｅｃｙｓ,ＰＧＡ水解活力均大为下降,但仍保留部分活性。其对底物６－硝基（３－苯乙酰氨基）苯甲酸（６－ｎｉｔｒｏ－３－ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｍｉｄｏ ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ,ＮＩＰＡＢ）的ｋｃａｔ分别从１     

大肠杆菌精氨酰－tRNA合成酶变种ArgRS381KA的基本性质

本文研究了Ｌｙｓ３８１变为Ａｌａ的精氨酰－ｔＲＮＡ合成酶（ＡｒｇＲＳ）变种ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的最适ｐＨ和稳态动力学性质;比较了此酶与天然酶ＡｒｇＲＳ的荧光光谱性质和热稳定性。实验结果表明ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的氨酰化活力和ＡＴＰ￣ＰＰｉ交换活力的最适ｐＨ分别为８．０和７．０,与天然酶相同;ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的氨酰化活力对精氨酸、ＡＴＰ和ｔＲＮＡＡｒｇ的Ｋｍ分别为１２μｍｏｌ／Ｌ、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ和１．１μｍｏｌ／Ｌ,Ｖｍａｘ为１６０００Ｕ／ｍｇ,ｋｃａｔ为１６ｓ－１;ＡＴＰ￣ＰＰｉ交换活力对精氨酸、ＡＴＰ和ＰＰｉ的Ｋｍ分别为９２．９μｍｏｌ／Ｌ、０．８５ｍｍｏｌ／Ｌ和８０．１μｍｏｌ／Ｌ,Ｖｍａｘ为２８０００～３００００Ｕ／ｍｇ,ｋｃａｔ为３２ｓ－１．ＡｒｇＲＳ３８１ＫＡ的荧光激发光谱和发射光谱与ＡｒｇＲＳ基本相同。热失活速度比天然酶慢。     

6BA诱导的带正电荷的葡萄叶过氧化物酶

河岸葡萄叶的带正电荷过氧化物酶（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ, ＣＰＯＤ） 可受６ＢＡ 诱导,但盐、Ｈ２Ｏ２ 或Ｆｅ２＋＋ Ｈ２Ｏ２ 均使叶片ＣＰＯＤ 活性明显下降,而高浓度的无机盐明显刺激纯ＣＰＯＤ 活性增加。在以愈创木酚为底物时ＣＰＯＤ 最适ｐＨ 为４ ．６０ ～５ ．７５ ,对Ｈ２Ｏ２ 的表观Ｖｍａｘ 和Ｋｍ 值分别为１１０ Ｕ／ｍｇ 蛋白和１ ．１５ｍ ｍｏｌ／Ｌ。     

三丁基锡对人红细胞膜Na~＋，K~＋－ATPase活性的抑制作用

三丁基锡（ＴＢＴ）是人红细胞膜上Ｎａ~＋,Ｋ~＋－ＡＴＰａｓｅ的一种抑制剂．该化合物对Ｎａ~＋,Ｋ~＋－ＡＴＰａｓｅ有很强的抑制能力．在正常的反应体系中,ＴＢＴ浓度仅为１０μｍｏｌ／Ｌ时,该酶的活性全部丧失;其抑制Ｎａ~＋,Ｋ~＋－ＡＴＰａｓｅ的ＩＣ＿（５０）值为２．２μｍｏｌ／Ｌ．Ｋ~＋能增强ＴＢＴ的这种抑制作用,ＴＢＴ为Ｋ~＋的反竞争性抑制剂．     

盐生杜氏藻甘油-3-磷酸脱氢酶的分离纯化及其特性的研究

利用ＰＥＧ分级,ＤＥＡＥ离子交换层析,ＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ拟亲和层析,ＭｏｎｏＱ离子交换层析等手段,分离纯化盐生杜氏藻（Ｄｕｎａｌｉｅｌａｓａｌｉｎａ（Ｄｕｎａｌ）Ｔｅｏｄ．）甘油三磷酸（Ｇ３Ｐ）脱氢酶（ＥＣ１．１．１．８）,得到比活为１２．６Ｕ／ｍｇ的电泳纯的酶,并对此酶的生化特性进行了研究。４％～２０％非变性聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳测得全酶分子量约为２７０ｋＤ,ＳＤＳＰＡＧＥ表明该酶只有一种分子量约为６５ｋＤ的亚基,据此推测该酶应为同四聚体。酶催化磷酸二羟丙酮（ＤＨＡＰ）还原的最适ｐＨ值为７．５,催化Ｇ３Ｐ脱氢的最适ｐＨ值为１０。该酶对４个底物还原型辅酶Ⅰ（ＮＡＤＨ）,二磷酸吡啶核苷酸（ＤＨＡＰ）,辅酶Ⅰ（ＮＡＤ）,Ｇ３Ｐ的表观Ｋｍ值分别为６３μｍｏｌ／Ｌ,２７２μｍｏｌ／Ｌ,１．５３ｍｍｏｌ／Ｌ,６．５２ｍｍｏｌ／Ｌ。该酶在保存过程中易失活。ＮＡＤＨ能降低酶失活的速度,而ＮＡＤ则不然。低浓度ＮａＣｌ对酶略有保护作用,但高浓度ＮａＣｌ加快酶的失活,且浓度越高效应越明显。     

抗癌胚抗原单链抗体基因在家蚕细胞和幼虫中的表达

将抗癌胚抗原（ＣＥＡ）单链抗体基因插入家蚕杆状病毒转移载体ｐＢａｃＰＡＫＨｉｓ, 与修饰的家蚕核型多角体病毒ＢｍＢａｃＰＡＫＤＮＡ共转染家蚕细胞, 经同源重组得到含有在多角体蛋白基因启动子控制下的抗ＣＥＡＳｃＦｖ 基因的重组病毒ＢｍＢａｃＳｃＦｖ。用重组病毒分别感染家蚕细胞和幼虫, 在两者中均得到了高效表达, 产物分子量为２８ｋＤ, 前者占细胞总蛋白的６ ％ , 后者为０ ．３ ｍｇ／ 蚕。目的基因在家蚕细胞和幼虫中表达产物经Ｎｉ２＋ＩＤＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ亲和柱纯化, 前者纯度可达９０％ 以上, 后者纯度较低; 纯化后的融合蛋白具有ＣＥＡ 结合活力, 其亲和常数分别为５ ．４×１０８／ｍｏｌ·Ｌ－ １ 和２．３ ×１０８／ｍｏｌ·Ｌ－１ , 略低于其亲本单抗Ｅ７Ｂ１０ ２．７ ×１０９／ｍｏｌ·Ｌ－ １ 。     

β—环糊精对苯丙氨酸解氨酶反应影响的研究

在含有较高浓度底物反式肉桂酸（ｔｒａｎｓ－ｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ,ＣＡ）和氨反应介质中,研究了β－环糊精（β－ＣＤ）对红醇母苯丙氨酸解氨酶（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ａｍｍｏｎｉａ－ｌｙａｓｅ,ＰＡＬ,ＥＣ４．３．１．５）催化反应的影响。加入适量β－ＣＤ可以克服高浓度ＣＡ对ＰＡＬ活性的抑制作用,显著增加产物Ｌ－苯丙氨酸（Ｌ－ｐｈｅ）的产量,β－ＣＤ最适用量随ＣＡ浓度升高而增加,其摩尔数量约为     

点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶在大肠杆菌中的高效表达

采用ＰＣＲ分段克隆法将点状产气单胞菌点状亚种（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｃｔａｔａ ｓｕｂｓｐ．ｊｐｕｃｔａｔａ）脯氨酰内肽酶（ｐｒｏｌｙｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ,ａｐＰＥＰ）的编码区基因分成３段扩增并拼接成编码６９０个氨基酸的完整基因ａｐＰＥＰ,将其克隆在表达载体ｐＢＬ和ｐＫＫＨ上,构建成温度和ＩＰＴＧ诱导型高效表达ａｐＰＥＰ的重组大肠杆菌ＢＬ２１／ｐＢＬ－ＰＥＰ和ＢＬ２１／ｐＫＫＨ－ＰＥＰ