CMP羟甲基化酶MilA中与甲基羟化过程相关的关键氨基酸定点突变分析

【目的】米多霉素生物合成起始反应的MilA蛋白可以使底物胞苷酸单磷酸(CMP)的胞嘧啶碱基C5位上形成羟甲基化,形成羟甲基化胞苷酸(HmCMP),MilA是迄今发现的首个能够高效利用CMP的羟甲基化酶。MilA属于脱氧胸苷酸合成酶(TS)和脱氧胞苷酸羟甲基化酶(CH)蛋白超家族,通过三维结构预测发现它们的三维结构非常相似,CH94上的丝氨酸曾被证明与胞嘧啶上甲基变成羟甲基过程有关,MilA102上对应的氨基酸为苏氨酸,TS91上对应的氨基酸为脯氨酸。因此,突变MilA上第102位的苏氨酸,考察该氨基酸对CMP和脱氧胞苷酸(dCMP)羟甲基化反应的影响。【方法】通过定点突变技术,将MilA第102位的保守氨基酸苏氨酸(Threonine,T)分别点突变成缬氨酸(Valine,V)和亮氨酸(Leucine,L)。【结果】体外酶活实验结果显示,相对于MilA,MilA T102V对于CMP的催化活性下降87.1%,对于dCMP的催化活性没有影响;而MilA T102L均丧失了对于两种底物的活性。【结论】这表明Thr102对于MilA催化底物CMP形成HmCMP至关重要;同时,失去活性的仅比缬氨酸和野生型苏氨酸的链长多出了一个碳原子,暗示其在与底物结合时形成了一定的空间位阻效应。Thr在102位点的功能经过自然进化的微调有可能已经达到最优化。     

玉米尿卟啉原Ⅲ脱羧酶同功酶生物信息学分析、基因克隆和原核表达

尿卟啉原Ⅲ脱羧酶是生物卟啉类化合物分支合成的关键酶。从GenBank中搜寻到4种玉米尿卟啉原Ⅲ脱羧酶:Les22、UROD1、UROD2和截短UROD,氨基酸序列比对显示N端的同源性较差;玉米les22基因比urod1基因在开放阅读框的上游少3个碱基,导致阅读框移码。植物除玉米外存在高度同源的UROD1和UROD2,具有结构完整性。本文以玉米幼叶总RNA为模板,通过RT-PCR克隆了玉米les22和urod2基因,并对突变位点进行校正,同时通过定点突变获得urod1基因,它们都编码去除叶绿体导肽的尿卟啉原Ⅲ脱羧酶。再分别将les22、urod2和urod1基因插入大肠杆菌的不同表达载体,转化表达菌株BL21(DE3),16℃诱导表达18h,SDS-PAGE分析显示,Les22的N端含有组氨酸标签或SUMO蛋白,重组蛋白表达为包涵体,UROD2的N端含有组氨酸标签或SUMO、TRX、GST或MBP蛋白,未检测到目的蛋白在上清液的特异表达,而UROD1和MBP融合为可溶性表达,表明玉米UROD的N端氨基酸残基可能参与蛋白在大肠杆菌的折叠。这为研究玉米UROD的种类和功能奠定基础。     

玉米叶绿体ATP合成酶ε亚基的定点突变

利用突变引物和ＰＣＲ方法对玉米叶绿体ＡＴＰ合成酶的ε在进行定点突变,使ε亚基４２位上的Ｔｈｒ分别替换成Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ和Ｐｒｏ。Ｔｈｒ变为Ｐｒｏ的ε亚基突变体不能表达,其他突变体与野生型一样,都能正常表达。Ｔｈｒ突变为Ｃｙｓ和Ａｒｇ后,突变体对ＡＴＰａｓｅ活力的抑制比野生型略高一些,但突变为Ｉｌｅ后,其抑制程度则极大地增强了。     

荚膜红细菌尿卟啉原Ⅲ转甲基酶的纯化及其酶学性质

S-腺苷-_L-甲硫氨酸依赖型尿卟啉原Ⅲ转甲基酶(S-adenosy-_L-methionine uroprophyrinogenⅢmethyltransferase,SUMT)催化尿卟啉原Ⅲ(UroprophyrinogenⅢ,urogenⅢ)的中心碳原子C-2和C-7位上甲基化生成前咕啉-2,是维生素B12生物合成途径中的一步关键酶,但大部分SUMT受其底物urogenⅢ和副产物S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosy-_L-homocysteine,SAH)的抑制作用。为了挖掘能耐受高浓度urogenⅢ的转甲基酶,文中从荚膜红细菌Rhodobacter capsulatus SB1003中克隆2个SUMT基因(RCcobA1,RCcobA2),经表达与纯化后,检测发现RCcobA1和RCcobA2的酶活分别为27.3 U/mg和68.9 U/mg,后者比VB_(12)工业生产菌株脱氮假单胞菌Pseudomonas denitrificans中内源的SUMT(PDcob A,27.9 U/mg)高2.4倍,并且当urogenⅢ浓度高达70μmol/L时都几乎不受抑制作用。因此,RCcobA2的发现可以为解除VB_(12)合成途径的瓶颈以及提高VB_(12)产量提供理论支持和方向指导。     

表达大肠杆菌谷氨酸-1-半醛氨基转移酶对红色荧光报告蛋白尿卟啉原Ⅲ甲基化酶的影响

谷氨酸-1-半醛氨基转移酶(Glutamate-1-semiadhyde aminotransferase,GSAT)是尿卟啉原Ⅲ生物合成上游途径的一个酶,尿卟啉原Ⅲ是红色荧光报告蛋白尿卟啉原Ⅲ甲基化酶(Uroporphyrinogen Ⅲ methyltransferase,UPMT)的底物。为了探明大肠杆菌共表达GSAT对UPMT荧光强度的影响,通过PCR扩增玉米upmt基因,将其插入pETDuet-1质粒中第2个顺反子中,构建的载体命名为pETU,表达UPMT的N端含有组氨酸标签;通过PCR扩增大肠杆菌编码GSAT的hemL基因,定点突变去除hemL基因中NcoⅠ序列,亚克隆至pET-51b质粒,再将获得的hemL基因插入pETU质粒的第一个顺反子中,构建pETeGU载体。表达GSAT的N端含有Strep标签。和单独表达upmt基因相比,表达2个基因后,蛋白印迹分析表明没有明显改变UPMT表达量,光谱扫描分析显示没有改变荧光物质的组成,但是增强了重组细胞的红色荧光物质三甲基咕啉的含量,该物质在354nm有特异吸收。用2mmol/L的GSAT抑制剂3-氨基-2,3二羟基苯甲酸处理后,表达两种酶的菌落荧光消失,表明重组GSAT可能增加内源尿卟啉原Ⅲ水平,从而增强重组UPMT催化产生的红色荧光。     

不同来源的尿卟啉原Ⅲ转甲基酶在脱氮假单胞菌中的表达及其对生产维生素B_(12)的影响

S-腺苷-L-甲硫氨酸依赖型尿卟啉原Ⅲ转甲基酶(S-adenosy-L-methionine uroprophyrinogen Ⅲ methyltransferase,SUMT)催化尿卟啉原Ⅲ(uroprophyrinogen Ⅲ,urogen Ⅲ)中心碳原子C-2和C-7甲基化生成前咕啉-2,是维生素B_(12)生物合成途径中的一步关键酶。本文分别克隆了荚膜红细菌来源的RCcob A1,RCcob A2和脱氮假单胞菌来源的PDcob A,并在VB_(12)生产菌株脱氮假单胞菌中过表达和发酵。通过对三株重组菌维生素B_(12)发酵结果分析可知,SUMT(PDcob A),SUMT1(RCcob A1)和SUMT2(RCcob A2)的表达有利于维生素B_(12)产量的提高,与对照菌株相比分别提高了16.48%,10.2%和31.86%。根据摇瓶发酵的结果在5 L发酵罐上进行了放大实验,p BBR122-PblaRCcob A2的产量为144.5 mg/L,相比对照菌p BBR122-Pbla(111.3 mg/L)产量提高了29.83%左右。结论:SUMT的表达可以在一定程度上解除维生素B_(12)合成途径中的瓶颈,提高维生素B_(12)产量。     

对生玉米幼叶尿卟啉原脱羧酶的纯化及部分性质研究

尿卟啉原Ⅲ脱羧酶是植物血红素和叶绿素合成的一个关键调控酶。对生玉米叶片中叶绿素含量较比互生玉米高。对生玉米幼苗经硫酸铵分级沉淀,DEAE Sepharose CL-6B、Sephacryl S-200、羟基磷灰石和B lueSepharose CL-6B层析,纯化了尿卟啉原脱羧酶。纯化倍数为1 060倍,得率约8%,比活约880 U/mg蛋白。纯化的UROD在SDS/PAGE显示一条带,亚基分子量约为40 kD,Sephacryl S-300测得全酶分子量约为55 kD。IEF-PAGE显示UROD为一条带,等电点约为6.0,酶的最适pH值约7.0,在55℃下保温12 m in,酶活力丧失90%,在100 mm ol/L的巯基乙醇下,UROD的酶活力提高7倍。体外5 mm ol/L的磷酸吡哆醛修饰显示UROD活力下降约30%。     

NisinZ的定点突变及突变体性质的研究

以本实验室构建的含nisZ基因的质粒pHJ201为模板,采用定点突变技术将乳链菌肽Z分子中B环第8位Thr突变为Ser（T8S）、将第2位Dhb突变为Dha和第31位His突变为Lys（T2S/H31K）以及将第27位Asn突变为Lys和第31位His突变为Lys（N27K/H31K）,以pMG36e为载体,电击转化乳酸乳球菌（L.lactis）NZ9800进行表达。对表达产物性质的研究结果表明,3个突变体的抑菌谱和溶解度未发生变化,其抑菌活性略有下降,但它们的稳定性表现各不相同：N27K/H31K的稳定性与NisinZ几乎一致,而T8S和T2S/H31K的稳定性有明显提高,在pH9条件下100℃加热5min仍不丧失抑菌活性。     

NisinZ的定点突变及突变体性质的研究

以本实验室构建的含nisZ基因的质粒pHJ2 0 1为模板 ,采用定点突变技术将乳链菌肽Z分子中B环第 8位Thr突变为Ser(T8S)、将第 2位Dhb突变为Dha和第 31位His突变为Lys(T2S H31K)以及将第 2 7位Asn突变为Lys和第 31位His突变为Lys(N2 7K H31K) ,以pMG36e为载体 ,电击转化乳酸乳球菌 (L .lactis)NZ980 0进行表达。对表达产物性质的研究结果表明 ,3个突变体的抑菌谱和溶解度未发生变化 ,其抑菌活性略有下降 ,但它们的稳定性表现各不相同 :N2 7K H31K的稳定性与NisinZ几乎一致 ,而T8S和T2S H31K的稳定性有明显提高 ,在pH9条件下10 0℃加热 5min仍不丧失抑菌活性。     

定点突变改善PvEH1对邻甲基苯基缩水甘油醚的催化特性

环氧化物水解酶能够对外消旋环氧化物进行动力学拆分保留单构型的环氧化物。测定了菜豆环氧化物水解酶(Pv EH1)针对苯基缩水甘油醚及其甲基衍生物的催化特性,并基于分子对接及多序列比对分析确定7个突变位点,通过单点和组合突变对Pv EH1进行改造,以期改善Pv EH1对邻甲基苯基缩水甘油醚(1a)的催化特性。底物谱分析表明Pv EH1对1a的催化活性(157.2U/g湿细胞)和对映选择性(E=5.6)最高。单点突变结果显示E.coli/pveh1~(L105I)和E.coli/pveh1~(V106I)对1a的催化活性和对映选择性均有明显提高;L105I和V106I位组合突变菌株E.coli/pveh1~(L105I/V106I)的催化活性(493.8U/g湿细胞)是E.coli/pveh1的3.1倍,对映选择性(E=8.3)也提高至E.coli/pveh1的1.5倍。纯化后Pv EH1~(L105I/V106I)的催化活性为17.6U/mg,是Pv EH1的1.5倍,对1a的催化效率提高至Pv EH1的2.1倍。SDS-PAGE分析表明提高了蛋白质的可溶性表达量。利用E.coli/pveh1~(L105I/V106I)全细胞催化100mmol/L 1a水解动力学拆分获得手性纯(R)-1a(ee96%)的产率和时空产率分别为31.2%和5.12g/(L·h),因此,在手性纯(R)-1a的制备中,E.coli/pveh1~(L105I/V106I)是一种颇具潜力的生物催化剂。     

基于定点突变的植物Ⅲ型聚酮合酶结构与功能研究进展

植物Ⅲ型聚酮合酶(Polyketide synthases,PKSs)催化形成一系列结构迥异、生理活性不同的聚酮类化合物的基本骨架结构,是聚酮类化合物生物合成途径的关键酶。目前已从植物中克隆和鉴定了多种功能不同的Ⅲ型PKSs。定点突变技术是研究蛋白质结构与功能之间复杂关系的重要方法。文中综述了近年来基于定点突变的植物Ⅲ型PKSs结构与功能关系的研究进展,包括利用定点突变技术修饰各种可能影响植物Ⅲ型PKSs结构的氨基酸残基,来研究其对功能的影响(如控制起始底物的特异性、缩合反应次数以及中间产物环化方式),以期为植物Ⅲ型PKSs结构与功能关系的研究提供参考。     

绿色木霉葡聚糖内切酶EGⅢ基因在大肠杆菌中的表达、定点突变及其动力学特性的研究

将绿色木霉葡聚糖内切酶EGⅢ基因亚克隆到表达载体pET-22b（＋）,构建重组质粒pET-egl3,转化到大肠杆菌BL21（DE3）。利用金属亲和层析对重组EGⅢ进行纯化,纯化后酶比活力达到6u／mg蛋白,最适反应温度为60℃,最适pH为4．0。同时对EGⅢ催化区的氨基酸残基R130和E218进行定点饱和突变,各筛选到一株酶活有提高的突变子R130P和E218F,其比活力为野生型EGⅢ的2．8倍和3．45倍。突变酶E218F的Km提高了一倍,催化效率Kcat提高了5．4倍;而R130P的Km和Kcat没有明显变化。两个突变酶的最适酶解温度和pH分别都提高至65℃和4．4。     

氨基酸定点突变提高灵芝蛋白LZ-8热稳定性的研究

通过氨基酸定点突变技术提高灵芝免疫调节蛋白LZ-8的热稳定性。通过分子动力学模拟结合温度因子预测对LZ-8氨基酸突变位点进行理性设计,在毕赤酵母X33菌株内构建并表达LZ-8突变体蛋白,采用HeLa细胞生长抑制实验和差示量热扫描分析检测并比较了LZ-8突变前后生物学活性及热力学参数。结果显示,LZ-8 N-端α螺旋为理论预测的温度敏感区域,在该区域进行F8W和R9K氨基酸双位点突变,突变后的LZ-8热稳定性提高,相变温度Tm上升0.92℃,相转变焓值ΔH提高23.14 kJ/mol,但突变后LZ-8生物学活性基本不变,LZ-8和LZ-8突变体对HeLa细胞生长抑制的IC50值分别是2.238μg/mL和2.407μg/mL。通过理性设计氨基酸突变位点,获得了稳定性提高但生物学活性不变的灵芝免疫调节蛋白LZ-8的突变体。     

定点突变三种方法的比较研究

目的：通过使用优化后的定点突变三种方法分别对一个新基因重组载体进行定点突变研究,比较这几种定点突变方法的优缺点。方法：重叠延伸PCR法使用Stratagene在线定点突变引物设计程序从而使引物设计简化而可靠;MutaBEST定点突变试剂盒采用胶纯化试剂盒代替说明书推荐的酚-氯仿抽提质粒的方法以提高回收率;使用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶和超级感受态试剂盒代替Quikchange定点突变试剂盒的相应组分可使产物不受影响同时降低试验费用。结果：三种方法都能够获得单碱基突变重组载体。结论：QuikChange突变策略通过改进是一种高效、简洁、经济和可靠的定点突变方法。     

偶氮还原酶AZR的结构及其K109的定点突变研究

利用同源建模构建了Rhodobacter sphaeroides的偶氮还原酶AZR的三级结构模型, AZR为一种a/b型结构的黄素氧化还原蛋白。两类依赖黄素的偶氮还原酶的三级结构对比表明它们具有高度的相似性。在序列和结构对齐分析的基础上, 选择保守位点K109进行K109A和K109H的定点突变研究。突变后K109H的最适pH=6, 而K109A的最适pH=9。突变未改变AZR的最适温度(30℃)。第109位正电荷残基对甲基红的结合有重要影响; 而K109H对NADPH的结合并非保守突变。K109可能只参与对NADPH的2’-磷酸基团的结合, 而对NADH的结合无影响。     

调宁蛋白T184的定点突变、表达、纯化和鉴定

为增强调宁蛋白对平滑肌收缩的抑制作用,用PCR重叠延长法使调宁蛋白基因中编码第184位苏氨酸的ACT突变为编码丙氨酸的GCC,将此PCR的突变产物装入到质粒载体pAED₄后,转化至E.coli BL₂₁(DE₃)中, 构建的重组转化子用酶切和测序鉴定.诱导含有重组转化子的E.coli获得高效表达,经SDS-PAGE和蛋白质印迹鉴定后,采用反复冻融法及葡聚糖凝胶层析柱分离,初步纯化出调宁蛋白突变体T184A.     

PCR技术对人IL-3 cDNA进行定点突变的研究

本文利用PCR技术对人IL-3cDNA体外进行定点突变,将人IL-3cDNA第3位Met,第116位Lys密码子突变为Val密码子GTT。PCR扩增片段核苷酸序列与引物设计相应的cDNA突变体序列完全一致。结果证实此方法比经典寡聚核苷酸方法简单、迅速、成本低、效率高,也为基因的修饰,蛋白质工程研究提供了简便、稳定的方法。     

一种新型的基因定点突变方法及其在DdsA突变研究中的应用

为了发展基因突变技术,介绍一种新型的基因定点突变方法.该方法巧妙利用了基因序列中广泛存在的不完整的平端酶切位点.与传统方法相比,可以迅速地在全基因的任何部位替换核苷酸,并可以在突变实验过程中直接将目的基因克隆到T载体上,便于测序及进一步克隆.利用该方法成功地获得了DdsA（decaprenyl diphosphate synthase,十聚异戊二烯焦磷酸合成酶）在4个氨基酸位点上的19个变体酶.这些位点分布在基因的不同区域内.证明这种新方法的高效性.     

藻蓝蛋白和藻红蓝蛋白β亚基半胱氨酸的定点突变及体外重组研究

为研究藻蓝蛋白 (PC)和藻红蓝蛋白 (PEC) β亚基 (分别简称为 β PC、β PEC)生物合成、结构与功能的关系 ,用MegaprimerPCR定点突变技术设计 β PC、β PEC中与藻蓝胆素连接的第二个半胱氨酸的定点突变蛋白质 β PC(C15 5I)和 β PEC(C15 5I)。将相应的基因片段亚克隆于表达载体pET 30a,并转化大肠杆菌BL2l(DE3)。经IPTG诱导后 ,β PC(C15 5I)和 β PEC(C15 5I)在大肠杆菌中均得到了高效表达。β PC(C15 5I)和 β PEC(C15 5I)与藻蓝胆素的重组结果表明两个突变体的结构基本没发生改变 ,有利于对 β PC和 β PEC的生物合成进行进一步研究。     

地高辛标记探针检测重组定点突变巴曲酶蛋白宿主DNA残留量的研究

目的 建立检测重组定点突变巴曲酶原液中外源性DNA残留量的方法.方法 从重组定点突变巴曲酶酵母工程菌提取基因组DNA作为模板,制备地高辛标记探针.此探针与样品进行点样杂交,并进行显色反应.结果 3批重组定点突变巴曲酶原液中,每人份剂量的宿主DNA残留量均＜10 ng.结论 该方法检测灵敏度较好,特异性较强,可用于重组定点突变巴曲酶的检测.